Abstract
전립선 암 (PCA) 임상 관리에서 중요한 과제는 질병 검사, 진단, 예후 및 치료를 위해 현재 사용되는 바이오 마커의 무능력에 의해 제기된다. 최근, 마이크로 RNA (miRNA에)은 전립선 암의 진단 및 예후에 대한 유망한 대체로서 생체 등장했다. 그러나, 전립선 암에 대한 효과적인 생체 등의 miRNAs의 개발은 주로 임상 조직에서의 정확한 검출에 의존한다. miRNA는 종종 종양의 이질성, 샘플링 오류, 간질 오염 등의 miRNA가 조합을 사용하여 아카이브 FFPE 또는 냉동 전립선 암 임상 검체의 분석은이 문서의 목적은 단순화 된 워크 플로우를 설명하는 것입니다 때문에 도전 전립선 암 임상 검체에서 분석 정량 실시간 PCR (RT-PCR) 및 현장 하이브리드에서 (ISH). 이 워크 플로우 내에서, 우리는 FFPE에서 miRNA의 추출을위한 기존의 방법과 냉동 전립선 tissu을 최적화ES 및 표현은 miRNA의 RT-PCR 기반의 TaqMan 프로브에 의해 분석한다. 기반 프로브 - 또, ISH위한 최적화 방식이 고정 된 핵산 (LNA)를 이용하여 전립선 조직에서 formiRNA 검출 분석 기술한다. 우리의 miRNA ISH 최적화 프로토콜은 전립선 암 조직 슬라이드 또는 전립선 암 조직 마이크로 어레이 (TMA)에 적용될 수있다.
Introduction
전립선 암은 남성의 암 관련 사망의 주요 원인 중 하나이며 흔히 진단 남성 악성 종양이다. 미국의 경우는 220,800 새로운 사례를 추정하고 27,540 명이 사망 2015 년 1에보고됩니다.
전립선 암은 종양이 나태한 또는 매우 공격적이 될 수 코스 - 매우 다양 질환을 가진 이질적인 질환이다. 전립선 암의 임상 관리에서 중요한 과제는 질병 검사, 진단, 예후 및 치료 (2) 현재 사용되는 방법 / 바이오 마커의 무능력에 의해 제기된다. 현재 검사 방법은 전립선 특이 항원 (PSA) 테스트 및 전립선 생검 3이어서 직장 수지 검사 (DRE)을 포함한다. 전립선 특이 항원 (PSA)은 크게 개선 된 임상 관리 생존율 4 혁명에서 가장 널리 사용되는 전립선 암의 표지자이다. 그러나, PSA 포함 락의 본질적인 한계로특이도, PSA 기반 검사의 k는 진단을 통해 질병의 치료를 통해하게되었다. 이러한 관점에서 집중적 인 노력은 대체 전립선 암 바이오 마커에 대한 검색 향해 공격성 질병을 예측하고 더 나은 치료 결정 4,5-를 구동 할 수있는 특히 지시되고있다. 지난 몇 년 동안, 마이크로 RNA (miRNA가)는 유망한 대체 전립선 암 바이오 마커로 등장했다.
마이크로 RNA (miRNA가)는 동족 mRNA의 대상의 3'- 번역되지 않은 지역 (UTRs)와 서열 - 특이 적 상호 작용을 통해 후 전사적으로 유전자 발현을 억제하는 작은 비 코딩 RNA를의 진화 적으로 보존 된 클래스를 구성한다. 그것은의 mRNA의 60 %의 miRNAs 6의 목표를 보존하고 있습니다> 것으로 추정된다. miRNA의 유전자는 유전자 간 지역 또는 인트론 또는 유전자 (7)를 코딩하는 단백질 / 비 단백질의 엑손 내에 위치하고 있습니다. 이 유전자는 우선적으로 주역에 RNA 중합 효소 II에 의해 전사된다공예의 miRNAs (PRI-miRNA가 몇 킬로베이스) 그 형태의 머리 핀의 자형 모양의 줄기 루프 차 구조. 이 PRI-의 miRNAs는 세포질에 수출하고 추가로 8-10 (1,825 염기 길이) 성숙의 miRNAs로 처리되는 전구체의 miRNAs (60-75 염기 긴 사전의 miRNAs)로 처리됩니다. miRNA가 증식, 개발, 분화 및 세포 사멸 (11) 등 주요 세포 과정을 조절한다. 연구는 전립선 암 12 ~ 15 등 다양한 인간의 악성 종양에서의 miRNA 발현 프로파일의 광범위한 조절 곤란을 제안한다. miRNA의 발현 프로파일은 널리 기본 및 전이성 전립선 암에서 이상 조절되는 것으로보고되었다. 변경된 miRNA의 발현의 miRNAs 12,14,16-19의 예후 잠재력을 강조 전립선 암의 진행, 공격성과 재발과 연결되어있다. 증거의 성장 몸은 miRNA가 전립선 암 개시, 개발, 진행에 중요한 기계적인 역할을한다는 것을 나타냅니다이온과 전이. 전반적으로, miRNAs의 전립선 암 (12)의 계층화에 정상 및 암 조직과 원조를 구별 할 수 전립선 암 진단 및 예후 등 유망한 대체 바이오 마커를 부상하고있다. 또한, miRNAs의 전립선 암 (20)에 대한 효과적인 치료제의 개발을위한 중요한 표적이다.
내생의 RNase 활성에 작은 크기와 저항으로 인해, miRNAs의 용이 포르말린 고정 된 조직 (21) 및 전립선 생검 (22)에서 검출 될 수 안정한 바이오 마커이다. 더욱이의 miRNAs의 발현 양상은 고정 냉동과 포르말린 조직에 비해 한 강하게 될 21 개의 상관하는 것으로 밝혀졌다. 그러나 임상 적 전립선 암 조직에서의 miRNA 발현 프로파일들은 전립선 암 등 심하게 RELI에게 효과적 생체 등의 miRNAs의 개발 종양 이질성, 샘플링 오류, 간질 오염으로 인해 도전임상 조직에서 자신의 정확한 검출에 말이지. 여기에 우리가 보관 FFPE 또는 냉동 전립선 암 임상 검체에서 프로파일 miRNA의 발현에 대한 우리의 실험실에서 사용되는 단순화 된 워크 플로우를 설명합니다. 우리는 정량적 실시간 PCR의 조합을 채용하고 miRNA에 대한 계내 혼성화에 전 수득 더 정량적 정보와 조직의 어레이의 잠재적 miRNA의 바이오 마커의 발현 차이를 시각화 후자, 임상 검체 분석. 이 워크 플로우 내에서, 우리는 FFPE 및 냉동 전립선 조직에서 miRNA의 추출을위한 기존의 방법을 최적화, 표현은 프로브 (23)를 기반 잠금 핵산 (LNA)를 사용하여 miRNA의 RT-PCR 및 miRNA의 현장 하이브리드 기술에 기반의 TaqMan 프로브에 의해 분석한다. LNA 기반 프로브는 DNA- 또는 RNA- 기초하여 프로브에 비해 증가 된 민감도 및 특이성을 제공하며, 자신의 GC 함량에 관계없이 모두의 miRNA 서열 강력한 검출을 가능하게하고 또한 discrimina 허용miRNA의 가족의 기. 우리의 최적화 된 miRNA ISH 프로토콜 miRNA의 바이오 마커 발견을 촉진시킬 가능성을 제공하고, 후자와, 전립선 암 조직 슬라이드 또는 전립선 암 조직 마이크로 어레이 (TMA)에 적용될 수있다.
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Protocol
포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 또는 냉동 전립선 암 샘플 SFVAMC로부터 수득 하였다. 샘플 SFVAMC에서 급진적 인 전립선 절제술을받은 전립선 암 환자에서 있었다. 서면 동의서는 모든 환자에서 얻어진 것으로,이 연구는 인간의 연구에 UCSF위원회에 의해 승인되었다. 또는, 전립선 암 조직 마이크로 어레이는 상업적인 출처의 조달과의 miRNA가 ISH하여 분석에 사용 하였다. 분석 된 전립선 암 환자의 임상 병리학 및 후속 정보를 수집 하였다.
1. 조직 샘플
- H & E는 제조 업체의 프로토콜을 다음과 마이크로톰 및 얼룩을 사용하여 10 μm의 섹션으로 전립선 암 조직 샘플을 잘라.
- 전립선 암 병소의 식별을위한 스테인드 슬라이드뿐만 아니라 인접한 정상 선의 상피를 검토합니다.
참고 : 보드 인증 병리학 H & E 염색 슬라이드와 엄마를 검토해야종양 및 정상 영역에 대한 RK. 의 miRNA에 대한 다음 섹션에서 가이드가 정상 영역 대 종양 분석으로 표시된 슬라이드를 사용합니다.
정량 실시간 PCR 2. miRNA의 식 분석
참고 : 레이저 캡처 미세 절제, (의 miRNA와 mRNA를 포함) 총 RNA의 분리, 다음 절에서 설명하는대로의 TaqMan 마이크로 RNA 발현 분석을 사용하여 성숙의 miRNAs의 시금 :이 워크 플로는 다음과 같은 단계를 포함한다.
- RNA 추출
- 전립선 암 FFPE 조직에서의 miRNA의 분리
- 레이저 캡처 미세 절제 (LCM)
참고 : 단계를 수행 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4을 화학 물질 흄 후드에서.- LCM에 대한 조직 슬라이드 (10 μm의 섹션)을 준비합니다. 10 분마다, (2 배) 크실렌에 침지하여 Deparrafinize 조직 절편 후 증류 하였다 등급 에탄올 (100 %, 95 %, 90 %, 80 %, 70 %)에서 각각 5 분간 슬라이드를 배양하여 조직을 재수 물(5 분).
- 수분 보충에 이어, 30 초 동안 헤 마톡 실린과 얼룩 섹션은 물 하였다.
- 플레이스 등급 조직 에탄올 (70 %, 95 % 90 %, 80 %, 70 %) (5 분마다), 크실렌 (5 분).
- 다음 드라이 흄 후드 슬라이드 및 미세 절제에 대한 LCM 악기에 배치합니다.
- 제조업체의 지침 (24)에 따라 LCM 시스템과 microdissections을 수행합니다. 사용 병리학 전립선 암 병소의 확인뿐만 아니라, 인접 정상 조직에 대한 가이드로 슬라이드를 표시했다. 70-90의 mW의 전력으로 10 내지 20 μm의 직경 펄스의 레이저 빔을 사용한다.
- LCM 모자 위에 적외선 레이저 펄스와 관심의 캡처 영역. 샘플 당 miRNA의 추출을위한 2-5 캡에서 세포를 결합합니다. 즉시 RNA 추출의 무결성을 보장 miRNA의 추출을위한 세포를 캡쳐 방법에 관한 것이다.
- 대안 적으로, miRNA의 추출 버퍼를 Lyse 세포 (제조사의 프로토콜에 따라)와 STO-80 ºC에서 해물을 다시.
- LCM Microdissected 조직에서 miRNA의 추출 및 분석
- 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 microdissected FFPE 조직에서 전체 RNA를 추출합니다.
참고 : 레이저 캡처 miscrodissection에서 RNA의 수율은 일반적으로 낮다. 따라서, RNA는 낮은 볼륨 (20 ~ 30 μL)로 용출 및 제조업체의 지침에 따라 TAQMAN 마이크로 RNA 발현 분석을 사용하여 발현 프로파일 링 (또한 2.2 절에 설명)에 사용됩니다. 성숙한 miRNAs의 실시간 PCR 검출을위한 입력의 RNA 최적화 용출 RNA의 5 μL 각 miRNA에 특이 적 역전사 반응을위한 최적 인 것을 의미한다. 내인성 대조군으로 RNU48 / RNU24가 사용됩니다. 제어 반응 들어, RNA의 용출 2 μL은 역전사 반응에 사용된다.
- 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 microdissected FFPE 조직에서 전체 RNA를 추출합니다.
- 레이저 캡처 미세 절제 (LCM)
- 전립선 암 냉동 조직에서의 miRNA의 분리
- Homoge박격포와 유 봉을 사용하여 액체 질소에 조직을 분쇄하여 냉동 절제 전립선 조직을 nize. 냉각 된 주걱을 사용 microcentrifuge 관에 균질 조직을 전송합니다. 쉽게 전송할 수있는 액체 질소 때문에 균질 조직에 침지하여 동일한 온도에서 박격포 / 유 봉 주걱을 유지한다.
- 균질화 된 조직 상용 구아니딘 이소 티오 시아 네이트 - 페놀 시약 (1 ㎖ 조직 / 0.1 g)을 첨가하고 5 분 동안 실온에서 배양한다.
주 : 상용 구아니딘 이소 티오 시아 네이트 - 페놀 시약 균질화 조직 수개월 -80 ºC에 저장 될 수있다. - 균질 (0.2 ml의 클로로포름 / ㎖)에 클로로포름을 추가하고 30 초 동안 격렬하게 흔들어. 4 ºC에서 20 분 동안 10,000 XG에서 원심 분리 3-5 분 동안 실온에서 샘플을 인큐베이션.
- 신선한 멸균 된 RNase가없는 1.5 ML 튜브로 위 수성 위상을 전송합니다.
- 이소 프로필 알코올의 동일한 볼륨을 추가합니다. 믹스 10 마일 부화N 실온에서 RNA 펠렛 4 ºC에서 20 분 동안 12,000 XG에서 원심 분리 하였다.
- 뜨는을 기음과 70 % 에탄올 1 mL로 RNA 펠렛을 씻는다. 4 ºC에서 10 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기.
- 조심스럽게 뜨는을 대기음. 5 ~ 10 분 동안 실온에서 건조 RNA 펠렛. 50 ~ 100 μL 뉴 클레아없는 물에서 RNA를 녹인다.
- nanodrop 분광 광도계를 사용하여 RNA의 정량을 수행하고 bioanalyzer로 RNA의 무결성을 결정합니다. 10 NG / μL로 RNA 농도를 조정합니다. PCR 분석을 실시간 (2.2 절) 다음 miRNA- 특정 cDNA의 반응에 10 ~ 50 ng의 RNA를 사용합니다.
- 전립선 암 FFPE 조직에서의 miRNA의 분리
- miRNA의 식 분석을위한 정량 실시간 PCR
후술하는 바와 같이 두 단계 RT-PCR 프로토콜을 사용하여 성숙한 miRNAs의 정량법 : 참고.- 역전사 (RT)
- 역 제조업체의 지침에 따라 miRNA의 역전사 키트를 사용하여 RNA로부터 cDNA를을 쓰다.마이크로 RNA 분석 실험 및 RT 키트에서 miRNA의 특정 프라이머 전체 RNA의 10 ~ 50 NG를 사용합니다. 컨트롤로 RNU48 / RNU24 / RNU6B을 사용합니다. (분석의 miRNA의 풍부에 따라 다름) 1:10 (5) 다음 단계에 설명 된대로 실시간 PCR 검출에 사용 된 cDNA 1을 희석.
- 성숙한 miRNA의 탐지를위한 실시간 PCR
- 제조업체의 지시에 따라 빨리 유니버셜 마스터 믹스 마이크로 RNA 세이를 이용하여 cDNA의 샘플들로부터 PCR 증폭 제품. RNU48 / RNU24 / RNU6B 컨트롤에 샘플을 정상화. 빠른 실시간 PCR 시스템에서 유전자 발현의 상대적인 변화를 계산하는 비교 코네티컷 (임계 사이클) 방법을 사용합니다. 세중의 각 샘플을 분석 할 수 있습니다.
- 역전사 (RT)
제자리 교잡에서 3.의 miRNA 발현 분석 (ISH)
- 조직의 사전 처리
- 마이크로톰을 사용 FFPE 전립선 암 조직 블록 5 μm의 단면을 절단.
- 15 분마다, (배) 자일 렌으로 슬라이드를 담가 조직을 Deparrafinize.
- 증류수 (5 분) 하였다 등급 에탄올 (100 % (2 배), 95 %, 90 %, 80 %, 70 %)에서 5 분 동안 각각의 슬라이드를 배양하여 조직을 재수.
- 실온에서 20 분 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데하이드 슬라이드를 고정한다.
- 각 5 분 동안 실온에서 PBS (2X)로 슬라이드를 세척한다.
- 예열 테 K 버퍼에 10 분 (5 mM 트리스 - HCL 산도 7.4, 1 mM의 EDTA, 1 mM의 NaCl을) 37 ºC에서 10 μg의 / ㎖ 테 K와 슬라이드를 치료.
- 테-K 처리 후, 30 초 동안 PBS에서 0.2 % 글리신과 슬라이드를 헹군다.
- 5 분 동안 실온에서 PBS (1X)에서 슬라이드를 씻으십시오.
- 15 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드와 슬라이드를 수정합니다.
- 와 린스 슬라이드5 분 동안 PBS.
- 가습 실에서 55 ºC에서 3-4 시간 동안 프리 하이브리드 솔루션으로 슬라이드를 사전 하이브리드. 챔버는 가습 유지하기 위해 50 % 포름 아미드 / 50 % 5 배 SSC에 배어 조직 실험실 물티슈를 사용합니다.
- 혼성화 버퍼 20-50 nM의 농도로 5 '제닌 표지 된 프로브를 사용한다. 4 분 90 ºC에서 miRNA의 특정 프로브 (20 ~ 50 ㎚)과 작은 핵 RNA U6 제어 프로브 (20 ㎚), 열을 희석 얼음에 배치, 차가운 하이브리드 버퍼를 얼음 추가 (2-4 NG / μL ).
- 프로브 고유의 하이브리드 온도에서 12 ~ 16 시간 동안 배양, 하이브리드 솔루션 (프로브 + 하이브리드 버퍼, 슬라이드 당 100 μL)를 추가, 사전 하이브리드 솔루션을 제거 (하이브리드 온도 = Tm은 프로브-21 ° C). 가습 실 (50 % 포름 아미드 / 50 % 5 배 SSC)에서 혼성화를 수행합니다.
- 45 ºC에서 10 분 동안 2 배 SSC와 슬라이드를 씻으십시오.
- 워시 T그는 45 ºC에서 10 분 동안 1.5 배의 SSC와 슬라이드.
- 20 분 각 37 ºC에서 0.2 배씩 SSC (2 배)와 슬라이드를 씻으십시오.
- 실온에서 1-2 시간 동안 1X 차단 용액으로 슬라이드 부화
- 1 슬라이드를 품어 : 100 PBS 1-4 시간 동안 또는 4 박 ºC에서 AP-복합 항 제닌 항체를 희석.
- 10 분 각각 실온에서 PBS (배)와 슬라이드를 씻으십시오.
- 각 5 분 동안 실온에서 알칼리성 포스파타제 완충액 (100 mM 트리스 pH를 9.5의 50 mM의 MgCl 2, 100 mM의 염화나트륨, 0.1 % 트윈 -20)으로 슬라이드 (2 배)를 세척한다.
- 1-20 시간 동안 실온에서 어둠 속에서 BM 보라색 AP 기판에 슬라이드를 품어.
- PBS는 물에 0.1 %를 트윈-20 및 세척 (2 배)를 포함하여 슬라이드를 씻어.
- 수성 설치 미디어를 사용하여 슬라이드를 장착하고 현미경으로 검사합니다.
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Representative Results
RT-PCR에 의한 LCM 차 전립선 암 임상 검체 미르-203의 발현 프로파일 분석 (그림 1)
RT-PCR은 LCM 차 전립선 암 조직에서 상대적은 miR-203의 발현을 분석 대조군으로 사용 하였다 Saini 외. RNU48 15에 기재된 바와 같이 유사한 인접하는 정상 영역을 행했다. 아래 표는 인접한 정상 조직에 대해 전립선 암 종양 조직에서 상대적은 miR-203의 발현을 요약 한 것이다.
RT-PCR에 의한은 miR-383의 발현 비교 레이저 캡처 PCA 조직을 microdissected 대 microdissected에서 분석 (그림 2)
전립선 암 조직은 어느 현미경 microdissected 하였다 또는 RT-PCR 하였다 LCM을 실시 종양 조직에서 발현은 miR-383 종양 샘플에서 유사한 인접 정상 tissues.Relative은 miR-383 발현에 대하여 분석shown.RNU48는 대조군으로 사용 하였다된다. 도 2에 도시 된 바와 같이, miRNA의 발현은 이들 조직에서 분석하면, 차이가 관찰되었다. 이 전립선 조직의 비교적 순수한 인구의 분리를 허용하고보다 신뢰성있는 그대로 LCM은 현미경 하에서 미세 절제 위에 이점을 갖는다.
ISH는 전립선 암의 임상 조직 미르-203의 발현 분석 (그림 3)
15 전립선 암 조직의 마이크로 어레이 ISH 사용 하였다 등. Saini에 기재된 바와 같이 계내 혼성화 정상적인 뼈 전이성 전립선 암 조직에서은 miR-203의 발현 분석을 이용하여 5'-DIG 미르-203과 특이 LNA 프로브를 표지 분석 하였다 U6. ISH의 대표적인 예는 그림 3, 부분적으로 Saini 등으로부터 재생 그림을 분석한다. (2011) 15 그림 3A 및 3B showsmiR-203 EXPRES을표시된 조직에서 시온 (왼쪽)와 U6 제어 식 (오른쪽). ISH 신호는 반 - 정량적으로 염색하고 염색 된 세포의 백분율의 강도에 기초하여 등급 화 및 정규화은 miR-203 발현 수준을 얻기 위해 U6 식들에 의해 분할 된 결과 miR-203의 발현 1~4 강도 점수의 점수를 할당되었는지 도 3c에 플롯 하였다.
그림 1 : RT-PCR에 의한 LCM 차 전립선 암 임상 검체 미르-203의 발현 프로파일 분석. LCM-전립선 암 조직과 일치하는 인접 정상 지역에서 상대은 miR-203의 발현을 RT-PCR 분석. RNU48는 대조군으로 사용 하였다. 아래의 표는 인접한 정상 조직에 비해 전립선 암 종양 조직의 상대적인은 miR-203의 발현을 요약 한 것입니다. 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
도 2 : RT-PCR에 의한 결과 miR-383의 발현 비교 레이저 캡처 PCA 조직을 microdissected 대 microdissected에서 분석 전립선 암 조직 어느 현미경 microdissected 하였다 또는 RT-PCR 하였다 LCM을 실시 미르-383 발현 분석. 유사한 인접한 정상 조직에 비해 종양 조직. 종양 샘플에서 상대은 miR-383 표현 shown.RNU48은 대조군으로 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. ISH는 전립선 암의 임상 조직은 miR-203의 발현 분석이 그림은 15에서 수정되었습니다. 조직은 DIG-라베와 하이브리드했다(15)에 설명 된대로 채워 고정 핵산 (LNA) 미르-203 U6 (제어) 기반의 프로브. 은 miR-203의 발현 (왼쪽 패널)과 인간의 전립선 암 정상 뼈 전이 조직에서 제어 U6 식 (오른쪽 패널)의 ISH 분석의 대표적인 예는 뼈 전이 조직은 miR-203 발현을 감쇠 표시합니다. 높은 배율 (40 배)에에 표시된 대표 ISH 예. 정상적인 전립선 조직 및 뼈 전이성 전립선 암 조직에서의 상대적은 miR-203의 발현 수준은 ISH 분석에 의해 평가 된 바와 같이. 은 miR-203의 발현은 U6 점수로 표준화, 득점 그려졌다. 수평 라인이 평균 값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 글에서, 우리는 보관 FFPE 또는 냉동 전립선 암의 임상 조직에서 프로파일 miRNA의 발현에 대한 단순화 된 워크 플로우를 설명합니다. 전립선 암, 몇몇 연구는 전립선 암의 개시, 진행 및 전이에서 마이크로 RNA의 중요한 역할을 시사한다. 그러나, 충돌 결과는 종종 miRNA의 추출 이후 특정 miRNA의 22에 얻은 방법은 크게 다르다 분석된다. 전립선 암의 예후, 진단 및 치료를위한 대안적인 전립선 암과 같은 바이오 마커의 miRNAs의 잠재적 애플리케이션을 지원하는 새로운 기록의 관점에서 정확하게 임상 조직에서의 miRNA 발현 프로파일을 정량 할 필요가있다.
miRNA의 전립선 암 임상 검체 분석을 위해 우리는 정량 실시간 PCR 및 현장 하이브리드의 조합을 사용합니다. 이 워크 플로우 내에서, 우리는 miRNA의 추출을 위해 기존의 방법을 최적화, 표현은 DNA 형성 촉매에 의해 분석RT-PCR 및 ISH 기반 남자 프라이머는 LNA 프로브에 의해 분석한다. 전체 흐름 동안,의 RNase가없는 환경을 유지하기 위해 매우 중요하다. 사용 된 모든 시약 / 솔루션 무료의 RNase해야하며, 특히주의는 RNA와 다른 시약을 처리에 사용되어야한다. 모든 실시간 반응은 RNA 저하를 최소화하기 위해 얼음에 설정해야합니다.
전립선 암 조직에서의 정확한 발현 프로파일은 종종 이질성 및 전립선 암 병변 (25)의 다 초점 특성에 의해 방해된다. 이는 전립선 조직 22, 25의 정확한 다운 스트림 분자를 분석하게, 양성 및 악성 상피 세포의 분리를 허용하고 또한 간질 오염을 줄이고 레이저 캡처 microdisssection 기술을 이용하여 극복 될 수있다. 우리는 신뢰할 수있는 것으로보고되고있다 TAQMAN 마이크로 RNA 발현 분석을 사용하여 프로파일의 miRNA 발현 다음 보관 FFPE 조직의 LCM을 사용합니다. LCM 조직의 miRNA의 프로파일 링은 signif있다icant 가능성이 miRNA의 바이오 마커의 발견을 강화한다. 사실,이 조직은 널리 임상 분석, 보존 및 보관을 위해 병리학 자에 의해 사용되는 것을 고려 FFPE 조직 분석에 상당한 관심은 3 쉽게 사용할 수 있습니다입니다. 또한, 작은 크기와 내생의 RNase 활동에 대한 저항으로 인해, miRNA가 상대적으로 적은 FFPE 따라 저하에 의해 영향을받는 매력적인 잠재적 인 바이오 마커 3입니다. 포르말린 고정 된 조직의 miRNA 발현 양상은 강하게 고정 된 조직 (21)의 것들에 상관 관계가보고되었다.
우리는 고용 FFPE 조직에서 miRNA의 추출을위한 두 개의 서로 다른 상용 키트를 비교했다. RT-PCR 분석 키트 모두 고품질의 RNA를 수득하면서, 우리는 FFPE 조직에서의 miRNA의 일관된 정제 총 RNA에 대한 간단하고 능률적 인 프로토콜을 사용하여 하나를 사용 하였다.
무결성, 순도와 RNA의 shoul의 농도RT-PCR 분석 전에 시험 될 거라고. 낮은 A260 / A230 비율 (<1.8)를 보여주는 샘플 RT 반응에 사용하기 전에 다시 침전 및 순도 다시 분석해야한다. 또한, 실시간 PCR은 더욱 최적화 될 필요가있다 임상 조직 분석. 임계 사이클 (CT 값)> (33)은 낮은 시작하는 cDNA 템플릿을 반영 낮은 증폭을 나타냅니다. 이 경우, 템플릿의 cDNA 입력은 증가 될 수있다. 또한, 적절한 제어가 정상화 및 정상 및 종양 조직 간의 상대의 miRNA 정량화를 결정하기 위해 사용되는 것이 가장 중요하다. 내인성 대조군 (RNU48 / RNU24 / RNU6B)는 종양 샘플 대 정상에서 증폭 된 신호의 균일 성을 기준으로 선택된다.
ISH는 miRNA의 LNA- 기반 프로브에 기초 전립선 암 조직 분석에도, 우리는 최적의 프로토콜을 설명한다. 우리의 miRNA ISH 최적화 프로토콜은 후자의 제안을 적정량으로, 전립선 암 조직 슬라이드 또는 전립선 암 조직 마이크로 어레이 (TMA)에 적용될 수있다miRNA의 바이오 마커의 발견을 가속화 IAL. 이 프로토콜은 또한 다른 조직 유형에도 적용 할 수있다. 그러나 proteinaseKdigestionandparaformaldehydetreatment의 지속 시간이 최적화 될 필요가있다. 프로 테이나 제 K 소화 파라 포름 알데히드 고정 투과성으로는 다음의 miRNA의 손실을 방지하기 위해 필요한 동안 miRNA의 프로브 세포에 들어갈 수있다. 원래 LNA 프로브 (26)와 함께 사용하기 위해 개발 된이 프로토콜은 전립선 조직에 최소한의 배경에 특정 신호를 얻기 위해 최적화되어 있습니다. 프로브 농도 및 배양 조건은 전립선 암 조직에 대해 최적화된다. 우리의 miRNA의 풍부에 따라 20 ~ 50 nm의 농도 5'digoxigeninlabeledprobes를 사용합니다. 그러나 3'digoxigeninlabeledprobes 듀얼 (5 '및 3')를 표지 프로브가 치환 될 수있는 라벨. 사실, 이중 라벨 프로브는 마이크로 RNA 검출을위한 더 나은 비색 개발을위한 잠재력을 제공하고 낮은 풍부 miRNA의 검출을 위해 추천. 또한, 차단 및 항체 배양의 시간은 최적화 될 수있다. 긴 차단 특히 낮은 풍요의 miRNAs와 낮은 배경을 권장합니다. BM 보라색 기판과 Thedurationofcolor 반응을 면밀히 모니터링해야한다. 긴 배양 배경 염색을 생성 할 수 있습니다. 덜 풍부한 miRNA의 긴 배양으로 검출하는 동안 일반적으로, 풍부한 miRNAs의 짧은 배양 (1-2 시간)이 필요합니다. ISH 중에 이것이 염색 아티팩트가 발생할 수 있으므로 조직 절편은 임의의 단계 중에 건조되지 않도록하는 것이 중요하다.
결론적으로, 비록 여러 연구가 중요한 전립선 암 바이오 마커 등의 miRNAs는, 이러한 연구의 몇 가지의 의미가 자주 충돌하여 결과를 논의한다 제안한다. 여기에서 우리는 정확한 miRNA의 발현에 최적화 된 워크 플로우가 전립선 암 바이오 마커 등의 miRNA의 발견을 가속화 할 가능성이 전립선 암 임상 검체에서 분석 정의했습니다. 동안이 워크 플로는 상당한 잠재력 전립선 암의 임상 조직에서 정확하게 프로필 miRNA의 발현에 있고, 사용 된 기술의 본질적인 한계가있다. 낮은 풍부한의 miRNAs는 최적화 된 miRNA의 RT-PCR과 프로필을하기 어려울 수 있으며, ISH는 여기에 설명 분석. RT-PCR 기반의 프로파일 링 ISH (27, 28)보다 더 넓은 동적 범위를 가지고 있지만, LCM에서 얻은 낮은 RNA의 양이 낮은 풍부한의 miRNAs의 검출을 제한 할 수 있습니다. ISH의 miRNAs의 검출 계, 그러나 그것의 제한이 적은 동적 범위 (28)와 반 - 정량적 기법이라고하고, 강력한 공간 정보를 산출한다. 이 기술을 채용 프로브 민감도와 특이도에 혼성화와의 miRNAs의 검출 조건의 최적화에 의존한다.
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Acknowledgments
우리는 원고의 준비와 자신의 지원과 도움 박사 로저 에릭슨 감사합니다.
이 작품은 국립 보건원의 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)에 의해 지원되었다
(허가 번호 RO1CA177984, RO1CA138642), 전립선 암 (BX001604)에 버지니아 프로그램 프로젝트.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2255 | |
| Arcturus Autopix for LCM | Arcturus/ Life Technologies | LCM1621/LCM1110 | Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| miRNeasy FFPE Kit | Qiagen | 217504 | |
| 7500 Fast Real-time PCR System | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4351106 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4366596 | |
| Taqman Fast Universal PCR master mix | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4352042 | |
| DIG labeled LNA probe for U6 | Exiqon | 99002-01 | |
| BM Purple AP substrate | Roche | 11442074001 | |
| Pre-hybridization solution | Biochain | K2191050-1 | |
| Hybridization solution | Biochain | K2191050-2 | |
| Blocking solution | Biochain | K2191050-8 | |
| AP-conjugated anti-digoxigenin antibody | Biochain | K2191050-7 | |
| Aqueous mounting media | Vector Laboratories | H-5501 | |
| Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent) | Life Technologies | 15596-018 | |
| Harris hematoxylin | Statlab | SL200 | |
| Eosin | Statlab | SL201 |
References
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