Abstract
Prostat kanseri (PCa) klinik yönetiminde kritik bir meydan okuma hastalığı taraması, tanısı, prognozu ve tedavisi için günümüzde kullanılan biyolojik belirteçlerin yetersizliği ile ortaya atılır. Son yıllarda, mikroRNAlar (miRNA'lar) prostat kanseri tanı ve prognoz gibi umut verici alternatif biyomarkerları ortaya çıkmıştır. Ancak, prostat kanseri için etkili biyomarkırların olarak miRNA'lar gelişimi ağır klinik dokularda onların doğru algılama dayanır. miRNA genellikle tümör heterojenite, örnekleme hataları, stromal kirlenme vb miRNA bir arada kullanarak arşivlenmiş FFPE veya taze donmuş prostat kanseri, klinik örneklerin analizleri için bu makalenin amacı basitleştirilmiş iş akışı tanımlamaktır nedeniyle zorlu prostat kanseri klinik örneklerin analizleri kantitatif gerçek zamanlı PCR (RT-PCR) ve in situ hibridizasyon (ISH). Bu iş akışı içinde, biz FFPE gelen miRNA çıkarılması için mevcut metodolojiler ve dondurulmuş prostat tissu optimizees ve ifade miRNA RT-PCR tabanlı Taqman-prob ile analiz eder. Dayanan problar - Ayrıca, ISH için optimize edilmiş bir yöntem, kilitli nükleik asit (LNA) kullanılarak prostat dokularında formiRNA algılama analiz tarif eder. Bizim optimize miRNA ISH protokol prostat kanseri dokusu slaytlar veya prostat kanseri dokusu mikrodizileri (TMA) tatbik edilebilir.
Introduction
Prostat bezi kanseri erkekler arasında kanserle ilişkili ölümlerin önde gelen nedenlerinden biri olan yaygın tanı erkek kanseridir. ABD'de, bir 220.800 yeni vaka tahmin ve 27540 ölüm 2015 1 rapor edilecektir.
Prostat kanseri tümörleri tembel ya da çok agresif olabilir ders-derece değişken hastalığı olan heterojen bir hastalıktır. Prostat kanseri, klinik yönetiminde kritik bir meydan okuma hastalığı taraması, tanısı, prognozu ve tedavisi 2 şu anda kullanılan yöntemler / biyomarkerların yetersizliği ile ortaya atılır. Güncel tarama yöntemleri prostat spesifik antijen (PSA) testi ve prostat biyopsisi 3 tarafından izlenen bir parmakla rektal muayene (PRM) içerir. Prostat spesifik antijen (PSA) anlamlı klinik yönetimi ve sağkalım oranları 4 devrim yarattı en yaygın kullanılan prostat kanseri biyomarkerdir. Ancak, PSA dahil lac doğasında sınırlamalarözgünlüğü, PSA bazlı tarama k tanı üzerinde ve hastalığın tedavisi üzerinde yol açmıştır. Bu bakışa göre, yoğun çabalar, alternatif prostat kanseri biyomarkerların için bir arama doğru hastalığın saldırganlık tahmin ve daha iyi tedavi kararları 4,5 sürebilirsin hangi özellikle yöneltiliyor. Son birkaç yıldır, mikroRNAlar (miRNA'lar) umut verici alternatif prostat kanseri biyomarkerler olarak ortaya çıkmıştır.
MikroRNA'lar (miRNA'ların) aynı kökenli mRNA hedef 3'- çevrilmemiş bölgelerin (UTRs) ile sekansa özel etkileşimler yoluyla post-transkripsiyonel gen ekspresyonunu bastırmak küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar evrimsel olarak muhafaza edilmiş sınıfını teşkil ederler. Bu mRNA% 60 miRNA'ların 6 hedeflerini muhafaza edilir> olduğu tahmin edilmektedir. miRNA genlerinin intergenik bölgelerde veya intronlar veya genleri 7 kodlama protein / non-protein ekson içinde yer almaktadır. Bu genler tercihen prima içine RNA Polimeraz II transkripsiyonury miRNA'lar (pri-miRNA'lar, birkaç kilobaz uzunluğunda) Bu biçim firkete şeklinde kök halka ikincil yapılar. Bu pri-miRNA'lar sitoplazmaya ihraç ve ayrıca 8-10 (18-25 nükleotid uzunluğunda) olgun miRNA'lar içine işlenir haberci miRNA'lar (60-75 nükleotid uzunluğunda öncesi miRNA'lar) içine işlenir. miRNA'lar çoğalması, geliştirme, farklılaştırma ve apoptoz 11 gibi önemli hücresel süreçleri düzenler. Çalışmalar prostat kanseri 12-15 olmak üzere çeşitli insan malignlerinde miRNA ifade profillerinin yaygın düzensizliği öneririz. MiRNA sentezleme profilleri yaygın primer ve metastatik prostat kanserinde düzensiz için rapor edilmiştir. Altered miRNA ifade miRNA'ların 12,14,16-19 prognostik potansiyelini vurgulayarak prostat kanseri ilerlemesi, saldırganlık ve nüks ile bağlantılı olmuştur. Artan miktarda kanıt vücut miRNA'lar prostat kanseri başlangıcı, gelişimi, ilerleme önemli mekanik rol oynarlar olduğunu gösteririyonu ve metastazı. Genel olarak, miRNA'lar prostat tümörlerinin 12 tabakalaşma normal ve kanserli dokuların ve yardım ayırt edebilirsiniz prostat kanseri tanı ve prognoz gibi umut verici alternatif biyobelirteçleri ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, miRNA'ların prostat kanseri 20 karşı etkili terapötik maddelerin geliştirilmesi için önemli hedeflerdir.
Endojen RNaz etkinliğinin kendi küçük boyutu ve direnci nedeniyle, hali hazırda miRNA'ların formalinle sabitlenmiş dokular 21 ve prostat biyopsisi 22 tespit edilebilir stabil biyolojik belirteçler. Ayrıca, miRNA'ların ekspresyon profilleri, sabit dondurulmuş ve formalin dokularda karşılaştırılmış ve güçlü bir biçimde 21 korelasyon olduğu tespit edilmiştir. Ancak, prostat kanseri, klinik dokularda profilleme miRNA ifade genellikle vb prostat kanseri ağır dinleri etkili biyomarkırların olarak miRNA'lar gelişmesi tümör heterojenliği, örnekleme hataları, stromal kirlenme nedeniyle zorluKlinik dokularda onların doğru algılama es. Burada arşivlenmiş FFPE veya taze donmuş prostat kanseri, klinik örneklerde profilleme miRNA ifade laboratuarımızda kullanılan basitleştirilmiş iş akışını açıklar. Biz kantitatif gerçek zamanlı PCR bir arada istihdam ve miRNA için in situ hibridizasyon eski verimli daha nicel bilgi ve dokuların bir dizi potansiyel miRNA biyomarkerlerin diferansiyel ifadesi görselleştirmek için ikincisi ile, klinik örneklerin analizleri. Bu iş akışı içinde, FFPE ve dondurulmuş prostat dokulardan MiRNA çıkarılması için mevcut olan yöntemleri optimize ekspresyon problar 23 tabanlı kilitli nükleik asit (LNA) kullanılarak MiRNA RT-PCR ve miRNA in situ hibridizasyon tekniği göre Taqman probu ile incelenmiştir. LNA tabanlı sondalar DNA- ya da RNA bazlı prob ile karşılaştırıldığında artan duyarlılık ve özgüllük sunmak ve onların GC içeriği ne olursa olsun, tüm miRNA dizilerinin sağlam algılama sağlar ve aynı zamanda ayrımcılığın izinmiRNA ailelerin yon. Bizim optimize miRNA ISH protokol miRNA biyomarker keşfini hızlandırmak için potansiyeli sunan ikincisi ile, prostat kanseri dokusu slaytlar veya prostat kanseri dokusu mikrodizileri (TMA) tatbik edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Formalin ile sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) ya da dondurulmuş, prostat kanseri örnekleri SFVAMC elde edildi. Numuneler SFVAMC radikal prostatektomi uygulanan prostat kanserli hastaların idi. Yazılı bilgilendirilmiş onam tüm hastalar alındı ve çalışma İnsan Araştırmaları UCSF Komitesi tarafından onaylandı. Seçenek olarak ise, prostat kanseri doku mikrodizileri, ticari kaynaklardan temin edilerek MiRNA ISH ile analizler için kullanılmıştır. Analiz prostat kanseri hastaları için Klinikopatolojik ve takip bilgileri toplanmıştır.
1. Doku numuneleri
- H & E, üreticinin protokolü aşağıdaki bir mikrotom ve leke kullanılarak 10 um bölüme prostat kanseri dokusu örnekleri kesin.
- Prostat kanseri odaklarının belirlenmesi için lekeli slaytlar yanı sıra komşu normal glandüler epitel gözden geçirin.
Not: Bir kurul onaylı patolog H & E lekeli slaytlar ve ma gözden geçirmelidirtümör ve normal bir alanlar için rk. MiRNA için ileriki bölümlerde kılavuzları, normal alanlar vs tümör analizleri olarak işaretlenmiş slaytlar kullanın.
Kantitatif Gerçek zamanlı PCR ile 2. miRNA İfade Analizi
Not: Lazer Yakalama mikrodiseksiyon, (miRNA ve mRNA dahil) toplam RNA izolasyonu, aşağıdaki bölümlerde ayrıntılı olarak TaqMan MicroRNA ifade tahlilleri kullanılarak olgun miRNA'lar denenmesi: Bu iş akışı aşağıdaki adımları içerir.
- RNA Ekstraksiyonu
- Prostat Kanseri FFPE Dokular miRNA İzolasyonu
- Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM)
Not: adımları gerçekleştirin 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 kimyasal davlumbaz.- LCM doku slaytlar (10 mikron kesitler) hazırlayın. 10 dakika her biri için, (2x) Ksilen ıslatılarak Deparrafinize doku bölümleri, daha sonra damıtılmış ve ardından kademeli etanol (100,% 95,% 90,% 80,% 70%) her 5 dakika boyunca inkübe slaytlar dokuları rehidrasyonu su(5 dakika).
- Rehidrasyondan sonra, 30 saniye için hematoksilin ile leke bölümler su eklendi.
- Talep dereceli etanol dokular (70,% 95,% 90,% 80,% 70%) (her biri 5 dakika) ve ksilenden (5 dakika).
- Daha sonra kuru bir davlumbaz slaytlar ve mikrodiseksiyon LCM enstrüman yerleştirin.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak 24 ile LCM Sistemi ile microdissections gerçekleştirin. Kullanım patolog prostat kanseri odaklarının belirlenmesi yanı sıra komşu normal dokuya için rehber olarak slaytlar işaretlenmiş. 70-90 mW bir gücü olan bir 10-20 mikron çaplı darbe lazer ışını kullanarak.
- LCM kapaklar üzerine kızılötesi lazer darbeleri ile ilgi Yakalama alanları. Numune başına miRNA çıkarılması için 2-5 kapaklar hücreleri birleştirin. Hemen çıkarılan RNA bütünlüğünü sağlamak miRNA çıkarılması için yakalanan hücreleri işlemek için.
- Seçenek olarak ise, MiRNA ekstraksiyon tampon içinde lize hücreleri (üreticinin protokolüne göre) ve sto-80 ºC lizatlarında yeniden.
- LCM microdissected Dokular miRNA Ekstraksiyon ve Analizleri
- Üreticinin talimatlarına göre bir ticari kit kullanılarak microdissected FFPE dokulardan toplam RNA ekstrakte edin.
Not: lazer yakalama miscrodissection RNA verimi tipik olarak düşüktür. Bu nedenle, RNA düşük ses (20-30 ul) içine akıtılan ve üreticinin talimatlarına Taqman mikroRNA ifade analizleri kullanılarak ifade profilleme (ayrıca bölüm 2.2 anlatılmıştır) için kullanılır. Olgun miRNA'ların gerçek zamanlı PCR tespiti için, giriş RNA optimizasyonu elüte RNA 5 ul, her MiRNA özgü ters transkripsiyon reaksiyonu için uygun olduğunu göstermektedir. Endojen bir kontrol olarak, RNU48 / RNU24 kullanılır. Kontrol reaksiyonları için, elüt RNA'nın 2 ul ters transkripsiyon reaksiyonu için kullanılır.
- Üreticinin talimatlarına göre bir ticari kit kullanılarak microdissected FFPE dokulardan toplam RNA ekstrakte edin.
- Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM)
- Prostat Kanseri Frozen Dokular miRNA İzolasyonu
- Homojen birbir havan ve havan tokmağı kullanarak sıvı azotun içinde donmuş dokular öğütülmesiyle rezeke prostat dokuları çer-. Soğutulmuş spatula kullanarak bir mikrosantrifüj tüp homojenize doku aktarın. Kolaylıkla transfer edilebilir, böylece sıvı azot Homojenize doku daldırılmak suretiyle aynı sıcaklıkta harç / havan tokmağı ve bir spatula koruyun.
- Homojenize doku ticari guanidin izotiyosiyanat-fenol reaktifı (doku 1 ml / 0.1 g) ilave edilir ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
Not: Ticari guanidin izotiyosiyanat-fenol reaktifı içinde homojenleştirilen dokulara birkaç ay boyunca -80 ° C 'de muhafaza edilebilir. - Homojenat (0.2 ml kloroform / ml) kloroform ilave edin ve 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj, ardından 3-5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Taze, steril RNaz içermeyen 1.5 ml tüp üst sulu faz transfer.
- Izopropil alkol eşit hacim. Mix ve 10 mil boyunca inküben, oda sıcaklığında RNA topak haline 4 ° C 'de 20 dakika boyunca 12,000 x g'de santrifüj ile izledi.
- Süpernatant aspire ve% 70 etanol içinde 1 mL RNA pelet yıkayın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüjleyin.
- Dikkatle süpernatant aspire. 5-10 dakika boyunca oda sıcaklığında kuru bir RNA peletleri. 50-100 ul nükleaz içermeyen su içinde RNA eritin.
- NanoDrop spektrofotometre kullanılarak RNA miktarının gerçekleştirin ve bir Bioanalyzer RNA bütünlüğünü belirler. 10 ng / ul RNA konsantrasyonları ayarlayın. PCR analizleri gerçek zaman (Bölüm 2.2) ve ardından miRNA- özel cDNA reaksiyonu için 10-50 ng RNA kullanın.
- Prostat Kanseri FFPE Dokular miRNA İzolasyonu
- MiRNA İfade Analizi için Kantitatif Real-time PCR
Aşağıda tarif edildiği gibi iki aşamalı bir RT-PCR protokol kullanılarak, olgun Deneyi miRNA'ların: edin.- Ters Transkripsiyon (RT)
- Arka üreticinin talimatlarına uygun olarak, ters transkripsiyon MiRNA kiti kullanılarak RNA'dan cDNA transkribe.MicroRNA Tahliller ve RT kiti miRNA belirli primer ile toplam RNA 10-50 ng kullanın. Kontrol olarak RNU48 / RNU24 / RNU6B kullanın. (Analiz miRNA'nın bolluğuna bağlı olarak) ila 1:10 5 ve bir sonraki aşamada tarif edildiği gibi gerçek zamanlı PCR algılama kullanımı: cDNA 1 seyreltin.
- Olgun miRNA Tespiti için Real-time PCR
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak, hızlı Evrensel ana karışımı ile mikroRNA tahlilleri kullanılarak, cDNA örnekleri PCR ürünleri yükseltin. RNU48 / RNU24 / RNU6B kontrol örnekleri normalize. Hızlı Real Time PCR Sistemi gen ifadesinde göreli değişiklikleri hesaplamak için karşılaştırmalı Ct (eşik döngüsü) yöntemini kullanın. Üçlü olarak her numune analiz edin.
- Ters Transkripsiyon (RT)
Yerinde Hibridizasyon tarafından 3. miRNA Anlatım Analizleri (ISH)
- Dokuların Ön Arıtma
- Bir mikrotom kullanılarak FFPE prostat kanseri dokusu bloklarından 5 mikron bölümleri kesin.
- 15 dakika her biri için, (2x), ksilen ile slaytlar ıslatılmasıyla dokuları Deparrafinize.
- Damıtılmış su (5 dakika), ardından aşamalı etanol (100% (2x),% 95,% 90,% 80,% 70) 'de 5 dakika süre ile, her slaytlar inkübe edilerek dokuları rehidrate.
- 20 dakika için oda sıcaklığında PBS içinde% 4 paraformaldehit ile slaytlar sabitleyin.
- 5 dakika her biri için oda sıcaklığında PBS (2x) ile slaytlar yıkayın.
- Önceden ısıtılmış Proteinaz K tamponu içinde 10 dakika (5 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCl), 37 ° C'de 10 ug / ml proteinaz K ile slaytlar tedavi edin.
- Proteinaz-K işlendikten sonra 30 saniye süreyle PBS içinde% 0.2 glisin ile slaytlar yıkayın.
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS (1x) slaytlar yıkayın.
- 15 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit ile slaytlar sabitleyin.
- Ile durulayın slaytlar5 dakika boyunca PBS ile yıkandı.
- Nemli bir oda içinde 55 ° C 'de 3-4 saat için önceden hibridizasyon solüsyonu ile slaytlar önceden hibridize. Odacık nemlendirilmelidir tutmak için% 50 formamid /% 50 5x SSC batırılmış doku laboratuvar mendil kullanın.
- Hibridizasyon tamponu içinde 20-50 nM arasında bir konsantrasyonda 5 'digoksigenin işaretli problar kullanarak. 4 dakika 90 ºC miRNA özgü prob (20-50 nM) ve küçük nükleer RNA U6 kontrol probu (20 nM), ısı seyreltin buz üzerine yerleştirin ve soğuk hibridizasyon tamponu buz ekleyin (2-4 ng / ml ).
- Prob özgü hibridizasyon sıcaklığında 12-16 saat süreyle inkübe hibridizasyon solüsyonu (prob + hibridizasyon tamponu, slayt başına 100 ul) ekleyin öncesi hibridizasyon çözüm çıkarın (Hibridizasyon sıcaklığı = Tm probu-21 ºC). Nemli bir bölmede (% 50 formamid /% 50 5x SSC) 'de melezleşme.
- 45 ºC de 10 dakika boyunca 2x SSC ile slaytlar yıkayın.
- Yıkama tO 45 ºC 10 dakika boyunca 1.5x SSC slaytlar.
- 20 dakika her biri için 37 ° C'de 0.2x SSC (2x) ile slaytlar yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca 1 x bloke edici bir solüsyonuyla slaytlar inkübe
- 1 ile slaytlar inkübe: 100 PBS 1-4 saat boyunca veya bütün gece 4 ° C'de AP-konjuge anti-digoksigenin antikor seyreltilmiştir.
- 10 dakika her biri için, oda sıcaklığında PBS (3x) ile slaytlar yıkayın.
- 5 dakika her biri oda sıcaklığında Alkalin Fosfataz tamponu (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCI,% 0.1 Tween-20) ile slaytlar (2x) yıkanır.
- 1-20 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta BM Mor AP alt-tabaka slaytlar inkübe edin.
- PBS su içinde% 0.1 Tween-20 ve yıkama (2x) içeren slaytlar durulayın.
- Sulu montaj medyayı kullanarak slaytları monte edin ve bir mikroskop altında incelemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RT-PCR ile LCM birincil prostat kanseri, klinik örneklerde miR-203 İfade profil analizleri (Şekil 1)
RT-PCR LCM primer prostat kanseri dokularında göre miR-203 ekspresyonunun analiz eder ve bir kontrol olarak kullanılmıştır Saini ve ark., 15 RNU48 tarif edildiği gibi eşleştirilir, bitişik normal bölgeler gerçekleştirilmiştir. Aşağıdaki tablo, komşu normal dokulara göre prostat kanseri tümör dokularında göre miR-203 ekspresyonunu özetlemektedir.
RT-PCR ile miR-383 ifadesinin karşılaştırılması lazer yakalama PKa dokuları microdissected vs microdissected analizleri (Şekil 2)
Prostat kanseri, dokular ya da mikroskop altında microdissected edildi ve RT-PCR ile, ardından LCM tabi tümör dokularında miR-383 ekspresyonunun tümör örneklerinde eşleşen komşu normal tissues.Relative miR-383 ifadesine göre analizshown.RNU48 bir kontrol olarak kullanılmıştır edilir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, sentezleme MiRNA bu dokularda incelenmiştir aradaki farklar gözlenmiştir. Prostat dokularının nispeten saf nüfusun izolasyonunu sağlayan ve daha güvenilir olarak LCM mikroskop altında mikrodiseksiyon üzerinde bir avantaja sahiptir.
ISH prostat kanseri, klinik dokularda miR-203 ifade analizleri (Şekil 3)
15 prostat kanseri dokusu mikrodizisi ISH için kullanılan ve ark. Saini de tarif edildiği gibi in situ hibridizasyon normal kemik metastatik prostat kanserli dokularda miR-203 ekspresyonunun analizi kullanılarak 5'-DIG miR-203 ve spesifik LNA problar analizleri gerçekleştirilmiştir U6. ISH Örnek örneği, Şekil 3, kısmen Saini ark yeniden bir şekilde gösterilmiştir analizi ile belirlendi. (2011) 15 Şekil 3A ve 3B, showsmiR-203 Expresbelirtilen dokularda sion (solda) ve U6 kontrol ifadesi (sağda). ISH sinyalleri yarı kantitatif olarak boyama ve boyalı hücrelerin yüzde yoğunluğuna göre sınıflandırılır ve normalize miR-203 sentezlenme seviyelerinin elde edilmesi U6 ifade kişilerce ayrıldı miR-203 ifadesinin 1 ila 4 Yoğunluk skorlarının bir skor verilir olduğu Şekil 3C'de çizildi.
Şekil 1: RT-PCR ile LCM birincil prostat kanseri, klinik örneklerde miR-203 İfade profil analizleri. LCM-prostat kanseri doku ve eşleşen komşu normal bölgelerde göreli miR-203 ekspresyonunun RT-PCR analizi. RNU48 bir kontrol olarak kullanılmıştır. Aşağıdaki tablo komşu normal dokuların göre prostat kanseri tümör dokularında göreli miR-203 ifadesini özetlemektedir. TıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.
Şekil 2: RT-PCR ile miR-383 ifade karşılaştırması lazer yakalama PKa dokuları microdissected genel microdissected analizleri prostat kanseri dokularında ya da mikroskop altında microdissected edildi ve RT-PCR ile, ardından LCM tâbi tutuldu miR-383 ekspresyonunun analizi. eşleşti komşu normal dokuların göre tümör dokuları. Tümör örneklerinde Bağıl miR-383 ifadeler shown.RNU48 bir kontrol olarak kullanılmıştır edilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. ISH prostat kanseri, klinik dokularda miR-203 ifade analizleri bu rakam 15 ile modifiye edilmiştir. Dokular, DIG-Labe ile melezleştirilmiştir15 de tarif edildiği gibi lled kilitli nükleik asit, (LNA) Mir-203 ve U6 (kontrol) için esas sondalar. MiR-203 ifadesi (sol panel) ve insan prostat kanseri normal ve kemik metastatik dokularda kontrol U6 ifadesi (sağ paneller) ve ISH analizi Temsilcisi örnek kemik metastatik dokularda miR-203 ifadesini zayıflatılmış göstermeyen. Daha yüksek bir büyütme (40X) at A'da gösterilen Temsilcisi ISH örnekleri. Normal prostat dokuları ve kemik metastazlı prostat kanseri dokularında göreli miR-203 ekspresyon seviyeleri ISH analizi ile değerlendirildi. miR-203 ifadesi U6 puanları normalize attı ve çizilmiştir. Yatay çizgi ortalama değeri temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, arşivlenmiş FFPE veya taze donmuş prostat kanseri, klinik dokularda profilleme miRNA ifade basitleştirilmiş iş akışını açıklar. Prostat kanserinde, çeşitli çalışmalar prostat kanseri başlatılması, ilerlemesinde ve metastazında microRNA önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir. Ancak, çelişkili sonuçlar genellikle miRNA çıkarma beri belirli bir miRNA 22 üzerinde elde edilen ve yöntemler çok farklıdır analizlerin. Prostat kanseri prognoz, teşhis ve tedavi için alternatif bir prostat kanseri biyobelirteç olarak miRNA'ların potansiyel uygulama destek ortaya çıkan veriler göz önüne alındığında, doğru bir klinik dokularda MiRNA ekspresyon profillerini ölçmek için bir ihtiyaç vardır.
MiRNA prostat kanseri klinik örneklerin analizleri Biz kantitatif gerçek zamanlı PCR ve in situ melezleme bir arada kullanır. Bu iş akışı içinde, miRNA çıkarılması için mevcut metodolojiler optimize ifadesi Taq analizleriRT-PCR ve ISH tabanlı adam astar LNA probları analizleri. Tüm iş akışı sırasında, bir RNaz ücretsiz ortamını korumak için büyük önem taşımaktadır. Kullanılan bütün ayıraçlar / çözeltiler serbest RNaz olmalıdır ve ilave dikkatli RNA ve diğer reaktifleri içindeki kullanılmalıdır. Tüm gerçek zamanlı reaksiyonları RNA bozulmasını en aza indirmek için buz üzerinde kurulmalıdır.
Prostat kanseri dokularında Doğru ifade profilleme genellikle heterojenite ve prostat kanseri lezyonlarının 25 multifokal doğası tarafından engellenmektedir. Bu prostat dokuları 22,25 doğru aşağı moleküler analizleri sağlayan, iyi huylu ve habis epitel hücrelerinin ayrılmasını sağlar ve aynı zamanda stroma kirlenmesini azaltan bir lazer yakalama microdisssection tekniği kullanılarak aşılabilir. Biz güvenilir olduğu rapor edilmiştir Taqman mikroRNA sentezleme tahlilleri kullanılarak profil MiRNA ekspresyonu ardından arşivlenmiş FFPE dokuların LCM kullanır. LCM dokuların MiRNA profil anlaml olanicant potansiyeli miRNA biyomarker keşfini geliştirmek için. Aslında, bu dokular yaygın klinik analizler, koruma ve arşivleme için patologlar tarafından kullanılan ve düşünüyor FFPE dokuları analiz önemli ilgi 3 hazır bulunmaktadır olmasıdır. Ayrıca, kendi küçük boyutu ve endojen RNaz etkinliğinin direnç nedeniyle, miRNA'lar görece daha az FFPE bağımlı bozulması etkilenen ve çekici muhtemel biyolojik belirteçler 3 vardır. Formalinle tespit edilmiş dokulardaki miRNA ekspresyon profilleri güçlü donmuş dokular 21 kişilerce ilişkili olduğu bildirilmiştir.
Biz istihdam ve FFPE dokulardan miRNA çıkarılması için iki farklı ticari kitler karşılaştırıldı. RT-PCR analizi için hem de kitler, yüksek kaliteli RNA vermiştir birlikte, FFPE dokulardan miRNA'ların tutarlı saflaştırma ve toplam RNA için basit, aerodinamik protokolü kullanan biri kullanılır.
Bütünlük, saflık ve RNA omzu konsantrasyonuRT-PCR analizleri önce test d. Düşük A260 / A230 oranını (<1.8) gösteren numuneler bir RT reaksiyonunda kullanılmadan önce yeniden çökeltilmiş ve saflık için yeniden analiz edilmelidir. Ayrıca, real-time PCR daha da optimize edilmesi gerekebilir klinik dokuların analizleri. Eşik döngüsü (Ct değerleri)> 33 düşük başlangıç cDNA şablonu yansıtan düşük amplifikasyon gösterir. Bu durumda, cDNA şablonu girişleri arttırılabilir. Ayrıca, yeterli kontrol normalize normal ve tümörlü dokularda arasındaki nispi MiRNA quantifications belirlenmesi için kullanılması büyük önem taşımaktadır. Endojen kontrolü (RNU48 / RNU24 / RNU6B) tümör örneklerinde genel normal amplifikasyon sinyalleri yeknesaklığı göre seçilir.
MiRNA ISH LNA- tabanlı prob dayalı prostat kanseri dokuların analizleri için de, biz optimize edilmiş bir protokol açıklar. Bizim optimize miRNA ISH protokol ikincisi sunan güçlü olan, prostat kanseri dokusu slaytlar veya prostat kanseri dokusu mikrodizileri (TMA) tatbik edilebilirmiRNA biyomarker keşfini hızlandırmak için ial. Bu protokol, aynı zamanda, diğer doku tiplerinde uygulanabilir. Bununla birlikte, proteinaseKdigestionandparaformaldehydetreatment süresi optimize edilmesi gerekebilir. Proteinaz K sindirim paraformaldehit tespit permeabilization aşağıdaki miRNA kaybını önlemek için gerekli ise miRNA sonda hücrelerine almasını sağlar. Başlangıçta LNA probları 26 ile kullanım için geliştirilmiş Bu protokol, prostat dokuları minimal arka plan ile belirli bir sinyal almak için optimize edilmiştir. Sonda konsantrasyonları ve inkübasyon koşulları prostat kanseri dokular için optimize edilmiştir. Biz miRNA'nın bolluk bağlı olarak 20-50 nM arasında bir konsantrasyonda 5'digoxigeninlabeledprobes kullanır. Bununla birlikte, 3'digoxigeninlabeledprobes ve ikili (5 've 3') etiketli probları sübstitüe edilmiş etiketlenmiş. Aslında, çift etiketli sondalar microRNA tespiti için daha iyi kolorimetrik gelişme potansiyeli sunan ve düşük bolluk miRNA tespiti için tavsiye edilir. Ayrıca, engelleme ve antikor inkübasyonunun süresi optimize edilebilir. Daha uzun engelleme, özellikle düşük bolluk miRNA'lar ile düşük bir arka plana için tavsiye edilir. BM mor alt tabaka ile Thedurationofcolor reaksiyon yakından takip edilmelidir. Daha uzun inkubasyon arka plan boyama oluşturabilir. Daha az bol miRNA uzun inkubasyon ile tespit edilirken Genellikle bol miRNA'lar kısa inkubasyon (1-2 saat) gerektirir. ISH sırasında, bu boyama eserler neden olabileceğinden doku bölümleri adımların herhangi sırasında kurumasına etmemelerini sağlamak için önemlidir.
Sonuç olarak, olsa bazı çalışmalar önemli prostat kanseri biyomarkerler olarak miRNA'lar, bu çalışmaların birkaç önemi nedeniyle genellikle çelişkili sonuçlar tartışmalıdır öneririz. Burada doğru miRNA ifade için optimize edilmiş iş akışı prostat kanseri biyomarkırların olarak miRNA keşfini hızlandırmak için bir potansiyele sahip prostat kanseri, klinik örneklerde analiz tanımlamıştır. IkenBu iş akışı önemli bir potansiyele prostat kanseri, klinik dokularda doğru profil miRNA ifade vardır, istihdam tekniklerin doğasında sınırlamalar vardır. Düşük bol miRNA'lar optimize miRNA RT-PCR ile profile zor olabilir ve ISH burada açıklanan analizleri. RT-PCR tabanlı profilleme ISH 27,28 daha geniş bir dinamik aralık olsa da, LCM elde edilen düşük RNA miktarları düşük bol miRNA'lar saptanmasını sınırlayabilir. MiRNA'lar ISH-tabanlı algılama ancak onun sınırlamalar az dinamik aralık 28 ile yarı-kantitatif bir teknik olduğunu vardır, güçlü uzamsal bilgiyi verir. Bu teknik çalışan prob duyarlılık ve özgüllük ve ayrıca melezleşme ve miRNA'lar tespiti için gerekli koşulların optimizasyonu dayanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz yazının hazırlanması ile yaptığı destek ve yardım için Dr. Roger Erickson teşekkür ederim.
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen
(Hibe Numarası RO1CA177984, RO1CA138642), prostat kanseri (BX001604) VA programı projesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2255 | |
| Arcturus Autopix for LCM | Arcturus/ Life Technologies | LCM1621/LCM1110 | Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| miRNeasy FFPE Kit | Qiagen | 217504 | |
| 7500 Fast Real-time PCR System | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4351106 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4366596 | |
| Taqman Fast Universal PCR master mix | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4352042 | |
| DIG labeled LNA probe for U6 | Exiqon | 99002-01 | |
| BM Purple AP substrate | Roche | 11442074001 | |
| Pre-hybridization solution | Biochain | K2191050-1 | |
| Hybridization solution | Biochain | K2191050-2 | |
| Blocking solution | Biochain | K2191050-8 | |
| AP-conjugated anti-digoxigenin antibody | Biochain | K2191050-7 | |
| Aqueous mounting media | Vector Laboratories | H-5501 | |
| Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent) | Life Technologies | 15596-018 | |
| Harris hematoxylin | Statlab | SL200 | |
| Eosin | Statlab | SL201 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
- Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
- Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
- Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what's new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
- Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
- Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
- Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
- Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
- Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
- Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
- Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
- Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
- Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
- Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
- Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
- Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
- Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
- Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
- Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
- Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
- Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).
