전립선 암 임상 조직에서의 miRNA 식 분석

Summary

여기에서는 정량적 실시간 PCR(RT-PCR) 및 ISH(in situ hybridization)를 사용하여 보관된 포르말린 고정, 파라핀 내장(FFPE) 또는 신선 냉동 전립선암(PCa) 임상 조직에서 microRNA(miRNA) 발현 분석을 위한 간소화된 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

전립선 암 (PCA) 임상 관리에서 중요한 과제는 질병 검사, 진단, 예후 및 치료를 위해 현재 사용되는 바이오 마커의 무능력에 의해 제기된다. 최근, 마이크로 RNA (miRNA에)은 전립선 암의 진단 및 예후에 대한 유망한 대체로서 생체 등장했다. 그러나, 전립선 암에 대한 효과적인 생체 등의 miRNAs의 개발은 주로 임상 조직에서의 정확한 검출에 의존한다. miRNA는 종종 종양의 이질성, 샘플링 오류, 간질 오염 등의 miRNA가 조합을 사용하여 아카이브 FFPE 또는 냉동 전립선 암 임상 검체의 분석은이 문서의 목적은 단순화 된 워크 플로우를 설명하는 것입니다 때문에 도전 전립선 암 임상 검체에서 분석 정량 실시간 PCR (RT-PCR) 및 현장 하이브리드에서 (ISH). 이 워크 플로우 내에서, 우리는 FFPE에서 miRNA의 추출을위한 기존의 방법과 냉동 전립선 tissu을 최적화ES 및 표현은 m​​iRNA의 RT-PCR 기반의 TaqMan 프로브에 의해 분석한다. 기반 프로브 - 또, ISH위한 최적화 방식이 고정 된 핵산 (LNA)를 이용하여 전립선 조직에서 formiRNA 검출 분석 기술한다. 우리의 miRNA ISH 최적화 프로토콜은 전립선 암 조직 슬라이드 또는 전립선 암 조직 마이크로 어레이 (TMA)에 적용될 수있다.

Introduction

전립선 암은 남성의 암 관련 사망의 주요 원인 중 하나이며 흔히 진단 남성 악성 종양이다. 미국의 경우는 220,800 새로운 사례를 추정하고 27,540 명이 사망 2015 년 ^{1에보고됩니다.}

전립선 암은 종양이 나태한 또는 매우 공격적이 될 수 코스 - 매우 다양 질환을 가진 이질적인 질환이다. 전립선 암의 임상 관리에서 중요한 과제는 질병 검사, 진단, 예후 및 치료 ⁽²⁾ 현재 사용되는 방법 / 바이오 마커의 무능력에 의해 제기된다. 현재 검사 방법은 전립선 특이 항원 (PSA) 테스트 및 전립선 생검 ^3이어서 직장 수지 검사 (DRE)을 포함한다. 전립선 특이 항원 (PSA)은 크게 개선 된 임상 관리 생존율 ⁴ 혁명에서 가장 널리 사용되는 전립선 암의 표지자이다. 그러나, PSA 포함 락의 본질적인 한계로특이도, PSA 기반 검사의 k는 진단을 통해 질병의 치료를 통해하게되었다. 이러한 관점에서 집중적 인 노력은 대체 전립선 암 바이오 마커에 ​​대한 검색 향해 공격성 질병을 예측하고 더 나은 치료 결정 ^4,5-를 구동 할 수있는 특히 지시되고있다. 지난 몇 년 동안, 마이크로 RNA (miRNA가)는 유망한 대체 전립선 암 바이오....

Protocol

포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 또는 냉동 전립선 암 샘플 SFVAMC로부터 수득 하였다. 샘플 SFVAMC에서 급진적 인 전립선 절제술을받은 전립선 암 환자에서 있었다. 서면 동의서는 모든 환자에서 얻어진 것으로,이 연구는 인간의 연구에 UCSF위원회에 의해 승인되었다. 또는, 전립선 암 조직 마이크로 어레이는 상업적인 출처의 조달과의 miRNA가 ISH하여 분석에 사용 하였다. 분석 된 전립선 암 환자의 임상 병리학 및 후속 정보를 수집 하였다.

1. 조직 샘플

1. H & E는 제조 업체의 프로토콜을 다음과 마이크로톰 및 얼룩을 사용하여 10 μm의 섹션으로 전립선 암 조직 샘플을 잘라.
2. 전립선 암 병소의 식별을위한 스테인드 슬라이드뿐만 아니라 인접한 정상 선의 상피를 검토합니다.
   참고 : 보드 인증 병리학 H & E 염색 슬라이드와 엄마를 검토해야종양 및 정상 영역에 대한 RK. 의 miRNA에 대한 다음 섹션에서 가이드가 정상 영역 대 종양 분석으로 표시된 슬라이드를 사용합니다.

정량 실시간 PCR 2. miRNA의 식 ​​분석

참고 : 레이저 캡처 미세 절제, (의 m....

Results

RT-PCR에 의한 LCM 차 전립선 암 임상 검체 미르-203의 발현 프로파일 분석 (그림 1)

RT-PCR은 LCM 차 전립선 암 조직에서 상대적은 miR-203의 발현을 분석 대조군으로 사용 하였다 Saini 외. RNU48 ^15에 기재된 바와 같이 유사한 인접하는 정상 영역을 행했다. 아래 표는 인접한 정상 조직에 대해 전립선 암 종양 조직에서 상대적은 miR-203의 발현을 요약 한 것이다.

RT-PCR에 의한은 miR-383의 발현 비교 레이저 캡처 PCA 조직을 microdissected 대 microdissected에서 분석 (그림 2)

전립선 암 조직은 어느 현미경 microdissected 하였다 또는 RT-PCR 하였다 LCM을 실시 종양 조직에서 발현은 mi.......

Discussion

이 글에서, 우리는 보관 FFPE 또는 냉동 전립선 암의 임상 조직에서 프로파일 miRNA의 발현에 대한 단순화 된 워크 플로우를 설명합니다. 전립선 암, 몇몇 연구는 전립선 암의 개시, 진행 및 전이에서 마이크로 RNA의 중요한 역할을 시사한다. 그러나, 충돌 결과는 종종 miRNA의 추출 이후 특정 miRNA의 ^22에 얻은 방법은 크게 다르다 분석된다. 전립선 암의 예후, 진단 및 치료를위한 대안적인 전립선 암과 같은 바이오 마커의 miRNAs의 잠재적 애플리케이션을 지원하는 새로운 기록의 관점에서 정확하게 임상 조직에서의 miRNA 발현 프로파일을 정량 할 필요가있다.

miRNA의 전립선 암 임상 검체 분석을 위해 우리는 정량 실시간 PCR 및 현장 하이브리드의 조합을 사용합니다. 이 워크 플로우 내에서, 우리는 miRNA의 추출을 위해 기존의 방법을 최적화, 표현은 DNA 형성 촉매에 의해 분석RT-PCR 및 ISH 기반 남자 프라이.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
마이크로톰	라이카 바이오시스템즈	RM2255
Arcturus Autopix for LCM	Arcturus/ Life Technologies	LCM1621/LCM1110	또는 Life Technolgies의 Arcutus Xt 시스템을 사용할 수 있습니다.
CapSure 매크로 LCM Caps	Life Technologies	LCM0211
miRNeasy FFPE 키트	Qiagen	217504
7500 고속 Real-time PCR 시스템	Applied Biosystems/ Life Technologies	4351106
Taqman MicroRNA 역전사 키트	Applied Biosystems/ Life Technologies	4366596
Taqman Fast Universal PCR 마스터 믹스	Applied Biosystems/ Life Technologies	4352042
DIG 라벨링 LNA 프로브, U6	Exiqon	99002-01
BM Purple AP 기질	Roche	11442074001
사전 하이브리드화 솔루션	Biochain	K2191050-1
하이브리드화 솔루션	바이오체인	K2191050-2
차단 솔루션	Biochain	K2191050-8
AP 복합 항 디곡시제닌 항체	Biochain	K2191050-7
수성 장착 매체	벡터 연구소	H-5501
트리졸(구아니딘 이소티오시아네이트-페놀 시약)	Life Technologies	15596-018
Harris 헤마톡실린	Statlab	SL200
Eosin	스타트랩	SL201