Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

miRNA Expression Analyser i Prostata Cancer Kliniske Væv

Published: September 8, 2015 doi: 10.3791/53123
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Urology, Veterans Affairs Medical Center, San Francisco, University of California San Francisco

Abstract

En kritisk udfordring i prostatacancer (PSA) klinisk ledelse udgøres af den utilstrækkelige i øjeblikket anvendes biomarkører for sygdomme screening, diagnose, prognose og behandling. I de senere år har microRNA (miRNA) vist sig at være lovende alternative biomarkører for prostatakræft diagnose og prognose. Men udviklingen af ​​miRNA som effektive biomarkører for prostatakræft er stærkt afhængig af deres nøjagtig påvisning i kliniske væv. miRNA analyser i prostatakræft kliniske prøver er ofte en udfordring på grund af tumor heterogenitet, stikprøvefejl, stromale forurening mv Målet med denne artikel er at beskrive en forenklet arbejdsgang for miRNA analyser arkiveret FFPE eller friske frosne prostatakræft kliniske prøver ved hjælp af en kombination af kvantitativ realtids-PCR (RT-PCR) og in situ-hybridisering (ISH). Inden for denne arbejdsproces, vi optimerer de eksisterende metoder til miRNA ekstraktion fra FFPE og frosne prostata tissues og ekspression analyser af Taqman-probe baseret miRNA RT-PCR. Desuden beskriver vi en optimeret fremgangsmåde til ISH analyser formiRNA detektion i prostatavæv under anvendelse låst nukleinsyre (LNA) - baserede prober. Vores optimerede miRNA ISH protokol kan anvendes til prostatakræft væv dias eller prostatakræft væv microarrays (TMA).

Introduction

Kræft i prostata er en almindeligt diagnosticeret mandlig malignitet, som er en af ​​de førende årsager til kræft dødelighed blandt mænd. I USA, en anslået 220,800 nye tilfælde og 27,540 dødsfald vil blive rapporteret i 2015 1.

Prostatakræft er en heterogen sygdom med meget varierende sygdom kursus tumorer kan være ugidelig eller meget aggressiv. En kritisk udfordring i prostatakræft klinisk ledelse udgøres af den utilstrækkelige i øjeblikket anvendes metoder / biomarkører for sygdomme screening, diagnose, prognose og behandling 2. Aktuelle screeningsmetoder omfatter prostataspecifikt antigen (PSA) test og en digital rektal undersøgelse (DRE) efterfulgt af prostata biopsier 3. Prostataspecifikt antigen (PSA) er den mest udbredte prostatacancer biomarkør, der væsentligt revolutioneret kliniske behandling og forbedrede overlevelsesrater 4. Men på grund af iboende begrænsninger af PSA herunder lack af specificitet, PSA-baserede screening har ført til over diagnose og over behandling af sygdommen. I lyset af dette, er intensiv indsats er rettet mod en søgning efter alternative prostatakræft biomarkører, især dem, der kan forudsige aggressivitet af sygdommen og køre bedre beslutninger behandling 4,5. I løbet af de sidste par år, har microRNA (miRNA) dukket op som lovende alternative prostatakræft biomarkører.

MikroRNA'er (miRNA) udgør en evolutionært bevaret klasse af små ikke-kodende RNA, der undertrykker genekspression post-transkriptionelt via sekvensspecifikke interaktioner med 3'- utranslaterede regioner (UTR'er) af beslægtede mRNA mål. Det anslås, at> 60% af mRNA'er er bevaret mål for miRNA 6. miRNA gener er placeret i intergeniske regioner eller inden for introns eller exoner af protein / ikke-protein kodende gener 7. Disse gener er fortrinsvis transskriberes med RNA-polymerase II i primary miRNA (PRI-miRNA, flere kilobaser lang), som danner hårnål formet stilk loop sekundære strukturer. Disse pri-miRNA forarbejdes til precursor miRNA (præ-miRNA, 60-75 nukleotid lang), der eksporteres til cytoplasmaet og yderligere forarbejdede til modne miRNA (18-25 nukleotid lange) 8-10. miRNA regulerer vigtige cellulære processer, herunder proliferation, udvikling, differentiering og apoptose 11. Undersøgelser tyder på en udbredt dysregulering af miRNA udtryk profiler i forskellige menneskelige maligniteter, herunder prostatakræft 12-15. miRNA ekspressionsprofiler er blevet rapporteret til at være almindeligt dysreguleret i primær og metastatisk prostatacancer. Altered miRNA udtryk har været forbundet med prostatakræft progression, aggressivitet og gentagelse fremhæve den prognostiske potentiale miRNA 12,14,16-19. En voksende mængde beviser tyder på, at miRNA spiller vigtige mekanistiske roller i prostatakræft initiering, udvikling, fremskridtion og metastase. Samlet set er miRNA fremstår som lovende alternative biomarkører for prostatakræft diagnose og prognose, der kan skelne mellem normale og cancer væv og støtte lagdeling af prostata tumorer 12. Også miRNA er vigtige mål for udvikling af effektive lægemidler mod prostatakræft 20.

På grund af deres lille størrelse og modstandsdygtighed over for endogen RNase-aktivitet, miRNA er stabile biomarkører, som let kan påvises i formalin-fikserede væv 21 og prostata biopsier 22. Desuden har udtrykket profiler af miRNA blevet sammenlignet i frosne og formalinfikserede væv og har vist sig at være stærkt korreleret 21. Dog er miRNA udtryk profilering i prostatakræft kliniske væv ofte udfordrende på grund af tumor heterogenitet, stikprøvefejl, stromale forurening mv Udviklingen af ​​miRNA som effektive biomarkører for prostatakræft stærkt relies på deres nøjagtig påvisning i kliniske væv. Her beskriver vi en forenklet arbejdsgang bruges i vores laboratorium for miRNA-ekspression profilering i arkiveret FFPE eller friske frosne prostatakræft kliniske prøver. Vi beskæftiger en kombination af kvantitativ real-time PCR og in situ hybridisering til miRNA analyser af kliniske prøver, med den tidligere giver flere kvantitative oplysninger og sidstnævnte til at visualisere forskellen udtryk for potentielle miRNA-biomarkører i en vifte af væv. Inden for denne arbejdsproces, vi optimerer de eksisterende metoder til miRNA ekstraktion fra FFPE og frosne prostata væv, udtryk analyser af Taqman-sonde baserede miRNA RT-PCR og miRNA in situ hybridisering teknik ved hjælp låst nukleinsyre (LNA) -baseret sonder 23. LNA-baserede sonder tilbyder øget sensitivitet og specificitet i forhold til DNA- eller RNA- baserede sonder og muliggør robust detektion af alle miRNA-sekvenser, uanset deres indhold GC og også tillade diskriminationtion af miRNA familier. Vores optimerede miRNA ISH protokol kan anvendes til prostatakræft væv dias eller prostatakræft væv microarrays (TMA), idet sidstnævnte giver mulighed for hurtigere at miRNA biomarkører.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Formalin-fikseret, paraffin-indstøbt (FFPE) eller friske frosne prostata cancer prøver blev opnået fra SFVAMC. Prøverne var fra prostatakræft patienter, som gennemgik radikal prostatektomi ved SFVAMC. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, og undersøgelsen blev godkendt af UCSF udvalg for menneskelige forskningspotentiale. Alternativt blev prostatakræft væv microarrays indkøbt fra kommercielle kilder og anvendes til miRNA-analyser ved ISH. Klinisk-patologisk og følge op information til analyserede prostata cancer patienter blev indsamlet.

1. vævsprøver

  1. Skær prostatakræft vævsprøver i 10 um snit ved hjælp af en mikrotom og pletten med H & E ved at følge fabrikantens protokol.
  2. Gennemgå farvede dias for identifikation af prostatakræft foci samt tilstødende normale kirtelepitel.
    Bemærk: En bord certificeret patolog bør gennemgå H & E farvede dias og mark for tumor og normale områder. Brug de markerede dias som guider i de efterfølgende afsnit for miRNA analyser fra tumor vs normale områder.

2. miRNA Expression Analyser ved kvantitativ real-time PCR

Bemærk: Denne arbejdsproces indebærer følgende trin: Laser Capture mikrodissektions, isolation af total RNA (herunder miRNA og mRNA), analyseprocedurerne af modne miRNA ved hjælp af TaqMan MicroRNA ekspressionsassays som beskrevet i de følgende afsnit.

  1. RNA-ekstraktion
    1. Isolering af miRNA af prostatakræft FFPE væv
      1. Laser capture mikrodissektion (LCM)
        Bemærk: Udfør trin 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 i et stinkskab.
        1. Forbered væv slides (10 um sektioner) til LCM. Deparrafinize vævssnit ved opblødning i xylen (2x), i 10 minutter hver, derefter rehydrere vævene ved at inkubere objektglassene i 5 minutter hver i gradueret ethanol (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) efterfulgt af destilleret vand(5 min).
        2. Efter rehydrering, bejdse sektioner med hematoxylin i 30 sekunder efterfulgt af vand.
        3. Sted væv i gradueret ethanol (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (5 minutter hver) og xylen (5 min).
        4. Tørre dias i et stinkskab og derefter placere i LCM instrument til mikrodissektion.
        5. Udfør microdissections med LCM system i overensstemmelse med producentens anvisninger 24. Brug patolog markeret dias som guider til identifikation af prostatakræft foci samt tilstødende normale væv. Brug laserstrålen ved en 10-20 pulser um diameter med en effekt på 70-90 MW.
        6. Capture interesseområder med infrarøde laser pulser på LCM hætter. Kombiner celler fra 2-5 hætter til miRNA udvinding per prøve. For at sikre integriteten af ​​ekstraheret RNA, straks behandle tilfangetagne celler for miRNA udvinding.
        7. Alternativt lyserer celler i miRNA ekstraktionsbuffer (ifølge producentens protokol) og store lysater ved -80 ºC.
      2. miRNA Udvinding og Analyser fra LCM Mikrodissekterede Væv
        1. Uddrag totalt RNA fra Mikrodissekterede FFPE væv under anvendelse af et kommercielt kit i overensstemmelse med producentens anvisninger.
          Bemærk: Udbyttet af RNA fra laser capture miscrodissection er typisk lav. Derfor er RNA elueres i små mængder (20-30 pi) og anvendes til ekspression profilering ved hjælp Taqman microRNA ekspressionsassays efter producentens anvisninger (også beskrevet i afsnit 2.2). Optimering af input RNA til realtids-PCR påvisning af modne miRNA tyder på, at 5 pi det eluerede RNA er optimal for hver miRNA-specifikke revers transkription reaktion. Som en endogen kontrol, er RNU48 / RNU24 anvendes. For kontrolreaktioner, er 2 pi det eluerede RNA anvendes til revers transkription-reaktionen.
    2. Isolering af miRNA af prostatakræft Frosne Væv
      1. Homogenize frosne resektion prostatavæv ved formaling af væv i flydende nitrogen under anvendelse af en morter og støder. Overfør homogeniseret væv til et mikrocentrifugerør ved anvendelse af en afkølet spatel. Opretholde mørtel / pistil og spatel ved den samme temperatur ved dypning i flydende nitrogen så homogeniseret væv kan let overføres.
      2. Tilføj kommercielle guanidinisothiocyanat-phenol-reagens (1 ml / 0,1 g væv) til den homogeniserede væv og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
        Bemærk: Homogeniserede væv i kommercielle guanidinisothiocyanat-phenol reagens kan opbevares ved -80 ° C i flere måneder.
      3. Føj chloroform til homogenatet (0,2 ml chloroform / ml) og rystes kraftigt i 30 sek. Inkuber prøver ved stuetemperatur i 3-5 minutter efterfulgt af centrifugering ved 10.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C.
      4. Den øvre vandige fase overføres til en frisk steril RNase-fri 1,5 ml rør.
      5. Tilføj et lige så stort volumen isopropylalkohol. Blandes og inkuberes i 10 min ved stuetemperatur efterfulgt af centrifugering ved 12.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C til pelletering RNA.
      6. Aspirer supernatanten og vask RNA-pelleten med 1 ml 70% ethanol. Der centrifugeres ved 12.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
      7. Aspirere forsigtigt supernatanten. Tørre RNA pellets ved stuetemperatur i 5-10 min. Opløs RNA i 50-100 pi nuclease-frit vand.
      8. Udfør kvantificering af RNA ved hjælp af en NanoDrop spektrofotometer og bestemme RNA integritet med en Bioanalyzer. Juster RNA koncentrationer til 10 ng / pl. Brug 10-50 ng RNA til miRNA- specifik cDNA reaktion efterfulgt af realtids-PCR-analyser (afsnit 2.2).
  2. Kvantitativ real-time PCR for miRNA Expression Analyser
    Bemærk: Assay modne miRNA ved hjælp af en totrins-RT-PCR-protokol som beskrevet nedenfor.
    1. Revers transskription (RT)
      1. Reverse transskribere cDNA fra RNA under anvendelse af en miRNA revers transkription kit i overensstemmelse med producentens anvisninger.Brug 10-50 ng total RNA med miRNA specifik primer fra MicroRNA assays og RT kit. Brug RNU48 / RNU24 / RNU6B som kontroller. Fortynd cDNA 1: 5 til 1:10 (afhængigt af den overflod af den analyserede miRNA), og brug i Real-time PCR påvisning som beskrevet i det følgende trin.
    2. Realtids-PCR til påvisning af Ældre miRNA
      1. Amplificere PCR-produkter fra cDNA prøver ved hjælp af miRNA tests med et Fast Universal mastermix i overensstemmelse med producentens anvisninger. Normalisere prøver til RNU48 / RNU24 / RNU6B kontrol. Brug den sammenlignende Ct (tærskel cyklus) metode til beregning af de relative ændringer i genekspression på Fast Real Time PCR System. Analyser hver prøve i tre eksemplarer.

3. miRNA Expression Analyser ved in situ hybridisering (ish)

  1. Forbehandling af væv
    1. Skær 5 um sektioner fra FFPE prostatakræft væv blokke ved hjælp af en mikrotom.
      2. Bemærk: Slides kan opbevares ved stuetemperatur i flere uger for miRNA.
    2. Deparrafinize vævene ved opblødning objektglassene med xylen (2x), i 15 minutter hver.
    3. Rehydrere vævene ved at inkubere objektglassene i 5 minutter hver i gradueret ethanol (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%) efterfulgt af destilleret vand (5 min).
    4. Fastgør objektglassene med 4% paraformaldehyd i PBS ved stuetemperatur i 20 minutter.
    5. Vaskes objektglassene med PBS (2x) ved stuetemperatur i 5 minutter hver.
    6. Behandl dias med 10 ug / ml proteinase K ved 37 ºC i 10 minutter i forvarmet proteinase K-buffer (5 mM Tris-HCL pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCI).
    7. Efter proteinase-K behandling, skylles dias med 0,2% glycin i PBS i 30 sek.
    8. Vask slides i PBS (1x) ved stuetemperatur i 5 min.
    9. Fastgør dias med 4% Paraformaldehyd i PBS i 15 min.
    10. Skyl lysbilleder medPBS i 5 minutter.
  2. Hybridisering
    1. Pre-hybridisere dias med præ-hybridisering løsning til 3-4 timer ved 55 ºC i et fugtigt kammer. Brug væv lab klude gennemvædet i 50% formamid / 50% 5x SSC at holde kammeret befugtet.
    2. Brug 5 'digoxigenin mærkede prober i en koncentration på 20-50 nM i hybridiseringsbuffer. Fortynd miRNA-specifik probe (20-50 nM) og små nukleare RNA U6 kontrol sonde (20 nM), varme ved 90 ºC i 4 min, læg den på is, og tilføje til ice kold hybridiseringsbuffer (2-4 ng / ul ).
    3. Fjern pre-hybridiseringsopløsningen, tilsættes hybridiseringsopløsning (probe + hybridiseringspuffer, 100 pi per slide), inkuberes i 12-16 timer ved probe-specifik hybridisering temperatur (Hybridisering temperatur = Tm probe-21 ºC). Udfør hybridiseringer i et fugtigt kammer (50% formamid / 50% 5x SSC).
  3. Vasketrin
    1. Vaskes objektglassene med 2 x SSC i 10 minutter ved 45 ° C.
    2. Vask than glider med 1,5 x SSC i 10 minutter ved 45 ° C.
    3. Vask dias med 0,2 x SSC (2x) ved 37 ºC i 20 minutter hver.
    4. Inkuber slides med 1x blokeringsopløsning i 1-2 timer ved stuetemperatur
  4. Detektion
    1. Glassene inkuberes med 1: 100 PBS fortyndet AP-konjugeret anti-digoxigenin antistof til 1-4 timer eller natten over ved 4 ºC.
    2. Vaskes objektglassene med PBS (3x) ved stuetemperatur i 10 minutter hver.
    3. Vaskes objektglassene (2x) med alkalisk phosphatase-buffer (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20) ved stuetemperatur i 5 minutter hver.
    4. Glassene inkuberes i BM Purple AP-substrat i mørke ved stuetemperatur i 1-20 timer.
    5. Glassene skylles med PBS indeholdende 0,1% Tween-20 og vask (2x) i vand.
    6. Monter dias anvendelse af en vandig montering medier, og undersøge under et mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Udtryk profilering af miR-203 i LCM primære prostatakræft kliniske prøver med RT-PCR-analyser (Figur 1)

RT-PCR-analyser af den relative miR-203-ekspression i LCM primære prostata cancer væv og den matchende tilstødende normale områder blev udført som beskrevet i Saini et al. 15 RNU48 blev anvendt som kontrol. Tabellen nedenfor opsummerer den relative miR-203-ekspression i prostatakræft tumorvæv i forhold til tilstødende normale væv.

Sammenligning af MIR-383-ekspression med RT-PCR-analyser i mikrodissekeret vs laser capture mikrodissekeres PCA væv (figur 2)

Prostatakræft væv blev enten mikrodissekeres under mikroskop eller blev udsat for LCM efterfulgt af RT-PCR-analyser af MIR-383 ekspression i tumorvæv i forhold til matchede tilstødende normale tissues.Relative miR-383-ekspression i tumorprøverer shown.RNU48 blev anvendt som kontrol. Som vist i figur 2, blev der observeret forskelle, når miRNA ekspression blev analyseret i disse væv. LCM har en fordel i forhold til mikrodissektion under mikroskop, da den tillader isolering af et relativt ren population af prostatavæv og er mere pålidelig.

ISH analyser af MIR-203-ekspression i prostatakræft kliniske væv (figur 3)

In situ-hybridisering analyser af MIR-203-ekspression i normale og knogle metastatisk prostatacancer væv blev udført som beskrevet i Saini et al. 15 Prostatacancer væv microarray blev anvendt til ISH analyser under anvendelse af 5'-DIG-mærket LNA prober specifikke for MIR-203 og U6. Repræsentativt eksempel på ISH analyser er vist i figur 3, et tal delvist reproduceret fra Saini et al. (2011) 15 Figur 3A og 3B showsmiR-203 expression (venstre) og U6 kontrol udtryk (til højre) i de angivne væv. ISH signaler blev semikvantitativt gradueret baseret på intensiteten af ​​farvning og procent af farvede celler og tildeles en score på 1 til 4. Intensiteten snesevis af MIR-203-ekspression blev delt af dem med U6 ekspression til opnåelse af normaliserede MIR-203 ekspressionsniveauer, der blev afbildet i figur 3C.

Figur 1
Figur 1: Expression profilering af miR-203 i LCM primære prostatakræft kliniske prøver ved RT-PCR-analyser. RT-PCR-analyse af relativ miR-203-ekspression i LCM-prostatakræft væv og de matchede tilstødende normale regioner. RNU48 blev anvendt som kontrol. Tabellen nedenfor opsummerer den relative miR-203-ekspression i prostatakræft tumorvæv i forhold til tilstødende normale væv. Klik herfor at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Sammenligning af MIR-383-ekspression ved hjælp af RT-PCR-analyser i mikrodissekeret vs. laser capture mikrodissekeres PCA væv Prostata cancer væv blev enten mikrodissekeres under mikroskop eller blev udsat for LCM efterfulgt af RT-PCR-analyser af MIR-383-ekspression i. tumorvæv i forhold til matchede tilstødende normale væv. Relative miR-383 udtryk i tumor prøver shown.RNU48 blev brugt som kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. ISH analyser af miR-203-ekspression i prostatakræft kliniske væv Dette tal er blevet ændret fra 15. Væv blev hybridiseret med DIG-labelled låst nukleinsyre (LNA) baseret prober til mir-203 og U6 (kontrol) som beskrevet i 15. Repræsentativt eksempel på ISH-analyse af miR-203-ekspression (venstre paneler) og kontrol U6 udtryk (højre paneler) i human prostatacancer normale og knogle metastatiske væv som frembyder svækket miR-203-ekspression i knogle metastatiske væv. Repræsentative eksempler ISH vist i A ved en højere forstørrelse (40X). Relative MIR-203 ekspressionsniveauer i normale prostatavæv og knogle metastatisk prostatacancer væv som vurderet ved ISH analyse. miR-203-ekspression blev scoret, normaliseret til U6 scoringer og plottet. Vandret linje repræsenterer den gennemsnitlige værdi. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikel beskriver vi en forenklet arbejdsgang for miRNA-ekspression profilering i arkiveret FFPE eller friske frosne prostatakræft kliniske væv. I prostatakræft flere undersøgelser, tyder en vigtig rolle microRNA i prostatakræft initiering, progression og metastaser. Dog modstridende resultater ofte opnås på en bestemt miRNA 22 da miRNA udvinding og analyserer metoder er meget forskellige. I betragtning af den spirende dokumentation for den potentielle anvendelse af miRNA som alternative prostatakræft biomarkører for prostatakræft prognose, diagnose og terapi, er der behov for præcist at kvantificere miRNA udtryk profiler i kliniske væv.

Vi anvender en kombination af kvantitativ real-time PCR og in situ hybridisering for miRNA analyser af prostatakræft kliniske prøver. Inden for denne arbejdsproces, vi optimeret de eksisterende metoder for miRNA udvinding, udtryk analyser af Taqmand primer RT-PCR og ISH analyser af LNA prober. Under hele arbejdsgangen, er det af yderste vigtighed at opretholde et RNase frit miljø. Alle reagenser / løsninger, der anvendes, bør RNAse fri og ekstra forsigtighed bør anvendes ved håndtering RNA og andre reagenser. Alle realtid reaktioner bør oprettes på is for at minimere RNA-nedbrydning.

Præcis udtryk profilering i prostata cancer væv er ofte hindret af heterogenitet og multifokal karakter af prostatakræft læsioner 25. Dette kan overvindes ved hjælp af en laser-capture microdisssection teknik, der tillader adskillelse af benigne og maligne epitelceller og reducerer også stromal kontaminering, så nøjagtige downstream molekylære analyser af prostatavæv 22,25. Vi beskæftiger LCM af arkiverede FFPE væv efterfulgt af miRNA-ekspression profilering ved hjælp Taqman MicroRNA ekspressionsassays, som er blevet rapporteret til at være pålidelige. miRNA profilering af LCM væv har betydelig potentiale til at øge miRNA biomarkør opdagelse. I virkeligheden er der stor interesse for at analysere FFPE væv, overvejer at disse væv i vidt omfang anvendes af patologer til kliniske analyser, bevaring og arkivering og let tilgængelige 3. Også på grund af deres lille størrelse og modstandsdygtighed over for endogen RNase aktivitet miRNA er relativt mindre påvirket af FFPE afhængige nedbrydning og er attraktive potentielle biomarkører 3. De miRNA udtryk profiler af formalin faste væv er blevet rapporteret til at være stærkt korreleret til de af frosne væv 21.

Vi beskæftigede og sammenlignet to forskellige kommercielle kits til miRNA ekstraktion fra FFPE væv. Mens begge kits gav kvalitet RNA høj for RT-PCR-analyser, vi brugte en, der bruger en enkel, strømlinet protokol til konsekvent rensning af miRNA og total RNA fra FFPE væv.

Integritet, renhed og koncentration af RNA should testes før RT-PCR-analyser. Prøver viser lav A260 / A230-forhold (<1,8) bør re-udfældet og re-analyseret for renhed, før du bruger i en RT-reaktionen. Også, real-time PCR-analyser af kliniske væv kan være nødvendigt at optimeres yderligere. Threshold cyklus (Ct-værdier)> 33 indikerer lav forstærkning afspejler lavt udgangspunkt cDNA skabelon. I dette tilfælde kan cDNA skabelon indgange øges. Det er også yderst vigtigt, at tilstrækkelig kontrol anvendes til at normalisere og bestemme relative miRNA kvantificeringer mellem normale og tumorvæv. Endogen kontrol (RNU48 / RNU24 / RNU6B) vælges baseret på ensartetheden af ​​forstærkning signaler i normal vs tumorprøver.

Også beskriver vi en optimeret protokol for miRNA ISH analyser af prostatakræft væv baseret på LNA- baserede sonder. Vores optimerede miRNA ISH protokol kan anvendes til prostatakræft væv dias eller prostatakræft væv microarrays (TMA), med sidstnævnte med den potenteial at fremskynde miRNA biomarkør opdagelse. Denne protokol kan også anvendes til andre vævstyper. Dog kan det være nødvendigt, varigheden af ​​proteinaseKdigestionandparaformaldehydetreatment skal optimeres. Proteinase K-fordøjelse giver miRNA probe for at komme ind i cellerne, mens paraformaldehydfiksering er nødvendig for at forhindre miRNA tab som følge permeabilisering. Denne protokol, der oprindeligt er udviklet til brug med LNA sonder 26 er optimeret til at få et bestemt signal med minimal baggrund i prostata væv. Probekoncentrationer og inkubationsbetingelser er optimeret for prostatakræft væv. Vi beskæftiger 5'digoxigeninlabeledprobes ved en koncentration på 20-50 nM afhængigt af overflod af miRNA. Men 3'digoxigeninlabeledprobes og dobbelt mærket (5 'og 3') mærkede prober kan være substitueret. Faktisk dobbelt mærkede prober giver mulighed for bedre kolorimetrisk udvikling for microRNA detektion og anbefales til lav overflod miRNA detektion. Ligeledes kan varigheden af ​​blokering og antistofinkubationer optimeres. Længere blokering anbefales til lavere baggrund, navnlig med lav hyppighed miRNA. Thedurationofcolor reaktion med BM lilla underlag bør overvåges nøje. Længere inkubationer kan generere baggrundsfarvning. Normalt rigelige miRNA kræver kortere inkubationer (1-2 time), mens mindre rigelige miRNA detekteres med længere inkubationer. Under ISH, er det vigtigt at sikre, at de vævssnit ikke udtørre under nogen af ​​trinnene, da dette kan føre til farvning artefakter.

Afslutningsvis, selvom flere undersøgelser tyder på miRNA som vigtige prostatakræft biomarkører, er betydningen af ​​flere af disse studier ofte debatteret på grund af modstridende resultater. Her har vi defineret en optimeret arbejdsgang for nøjagtig miRNA-ekspression analyser i prostatakræft kliniske prøver, der har et potentiale for at fremskynde opdagelsen af ​​miRNA som biomarkører for prostatakræft. Mensdenne arbejdsgang har et betydeligt potentiale til præcist profil miRNA-ekspression i prostatakræft kliniske væv, der er iboende begrænsninger i de anvendte teknikker. Lave rigelige miRNA kan være vanskeligt at profilere med den optimerede miRNA RT-PCR og ISH analyser beskrevet her. Selvom RT-PCR-profilering har et bredere dynamikområde end ISH 27,28, kan lave RNA beløb, der opnås fra LCM detektionsgrænse af lave rigelige miRNA. ISH-baseret detektion af miRNA giver stærk geografisk information, men dens begrænsninger er, at det er en semi-kvantitativ teknik med en mindre dynamikområde 28. Denne teknik bygger på følsomhed og specificitet af prober anvendes, og også på optimering af betingelserne for hybridisering og påvisning af miRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Roger Erickson for hans støtte og bistand med udarbejdelse af manuskriptet.

Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute på National Institutes of Health

(Grant Nummer RO1CA177984, RO1CA138642), VA-programmet projekt om prostatakræft (BX001604).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microtome Leica Biosystems  RM2255
Arcturus Autopix for LCM Arcturus/ Life Technologies LCM1621/LCM1110 Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. 
CapSure Macro LCM Caps Life Technologies LCM0211
miRNeasy FFPE Kit  Qiagen 217504
7500 Fast Real-time PCR System  Applied Biosystems/ Life Technologies 4351106
Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit  Applied Biosystems/ Life Technologies 4366596
Taqman Fast Universal PCR master mix  Applied Biosystems/ Life Technologies 4352042
DIG labeled LNA probe for U6 Exiqon 99002-01
BM Purple AP substrate Roche 11442074001
Pre-hybridization solution  Biochain K2191050-1
Hybridization solution  Biochain K2191050-2
Blocking solution  Biochain K2191050-8
AP-conjugated anti-digoxigenin antibody Biochain K2191050-7
Aqueous mounting media  Vector Laboratories  H-5501  
Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)  Life Technologies 15596-018
Harris hematoxylin Statlab SL200
Eosin  Statlab SL201 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
  3. Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
  4. Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
  5. Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what's new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
  6. Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
  7. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
  8. Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
  9. Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
  10. Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
  11. Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  12. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
  13. Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
  14. Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
  15. Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
  16. Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
  17. Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
  18. Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
  19. Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
  20. Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
  21. Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
  22. Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
  23. Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
  24. Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
  25. Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
  26. Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
  28. Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).

Tags

Medicin MikroRNA'er prostatacancer kliniske væv ekspression analyser real-time PCR,
miRNA Expression Analyser i Prostata Cancer Kliniske Væv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bucay, N., Shahryari, V., Majid, S., … More

Bucay, N., Shahryari, V., Majid, S., Yamamura, S., Mitsui, Y., Tabatabai, Z. L., Greene, K., Deng, G., Dahiya, R., Tanaka, Y., Saini, S. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. J. Vis. Exp. (103), e53123, doi:10.3791/53123 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter