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Los análisis de expresión de miRNA en tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata

Published: September 8, 2015 doi: 10.3791/53123
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Urology, Veterans Affairs Medical Center, San Francisco, University of California San Francisco

Abstract

Un reto fundamental en el cáncer de próstata (CaP) manejo clínico se plantea por la insuficiencia de los biomarcadores que actualmente se utilizan para la detección de la enfermedad, diagnóstico, pronóstico y tratamiento. En los últimos años, microRNAs (miRNAs) han surgido como biomarcadores alternativas prometedoras para el diagnóstico y el pronóstico del cáncer de próstata. Sin embargo, el desarrollo de miRNAs como biomarcadores eficaces para el cáncer de próstata depende en gran medida su detección precisa en tejidos clínicos. miARN análisis en muestras clínicas de cáncer de próstata a menudo es un reto debido a la heterogeneidad del tumor, los errores de muestreo, la contaminación del estroma etc. El objetivo de este artículo es describir un flujo de trabajo simplificado para miARN analiza en FFPE archivado o especímenes clínicos sobre el cáncer de próstata fresco congelado usando una combinación de cuantitativa en tiempo real PCR (RT-PCR) e hibridación in situ (ISH). Dentro de este flujo de trabajo, optimizamos las metodologías existentes para la extracción de miRNA de FFPE y tissu próstata congeladoES y la expresión por análisis Taqman-sonda basada miARN RT-PCR. Además, se describe un método optimizado para ISH análisis de detección formiRNA en los tejidos de la próstata utilizando ácido nucleico cerrado (LNA) - sondas basadas. Nuestro protocolo miRNA ISH optimizado se puede aplicar a las diapositivas de cáncer de próstata de tejido o microarrays de tejidos de cáncer de próstata (TMA).

Introduction

El cáncer de próstata es un tumor maligno masculina comúnmente diagnosticado que es una de las principales causas de la mortalidad relacionada con el cáncer entre los hombres. En Estados Unidos, se estima que 220.800 nuevos casos y 27.540 muertes se reportaron en 2015 1.

El cáncer de próstata es una enfermedad heterogénea con enfermedad muy variable supuesto- tumores pueden ser indolente o muy agresivo. Un reto fundamental en el manejo clínico del cáncer de próstata es el que plantea la insuficiencia de los que actualmente se utilizan métodos / biomarcadores para la detección de enfermedades, el diagnóstico, el pronóstico y el tratamiento 2. Métodos de detección actuales incluyen antígeno (PSA) prostático específico y un examen rectal digital (DRE), seguido de las biopsias de próstata 3. Antígeno específico de próstata (PSA) es el biomarcador de cáncer de próstata más ampliamente utilizado que ha revolucionado significativamente la gestión clínica y la mejora de las tasas de supervivencia 4. Sin embargo, debido a las limitaciones inherentes de PSA incluyendo lack de especificidad, cribado basado en PSA ha llevado a más de diagnóstico y sobre el tratamiento de la enfermedad. En vista de esto, los intensos esfuerzos se dirigen hacia la búsqueda de alternativas biomarcadores de cáncer de próstata, en particular los que puede predecir la agresividad de la enfermedad y conducir mejores decisiones de tratamiento 4,5. En los últimos años, los microRNAs (miRNAs) han surgido como prometedores biomarcadores de cáncer de próstata alternos.

Los microARNs (miRNAs) constituyen una clase conservado evolutivamente de los pequeños RNAs no codificantes que suprimen la expresión de genes post-transcripcional a través de interacciones específicas de secuencia con los 3'-regiones no traducidas (UTRs) de mRNA objetivos afines. Se estima que> 60% de los mRNAs se conservan objetivos de miRNAs 6. genes miARN se encuentran en regiones intergénicas o dentro de intrones o exones de proteína / no proteico 7 genes de codificación. Estos genes son preferentemente transcritos por la ARN polimerasa II en primamiRNAs ry (pri-miRNAs, varias kilobases de largo) que bucle tallo en forma de estructuras secundarias forma de horquilla. Estos pri-miRNAs se procesan en miRNAs precursores (pre-miRNAs, 60-75 nucleótidos de largo) que se exportan al citoplasma y tratados posteriormente en miRNAs maduros (18-25 nucleótidos de largo) 08.10. miRNAs regulan procesos celulares clave, incluyendo la proliferación, el desarrollo, la diferenciación y la apoptosis 11. Los estudios sugieren una desregulación generalizada de los perfiles de expresión de miRNA en diversos tumores malignos humanos incluyendo el cáncer de próstata 12-15. los perfiles de expresión de genes miARN se han notificado a ser ampliamente desregulado en el cáncer de próstata primario y metastásico. Alterada la expresión de miRNA se han relacionado con la progresión del cáncer de próstata, la agresividad y la recurrencia destacando el potencial pronóstico de miRNAs 12,14,16-19. Un creciente cuerpo de evidencia indica que los miRNAs juegan importantes papeles mecanicistas en la iniciación del cáncer de próstata, el desarrollo, el progresoion y la metástasis. En general, los miRNAs están surgiendo alternativas como biomarcadores prometedores para el diagnóstico del cáncer de próstata y el pronóstico que pueden distinguir entre los tejidos y ayuda normales y cancerosas en la estratificación de los tumores de próstata 12. También, miRNAs son objetivos importantes para el desarrollo de terapias eficaces contra el cáncer de próstata 20.

Debido a su pequeño tamaño y resistencia a la actividad de RNasa endógena, miRNAs son biomarcadores estables que se pueden detectar fácilmente en tejidos fijados con formalina y 21 en las biopsias de próstata 22. Por otra parte, los perfiles de expresión de miRNAs se han comparado en los tejidos congelados y formol fija y se han encontrado para ser fuertemente correlacionada 21. Sin embargo, la expresión de los genes miARN perfiles en los tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata a menudo es un reto debido a la heterogeneidad del tumor, los errores de muestreo, la contaminación del estroma etc. El desarrollo de miRNAs como biomarcadores eficaces para el cáncer de próstata en gran medida relies en su detección precisa en tejidos clínicos. Aquí se describe un flujo de trabajo simplificado utilizado en nuestro laboratorio para la expresión de los genes miARN perfiles de FFPE archivado o especímenes clínicos sobre el cáncer de próstata congelados frescos. Empleamos una combinación de PCR cuantitativa en tiempo real e hibridación in situ para miRNA los análisis de muestras clínicas, con el primero produciendo más información cuantitativa y el segundo para la visualización de la expresión diferencial de los genes miARN potenciales biomarcadores en una variedad de tejidos. Dentro de este flujo de trabajo, optimizamos las metodologías existentes para la extracción de miARN de FFPE y tejidos de la próstata congelados, la expresión análisis por Taqman-sonda basada miARN RT-PCR y miARN en la técnica de hibridación in situ utilizando ácido nucleico bloqueado (LNA) a base de sondas 23. Sondas basados ​​en LNA ofrecen mayor sensibilidad y especificidad en comparación con el ADN o ARN-sondas basadas y permite la detección robusta de todas las secuencias de genes miARN, independientemente de su contenido de GC y también permiten la discriminaciónción de las familias miARN. Nuestro protocolo miRNA ISH optimizado se puede aplicar a las diapositivas de cáncer de próstata de tejido o microarrays de tejidos de cáncer de próstata (TMA), con este último ofrece el potencial para acelerar el descubrimiento de biomarcadores miRNA.

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Protocol

Se obtuvieron fijado en formol, embebido en parafina (FFPE) o muestras de cáncer de próstata congelados frescos del SFVAMC. Las muestras procedían de pacientes con cáncer de próstata sometidos a prostatectomía radical en SFVAMC. Escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes y el estudio fue aprobado por el Comité de la UCSF en Investigación en Seres Humanos. Alternativamente, los tejidos de cáncer de próstata microarrays se adquirieron de fuentes comerciales y se utilizan para miARN analiza por ISH. Se recogió información clínico-patológico y el seguimiento de los pacientes con cáncer de próstata analizados.

1. Muestras de Tejido

  1. Cortar muestras de tejido de cáncer de próstata en 10 micras secciones usando un microtomo y se tiñen con H & E siguiendo el protocolo del fabricante.
  2. Revisar diapositivas teñidas para la identificación de focos de cáncer de próstata, así como adyacente epitelio glandular normal.
    Nota: Un patólogo certificado por la junta debe revisar las diapositivas H & E manchadas y mark para el tumor y áreas normales. Utilice las diapositivas marcadas como guías en las secciones posteriores para miARN análisis del tumor vs áreas normales.

2. miARN análisis de expresión por PCR cuantitativa en tiempo real

Nota: Este flujo de trabajo incluye los siguientes pasos: microdisección de captura por láser, de aislamiento de ARN total (incluyendo miARN y ARNm), Dosificación de los miRNAs maduros utilizando los ensayos de expresión TaqMan microARN que se detallan en los siguientes apartados.

  1. La extracción de RNA
    1. Aislamiento de miRNA de cáncer de próstata FFPE tejidos
      1. Microdisección de captura por láser (LCM)
        Nota: Realice los pasos 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 en una campana de extracción química.
        1. Preparar diapositivas de tejidos (10 micras secciones) de LCM. Deparrafinize secciones de tejido por inmersión en xileno (2x), durante 10 minutos cada uno, a continuación, se rehidratan los tejidos mediante la incubación de los portaobjetos durante 5 min cada uno en etanol graduado (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) seguido por destilada agua(5 minutos).
        2. Después de la rehidratación, las secciones de la mancha con hematoxilina durante 30 segundos seguidos por el agua.
        3. Coloque los tejidos en etanol graduado (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (5 min cada uno) y xileno (5 min).
        4. Diapositivas secas en una campana de extracción y luego se coloca en el instrumento LCM para microdisección.
        5. Realizar microdisecciones con el Sistema de LCM de acuerdo con las instrucciones del fabricante 24. Uso patólogo marcado diapositivas como guías para la identificación de los focos de próstata cáncer, así como el tejido normal adyacente. Utilice el rayo láser a una 10-20 micras de diámetro impulsos con una potencia de un 70-90 mW.
        6. Zonas de captura de interés con pulsos de láser infrarrojo en tapas LCM. Combinar celdas de 2-5 tapas para la extracción de miARN por muestra. Para asegurar la integridad del ARN extraído, inmediatamente procesar células capturadas para la extracción de miRNA.
        7. Alternativamente, las células lisan en el tampón de extracción miRNA (de acuerdo con el protocolo del fabricante) y store lisados ​​a -80 ºC.
      2. miARN Extracción y análisis de LCM microdissected tejidos
        1. Extraer el ARN total a partir de tejidos FFPE microdissected utilizando un kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante.
          Nota: El rendimiento de ARN de captura por láser miscrodissection es típicamente baja. Por lo tanto, el ARN se eluye en volúmenes bajos (20-30 l) y utiliza para perfiles de expresión mediante ensayos de expresión de microARN Taqman siguiendo las instrucciones del fabricante (también descrito en la sección 2.2). Optimización de ARN de entrada para la detección en tiempo real PCR de miRNAs maduros sugiere que 5 l del ARN eluido es óptima para cada reacción de transcripción inversa miRNA-específicos. Como un control endógeno, se utiliza RNU48 / RNU24. Para las reacciones de control, 2 l de la ARN eluido se utiliza para la reacción de transcripción inversa.
    2. Aislamiento de miRNA de cáncer de próstata Los tejidos congelados
      1. HomogeNiza tejidos de la próstata resecados congelados moliendo los tejidos en nitrógeno líquido utilizando un mortero. Transferencia de tejido homogeneizado a un tubo de microcentrífuga con una espátula enfriado. Mantener el mortero / mano de mortero y una espátula a la misma temperatura por inmersión en nitrógeno líquido tejido de manera homogeneizada se pueden transferir fácilmente.
      2. Añadir comercial isotiocianato de guanidina-fenol reactivo (1 ml / 0,1 g de tejido) para el tejido se homogeneiza y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min.
        Nota: los tejidos se homogeneizaron en reactivo isotiocianato de guanidina-fenol comercial se pueden almacenar a -80 ºC durante varios meses.
      3. Añadir cloroformo al homogeneizado (0,2 ml de cloroformo / ml) y agitar enérgicamente durante 30 segundos. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 3-5 min seguido de centrifugación a 10.000 xg durante 20 min a 4 ºC.
      4. Pasar la fase acuosa superior a un tubo de 1,5 ml RNasa libre estéril fresco.
      5. Añadir un volumen igual de alcohol isopropílico. Mezclar e incubar durante 10 millasn a temperatura ambiente seguido por centrifugación a 12.000 xg durante 20 min a 4 ºC para sedimentar el ARN.
      6. Aspirar el sobrenadante y lavar el precipitado de ARN con 1 ml de etanol al 70%. Centrifugar a 12000 xg durante 10 min a 4 ºC.
      7. Aspirar con cuidado el sobrenadante. Sedimentos de ARN en seco a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. Disolver ARN en 50-100 agua libre de nucleasa l.
      8. Realizar cuantificación de ARN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop y determinar la integridad del ARN con una bioanalizador. Ajustar las concentraciones de ARN a 10 ng / l. Utilice 10 a 50 ng de ARN para la reacción de ADNc específica miRNA- seguida de análisis en tiempo real PCR (Sección 2.2).
  2. PCR cuantitativa en tiempo real para análisis de expresión de miRNA
    Nota: miRNAs maduros ensayo usando un protocolo de RT-PCR de dos etapas como se describe a continuación.
    1. Transcripción inversa (RT)
      1. Reverse transcribir de ADNc a partir de ARN usando un kit de transcripción inversa miRNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Utilice 10 a 50 ng de ARN total con miARN cebador específico del kit microARN Ensayos y RT. Utilice RNU48 / RNU24 / RNU6B como controles. Diluir cDNA 1: 5 a 1:10 (dependiendo de la abundancia de los genes miARN analizados) y su uso en la detección de PCR en tiempo real como se describe en el siguiente paso.
    2. PCR en tiempo real para la detección de miARN maduro
      1. Amplificar productos de PCR de muestras de cDNA usando los ensayos microARN con una mezcla maestra universal rápida de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Normalizar las muestras a RNU48 / RNU24 de control / RNU6B. Utilice el método comparativo Ct (ciclo umbral) para calcular los cambios relativos en la expresión génica en el rápido tiempo real PCR System. Analizar cada muestra por triplicado.

Los análisis 3. miARN expresión por hibridación in situ (ISH)

  1. Pre-tratamiento de los tejidos
    1. Cortar 5 micras secciones de bloques de tejido de cáncer de próstata FFPE utilizando un micrótomo.
      2. Nota: Los portaobjetos se pueden almacenar a temperatura ambiente durante varias semanas para los análisis de miRNA.
    2. Deparrafinize los tejidos por inmersión de los portaobjetos con xileno (2 x), durante 15 min cada uno.
    3. Rehidratar los tejidos mediante la incubación de los portaobjetos durante 5 min cada uno en etanol graduado (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%) seguido de agua destilada (5 min).
    4. Fijar los portaobjetos con 4% de paraformaldehído en PBS a temperatura ambiente durante 20 min.
    5. Lavar los portaobjetos con PBS (2x) a temperatura ambiente durante 5 min cada uno.
    6. Tratar los portaobjetos con 10 mg / ml de proteinasa K a 37 ºC durante 10 min en tampón de proteinasa K precalentado (Tris-HCL 5 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, NaCl 1 mM).
    7. Después del tratamiento con proteinasa-K, enjuague los portaobjetos con 0,2% de glicina en PBS durante 30 seg.
    8. Lavado de los portaobjetos en PBS (1x) a temperatura ambiente durante 5 min.
    9. Fijar las diapositivas con paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 min.
    10. Enjuague con diapositivasPBS durante 5 min.
  2. La hibridación
    1. Pre-hibridar los portaobjetos con solución de pre-hibridación para 4.3 horas a 55 ºC en una cámara húmeda. Use toallitas de laboratorio de tejido empapado en formamida al 50% / 50% de 5x SSC para mantener la cámara húmeda.
    2. Utilice 5 'sondas marcadas con digoxigenina a una concentración de un 20-50 nM en tampón de hibridación. Diluir sonda-miRNA específico (20-50 nM) y sonda de control U6 ARN nuclear pequeño (20 nm), se calienta a 90 ° C durante 4 minutos, colóquelo en el hielo, y añadir al hielo frío tampón de hibridación (2.4 ng / l ).
    3. Retire la solución de pre-hibridación, añadir solución de hibridación (sonda + tampón de hibridación, 100 l por diapositiva), incubar durante 12 a 16 horas a temperatura de hibridación-sonda específica (temperatura de hibridación = sonda de 21 Tm ºC). Realizar hibridaciones en una cámara humidificada (50% de formamida / 50% 5x SSC).
  3. Pasos de lavado
    1. Lavar los portaobjetos con 2x SSC durante 10 minutos a 45 ºC.
    2. Lavar tse desliza con SSC 1,5x durante 10 minutos a 45 ºC.
    3. Lavar los portaobjetos con SSC 0,2x (2x) a 37 ºC durante 20 minutos cada uno.
    4. Incubar los portaobjetos con solución de bloqueo 1x durante 1-2 horas a temperatura ambiente
  4. Detección
    1. Incubar los portaobjetos con 1: 100 PBS diluido anticuerpo anti-digoxigenina AP-conjugado de 1-4 horas o durante la noche a 4 ºC.
    2. Lavar los portaobjetos con PBS (3x) a temperatura ambiente durante 10 min cada uno.
    3. Se lavan los portas (2x) con fosfatasa alcalina tampón (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM de MgCl 2, NaCl 100 mM, 0,1% de Tween-20) a TA durante 5 min cada uno.
    4. Incubar las diapositivas de sustrato BM púrpura AP en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hasta 20 horas.
    5. Enjuagar los portaobjetos con PBS que contenía 0,1% de Tween-20 y de lavado (2x) en agua.
    6. Montar las diapositivas utilizando un medio de montaje acuoso y examinar con un microscopio.

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Representative Results

Perfiles de expresión de miR-203 en muestras clínicas de cáncer de próstata primario LCM por RT-PCR análisis (Figura 1)

Análisis de RT-PCR de la expresión relativa de miR-203 en LCM tejidos de cáncer de próstata primario y las regiones normales adyacentes emparejados se llevó a cabo como se describe en Saini et al. 15 RNU48 se utilizó como control. La siguiente tabla resume la relativa expresión de miR-203 en los tejidos tumorales de cáncer de próstata en relación con los tejidos normales adyacentes.

Comparación de la expresión de miR-383 por RT-PCR análisis en microdissected vs láser captura microdissected tejidos PCA (Figura 2)

Tejidos de cáncer de próstata se microdissected ya sea bajo el microscopio o se sometieron a LCM seguido por RT-PCR análisis de miR-383 expresión en los tejidos tumorales en relación con emparejado-383 de miR expresión tissues.Relative normal adyacente en muestras de tumoresse shown.RNU48 se utilizó como control. Como se muestra en la Figura 2, se observaron diferencias cuando se analizó la expresión de los genes miARN en estos tejidos. LCM tiene una ventaja sobre microdisección bajo el microscopio, ya que permite el aislamiento de una población relativamente pura de tejidos de la próstata y es más fiable.

ISH análisis de la expresión de miR-203 en los tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata (Figura 3)

La hibridación in situ análisis de la expresión de miR-203 en los tejidos normales y el hueso de próstata metastásico de cáncer se realizó como se describe en Saini et al. 15 próstata microarrays tejido canceroso se utilizó para ISH análisis utilizando 5'-DIG marcado sondas LNA específicas de miR-203 y U6. Ejemplo representativo de análisis de ISH se muestra en la Figura 3, una figura parcialmente reproducido de Saini et al. (2011) 15 Figura 3A y 3B showsmiR-203 expressión (izquierda) y la expresión de control U6 (derecha) en los tejidos indicados. Señales ISH fueron semi-cuantitativamente calificado en base a la intensidad de la tinción y el porcentaje de células teñidas y asignó una puntuación de 1 a 4. Los puntajes de intensidad de miR-203 expresión se dividieron por los de expresión U6 obtener normalizados miR-203 niveles de expresión que se representaron en la Figura 3C.

Figura 1
Figura 1: Expresión de perfiles de miR-203 en muestras clínicas de cáncer de próstata primario LCM por RT-PCR análisis. RT-PCR análisis de relativa expresión de miR-203 en tejidos de cáncer de próstata-LCM y las regiones adyacentes normales emparejados. RNU48 se utilizó como control. La siguiente tabla resume la relativa expresión de miR-203 en los tejidos tumorales de cáncer de próstata en relación con los tejidos normales adyacentes. Haga clic aquípara ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Comparación de la expresión de miR-383 por RT-PCR se analizan en microdissected vs. captura por láser microdissected tejidos CaP tejidos cáncer de próstata fueron microdissected ya sea bajo el microscopio o se sometieron a LCM seguido por RT-PCR análisis de miR-383 en expresión. tejidos tumorales relativos a los tejidos normales adyacentes emparejados. Relativos miR-383 expresiones en muestras tumorales se shown.RNU48 se utilizó como control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3:. ISH análisis de la expresión de miR-203 en los tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata Esta cifra se ha modificado desde el 15. Los tejidos se hibridan con DIG-labellena de ácido nucleico cerrado (LNA) sondas basadas en mir-203 y U6 (control) como se describe en 15. Ejemplo representativo del análisis de ISH de expresión de miR-203 (paneles de la izquierda) y la expresión U6 control (paneles de la derecha) en el cáncer de próstata humano tejidos normales y metastásicas óseas que muestra atenuada miR-203 expresión en tejidos óseos metastásicos. Ejemplos de ISH representativos que se muestran en A con un aumento mayor (40X). Los niveles relativos de expresión de miR-203 en los tejidos prostáticos normales y tejidos de cáncer de próstata metastásico de hueso como evaluados por análisis de ISH. la expresión de miR-203 se anotó, normalizado a la puntuación de U6 y se representa. Línea horizontal representa el valor medio. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este artículo se describe un flujo de trabajo simplificado para la expresión de los genes miARN perfiles de FFPE archivado o tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata congelados frescos. En el cáncer de próstata, varios estudios sugieren un papel importante de microRNAs en cáncer de próstata iniciación, progresión y metástasis. Sin embargo, los resultados en conflicto a menudo se obtuvieron en un miRNA específico 22 desde la extracción y análisis de miRNA métodos difieren ampliamente. En vista de la evidencia emergente apoyar la posible aplicación de miRNAs como biomarcadores de cáncer de próstata alternativos para el pronóstico del cáncer de próstata, el diagnóstico y la terapia, hay una necesidad de cuantificar con precisión los perfiles de expresión de miRNA en tejidos clínicos.

Empleamos una combinación de PCR cuantitativa en tiempo real e hibridación in situ para los análisis de miARN de muestras clínicas de cáncer de próstata. Dentro de este flujo de trabajo, hemos optimizado las metodologías existentes para la extracción de miRNA, expresión analiza por Taqhombre imprimación a base de RT-PCR e ISH análisis por sondas de LNA. Durante todo el flujo de trabajo, es de suma importancia para mantener un ambiente libre de RNasa. Todos los reactivos / soluciones utilizadas deben ser libre de RNasa y la precaución adicional se debe utilizar en el manejo de ARN y otros reactivos. Todas las reacciones en tiempo real deben establecerse en el hielo para reducir al mínimo la degradación del ARN.

Perfiles de expresión precisa en tejidos de cáncer de próstata a menudo se ve obstaculizada por la heterogeneidad y la naturaleza multifocal de lesiones de cáncer de próstata 25. Esto se puede superar mediante el uso de una técnica microdisssection láser de captura que permite la separación de las células epiteliales benignos y malignos y también reduce la contaminación del estroma, lo que permite análisis moleculares aguas abajo precisas de tejidos de la próstata 22,25. Empleamos mcm de tejidos FFPE archivados seguido de la expresión de los genes miARN perfiles mediante ensayos de expresión Taqman microARN que se ha informado que es fidedigna. miARN perfiles de los tejidos LCM ha Signifpotencial icant para mejorar el descubrimiento de biomarcadores miARN. De hecho, hay un considerable interés en el análisis de los tejidos FFPE teniendo en cuenta que estos tejidos son ampliamente utilizados por los patólogos para los análisis clínicos, la preservación y archivo y están fácilmente disponibles 3. También, debido a su pequeño tamaño y resistencia a la actividad de RNasa endógena, miRNAs son relativamente menos afectados por la degradación dependiente de FFPE y son biomarcadores potenciales atractivos 3. Los perfiles de expresión de los genes miARN de tejidos fijados con formalina se han informado de que se correlaciona fuertemente a las de los tejidos congelados 21.

Empleamos y comparamos dos kits comerciales diferentes para la extracción de los tejidos FFPE miARN. Mientras que ambos kits produjeron ARN de alta calidad para el análisis de RT-PCR, se utilizó el que utiliza un protocolo sencillo, simplificado para la purificación constante de miRNAs y ARN total de tejidos FFPE.

La integridad, la pureza y la concentración de RNA should ser probado antes de los análisis de RT-PCR. Las muestras que presenten baja relación A260 / A230 (<1,8) deben volver a precipitar y re-analizados por la pureza antes de usar en una reacción de RT. Además, PCR en tiempo real análisis de los tejidos clínicos pueden necesitar ser optimizado aún más. Ciclo umbral (Ct valores)> 33 indican baja amplificación reflejando baja cDNA plantilla de partida. En este caso, las entradas molde de ADNc se pueden aumentar. Además, es de suma importancia que un control adecuado se utiliza para la normalización y la determinación de cuantificaciones miARN relativos entre los tejidos normales y tumorales. Control endógeno (RNU48 / RNU24 / RNU6B) se elige en base a la uniformidad de las señales de amplificación en condiciones normales vs. muestras tumorales.

Además, se describe un protocolo optimizado para los análisis de miRNA ISH de los tejidos de cáncer de próstata basado en sondas basadas LNA-. Nuestro protocolo miRNA ISH optimizado se puede aplicar a las diapositivas de tejido de cáncer de próstata o el cáncer de próstata microarrays de tejidos (TMA), con este último la oferta potenteial para acelerar el descubrimiento de biomarcadores miARN. Este protocolo también se puede aplicar a otros tipos de tejidos. Sin embargo, puede necesitar ser optimizado la duración de proteinaseKdigestionandparaformaldehydetreatment. Proteinasa K digestión permite la sonda miARN para entrar en las células, mientras que es necesaria la fijación de paraformaldehído para evitar la pérdida de miRNA siguiente permeabilización. Este protocolo, originalmente desarrollado para su uso con sondas LNA 26 está optimizado para obtener una señal específica con el fondo mínimo en los tejidos de la próstata. Las concentraciones de sonda y las condiciones de incubación se optimizan para tejidos de cáncer de próstata. Empleamos 5'digoxigeninlabeledprobes a una concentración de un 20-50 nM dependiendo de la abundancia de los genes miARN. Sin embargo, 3'digoxigeninlabeledprobes y doble etiquetado (5 'y 3') sondas marcadas pueden ser sustituidos. De hecho, sondas marcadas dobles ofrecen el potencial para un mejor desarrollo colorimétrico para la detección microRNA y se recomiendan para la detección de los genes miARN baja abundancia. Además, la duración del bloqueo y de anticuerpos incubaciones se puede optimizar. Se recomienda el bloqueo más largo para el fondo inferior, en particular con miRNAs baja abundancia. Thedurationofcolor reacción con sustrato BM púrpura debe vigilarse estrechamente. Incubaciones más largas pueden generar la tinción de fondo. Por lo general, abundantes miRNAs requieren incubaciones cortas (1-2 horas), mientras que menos abundante miARN se detectan con incubaciones más largas. Durante ISH, es importante asegurarse de que las secciones de tejido no se sequen durante cualquiera de los pasos ya que esto puede dar lugar a artefactos de tinción.

En conclusión, aunque varios estudios sugieren miRNAs como importantes biomarcadores de cáncer de próstata, la importancia de varios de estos estudios a menudo se debate debido a resultados contradictorios. Aquí hemos definido un flujo de trabajo optimizado para la expresión de miRNA precisa analiza en cáncer de próstata muestras clínicas que tienen un potencial de acelerar el descubrimiento de los genes miARN como biomarcadores para el cáncer de próstata. Mientraseste flujo de trabajo tiene un potencial significativo para con precisión el perfil de expresión de miRNA en tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata, hay limitaciones inherentes de las técnicas empleadas. Abundantes miRNAs bajos pueden ser difíciles de perfil con el miARN RT-PCR optimizado y análisis de ISH se describe aquí. Aunque perfiles basados ​​RT-PCR tiene un rango dinámico más amplio que ISH 27,28, cantidades de ARN bajos obtenidos de LCM pueden limitar la detección de miRNAs abundantes bajas. Detección basada en ISH de miRNAs produce poderosa información espacial, sin embargo sus limitaciones son que es una técnica semi-cuantitativa con un rango dinámico menor 28. Esta técnica se basa en la sensibilidad y especificidad de las sondas empleadas y también en la optimización de las condiciones para la hibridación y detección de miRNAs.

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Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Roger Erickson por su apoyo y asistencia en la preparación del manuscrito.

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud

(Número de Grant RO1CA177984; RO1CA138642), el proyecto de programa de VA sobre el cáncer de próstata (BX001604).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microtome Leica Biosystems  RM2255
Arcturus Autopix for LCM Arcturus/ Life Technologies LCM1621/LCM1110 Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. 
CapSure Macro LCM Caps Life Technologies LCM0211
miRNeasy FFPE Kit  Qiagen 217504
7500 Fast Real-time PCR System  Applied Biosystems/ Life Technologies 4351106
Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit  Applied Biosystems/ Life Technologies 4366596
Taqman Fast Universal PCR master mix  Applied Biosystems/ Life Technologies 4352042
DIG labeled LNA probe for U6 Exiqon 99002-01
BM Purple AP substrate Roche 11442074001
Pre-hybridization solution  Biochain K2191050-1
Hybridization solution  Biochain K2191050-2
Blocking solution  Biochain K2191050-8
AP-conjugated anti-digoxigenin antibody Biochain K2191050-7
Aqueous mounting media  Vector Laboratories  H-5501  
Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)  Life Technologies 15596-018
Harris hematoxylin Statlab SL200
Eosin  Statlab SL201 

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References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
  3. Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
  4. Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
  5. Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what's new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
  6. Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
  7. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
  8. Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
  9. Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
  10. Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
  11. Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  12. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
  13. Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
  14. Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
  15. Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
  16. Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
  17. Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
  18. Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
  19. Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
  20. Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
  21. Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
  22. Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
  23. Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
  24. Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
  25. Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
  26. Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
  28. Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).

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Los análisis de expresión de miRNA en tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata
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