miRNA Expression Analyser i Prostate Cancer Clinical Vev

Abstract

En kritisk utfordring i prostatakreft (PCA) klinisk ledelse utgjøres av utilstrekkelighet i dag brukes biomarkører for sykdom screening, diagnose, prognose og behandling. I de senere årene, microRNAs (mirnas) har dukket opp som lovende alternative biomarkører for prostatakreft diagnose og prognose. Imidlertid har utviklingen av mirnas som effektive biomarkører for prostatakreft sterkt avhengig av deres nøyaktig deteksjon i kliniske vev. miRNA analyser i prostatakreft kliniske prøver er ofte utfordrende på grunn av svulst heterogenitet, utvalgsfeil, stromal forurensning etc. Målet med denne artikkelen er å beskrive en forenklet arbeidsflyt for miRNA analyser i arkivert FFPE eller fersk frosset prostatakreft kliniske prøver ved hjelp av en kombinasjon av kvantitativ real-time PCR (RT-PCR) og in situ hybridisering (ISH). Innenfor denne arbeidsflyten, optimalisere vi de eksisterende metoder for miRNA utvinning fra FFPE og frosset prostata tissues og uttrykk analyser av Taqman-probe basert miRNA RT-PCR. I tillegg beskriver vi en optimalisert metode for ISH analyser formiRNA deteksjon i prostata vev ved hjelp låst nukleinsyre (LNA) - basert sonder. Vår optimalisert miRNA ISH-protokollen kan brukes på prostata kreft vev lysbilder eller prostatakreft microarray (TMA).

Introduction

Kreft i prostata er en vanlig diagnostisert mannlig malignitet som er en av de viktigste årsakene til kreft relatert dødelighet blant menn. I USA, anslagsvis 220,800 nye tilfeller og 27,540 dødsfall vil bli rapportert i 2015 ^en.

Prostatakreft er en heterogen sykdom med svært variabel sykdom kurset svulster kan være lat eller veldig aggressiv. En kritisk utfordring i prostatakreft klinisk ledelse utgjøres av utilstrekkelighet i dag brukes metoder / biomarkører for sykdom screening, diagnose, prognose og behandling ^2. Nåværende screening metoder inkluderer prostataspesifikt antigen (PSA) testing og en digital endetarms eksamen (DRE) etterfulgt av prostatabiopsier ^3. Prostataspesifikt antigen (PSA) er den mest brukte prostatakreft biomarkør som har betydelig revolusjon klinisk ledelse og bedret overlevelse ^4. Men på grunn av iboende begrensninger av PSA inkludert lack av spesifisitet, PSA-basert screening har ført til over diagnose og behandling i løpet av sykdommen. I lys av dette, er intensiv innsats er rettet mot å lete etter alternative prostatakreft biomarkører, spesielt de som kan forutsi aggressiviteten av sykdommen og drive bedre behandling beslutninger ^4,5. I løpet av de siste årene, microRNAs (mirnas) har dukket opp som lovende alternative prostatakreft biomarkører.

MicroRNAs (mirnas) utgjør et evolusjonært konservert klasse av små ikke-kodende RNA som undertrykke genekspresjon post-transcriptionally via sekvensspesifikke interaksjoner med 3'- utranslaterte regioner (UTR) av beslektede mRNA mål. Det er anslått at> 60% av mRNA er konservert mål for mirnas ^6. miRNA gener er lokalisert i intergeniske regioner eller innen introner eller exoner av protein / non-protein kodende gener ^7. Disse genene er fortrinnsvis transkribert av RNA polymerase II i primary mirnas (pri-mirnas, flere kilobaser lang) som danner hårnål formet stammen løkke sekundære strukturer. Disse pri-mirnas blir behandlet i forløper mirnas (pre-mirnas, 60-75 nucleotide lang) som eksporteres til cytoplasma og videre bearbeidet til modne mirnas (18-25 nucleotide lange) ^8-10. mirnas regulere viktige cellulære prosesser, inkludert spredning, utvikling, differensiering og apoptose ^11. Studier tyder på en utbredt feilregulering av miRNA uttrykk profiler i ulike menneskelige maligniteter inkludert prostatakreft ^12-15. miRNA uttrykk profiler har blitt rapportert å være mye dysregulerte i grunnskolen og metastatisk prostatakreft. Altered miRNA uttrykket har blitt koblet med prostatakreft progresjon, aggressivitet og tilbakefall fremhever den prognostiske potensialet miRNAs ^12,14,16-19. En voksende mengde bevis indikerer at mirnas spiller viktige mekanistiske roller i prostatakreft initiering, utvikling, fremdriftion og metastasering. Samlet sett mirnas er fremstår som lovende alternative biomarkører for prostatakreft diagnose og prognose som kan skille mellom normale og kreft vev og hjelp i lagdeling av prostatakreft ^12. Også mirnas er viktige mål for utvikling av effektive behandlingsformer mot prostatakreft ^20.

På grunn av sin lille størrelse og motstand mot endogen RNase aktivitet, mirnas er stabile biomarkører som kan lett oppdages i formalinfiksert vev ²¹ og i prostatabiopsier ^22. Dessuten har ekspresjonsprofiler av mirnas er sammenlignet i frosne og formalinfikserte vev og har blitt funnet å være sterkt korrelert ^21. Imidlertid er miRNA uttrykket profilering i prostatakreft kliniske vev ofte utfordrende på grunn av svulst heterogenitet, utvalgsfeil, stromal forurensning etc. Utviklingen av mirnas som effektive biomarkører for prostatakreft tungt relies på deres nøyaktig deteksjon i kliniske vev. Her beskriver vi en forenklet arbeidsflyt brukes i vår lab for miRNA uttrykket profilering i arkivert FFPE eller fersk frosset prostatakreft kliniske prøver. Vi benytter en kombinasjon av kvantitativ real-time PCR og in situ hybridisering for miRNA analyser av kliniske prøver, med det tidligere, hvilket ga mer kvantitativ informasjon, og den sistnevnte for å visualisere den differensielle ekspresjonen av potensielle biomarkører miRNA i en rekke vev. Innenfor denne arbeidsflyten, optimalisere vi de eksisterende metoder for miRNA utvinning fra FFPE og frosne prostata vev, analyser uttrykk av Taqman-probe basert miRNA RT-PCR og miRNA in situ hybridisering teknikk med låst nukleinsyre (LNA) -baserte sonder ^23. LNA-baserte prober gir økt sensitivitet og spesifisitet i forhold til DNA- eller RNA- prober basert robust og muliggjør påvisning av alle miRNA sekvenser, uavhengig av deres GC-innhold og også tillate diskrimineringsjon av miRNA familier. Vår optimalisert miRNA ISH-protokollen kan brukes på prostata kreft vev lysbilder eller prostatakreft microarray (TMA), med sistnevnte som tilbyr muligheten til å akselerere miRNA biomarkører.

Protocol

Formalinfiksert, parafininnebygd (FFPE) eller fersk frosset prostatakreft prøver ble innhentet fra SFVAMC. Prøvene var fra prostatakreftpasienter som gjennomgikk radikal prostatektomi på SFVAMC. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og studien ble godkjent av UCSF Committee on Human Research. Alternativt ble prostatakreft vev mikromatriser anskaffet fra kommersielle kilder og brukes for miRNA analyser av ISH. Clinicopathological og følge opp informasjon for analysert prostatakreftpasienter ble samlet.

1. vevsprøver

1. Skjær prostata kreft vevsprøver til 10 mikrometer seksjoner ved hjelp av en mikrotom og beis med H & E følge produsentens protokoll.
2. Gjennomgå farget lysbilder for identifisering av prostatakreft foci samt tilstøtende normal kjertel epitel.
   Merk: Et bord sertifisert patolog bør gjennomgå H & E beiset lysbilder og mark for tumor og normale områder. Bruk de merkede lysbildene som guider i de påfølgende avsnittene for miRNA analyser fra tumor vs normale områder.

2. miRNA Expression Analyser av kvantitativ real-time PCR

Merk: Denne arbeidsflyten innebærer følgende: Laser Capture mikrodisseksjon, isolering av total RNA (inkludert miRNA og mRNA), analysering av modne miRNAs bruker TaqMan mikroRNA uttrykk analyser som er beskrevet i de neste avsnittene.

1. RNA Utvinning
   1. Isolering av miRNA fra prostatakreft FFPE- Vev
      1. Laser fangst mikrodisseksjon (LCM)
         Merk: Utfør trinn 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 i avtrekksskap.
         1. Forberede vev lysbilder (10 mikrometer seksjoner) for LCM. Deparrafinize vevssnitt ved bløtlegging i xylen (2 x), i 10 minutter hver, og deretter rehydrere vev ved inkubering av lysbildene i 5 min hver i gradert etanol (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), etterfulgt av destillert vann(5 min).
         2. Etter rehydrering, beis seksjoner med hematoxylin i 30 sek etterfulgt av vann.
         3. Plasser vev i trinn etanol (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (5 min hver) og xylen (5 min).
         4. Tørre lysbilder i en avtrekkshette og deretter plassere i LCM instrument for mikrodisseksjon.
         5. Utfør microdissections med LCM System i samsvar med produsentens instruksjoner ^24. Bruk patolog merket opp lysbilder som guider for identifisering av prostatakreft foci samt tilstøtende normalt vev. Bruke laserstrålen mot et 10-20 mikrometer diameter pulser med en styrke på 70 til 90 mW.
         6. Capture områder av interesse med infrarød laser pulser på LCM caps. Kombiner celler fra 2-5 landskamper for miRNA utvinning per prøve. For å sikre integriteten til ekstrahert RNA, umiddelbart behandle fanget celler for miRNA utvinning.
         7. Alternativt lyse celler i miRNA utvinning buffer (i henhold til produsentens protokoll) og store lysates ved -80 ºC.
      2. miRNA Utvinning og analyser fra LCM microdissected Vev
         1. Utdrag total RNA fra microdissected FFPE- vev ved hjelp av et kommersielt kit følge produsentens instruksjoner.
            Merk: Utbyttet av RNA fra laser capture miscrodissection er vanligvis lav. Derfor er RNA elueres inn lavt volum (20-30 mL) og brukes til uttrykk profilering ved hjelp av Taqman mikroRNA uttrykk analyser følgende produsentens instruksjoner (også beskrevet i kapittel 2.2). Optimalisering av inngangs RNA for sanntids-PCR deteksjon av modne mirnas antyder at 5 ul av den eluerte RNA er optimal for hvert miRNA-spesifikke revers transkripsjonsreaksjon. Som en endogen kontroll, er RNU48 / RNU24 brukt. For kontrollreaksjoner, blir 2 ul av den eluerte RNA anvendt for revers transkripsjonsreaksjon.
   2. Isolering av miRNA fra prostatakreft Frosne Vev
      1. Homogekjenner frosne resekterte prostatavevet ved sliping vev i flytende nitrogen ved anvendelse av en morter og pistill. Overfør homogenisert vev til en mikro rør ved hjelp av et avkjølt slikkepott. Opprettholde morter / støter og spatel ved samme temperatur ved dypping i flytende nitrogen så homogenisert vev kan enkelt overføres.
      2. Legg kommersiell guanidin-isotiocyanat-fenol-reagens (1 ml / 0,1 g vev) til det homogeniserte vev og inkuber ved romtemperatur i 5 min.
         Merk: homogenisert vev i kommersielle guanidinisotiocyanat-fenol reagens kan lagres ved -80 ºC i flere måneder.
      3. Legg kloroform til homogenatet (0,2 ml kloroform / ml) og ristes kraftig i 30 sek. Inkuber prøvene ved romtemperatur i 3-5 minutter, fulgt av sentrifugering ved 10 000 xg i 20 min ved 4 ° C.
      4. Overfør den øvre vandige fasen til en ny steril RNase-fri 1,5 ml rør.
      5. Legge til et like stort volum isopropylalkohol. Bland og inkuber i 10 min ved RT, etterfulgt av sentrifugering ved 12 000 xg i 20 min ved 4 ° C for å pelletere RNA.
      6. Aspirer supernatanten og vask det RNA-pellet med 1 ml 70% etanol. Sentrifuger ved 12000 xg i 10 min ved 4 ° C.
      7. Aspirer nøye supernatanten. Tørr RNA-pellets ved romtemperatur i 5-10 min. Løs opp RNA i 50-100 ul nukleasefritt vann.
      8. Utfør kvantifisering av RNA ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer og bestemme RNA integritet med en Bioanalyzer. Juster RNA-konsentrasjoner til 10 ng / mL. Bruk 10-50 ng RNA for miRNA- bestemt cDNA reaksjon fulgt av real-time PCR-analyser (punkt 2.2).
2. Kvantitativ Real-time PCR for miRNA Expression Analyser
   Merk: Analyse modne mirnas ved hjelp av en to-trinns RT-PCR protokoll som beskrevet nedenfor.
   1. Revers transkripsjon (RT)
      1. Omvendt transkribere cDNA fra RNA ved hjelp av en miRNA revers transkripsjon kit i henhold til produsentens instruksjoner.Bruk 10-50 ng av total RNA med miRNA spesifikk primer fra mikroRNA Analyser og RT kit. Bruk RNU48 / RNU24 / RNU6B som kontroller. Fortynn cDNA 1: 5 til 1:10 (avhengig av kvantiteten av det analyserte miRNA) og bruk i sanntid PCR deteksjon som beskrevet i det etterfølgende trinn.
   2. Real-time PCR for deteksjon av Mature miRNA
      1. Forsterke PCR-produkter fra cDNA prøvene ved hjelp av mikroRNA analyser med en Fast Universal mester mix i samsvar med produsentens anvisninger. Normal prøvene til RNU48 / RNU24 / RNU6B kontroll. Bruk komparativ Ct (terskel syklus) metode for å beregne de relative endringer i genuttrykk på Fast Real Time PCR System. Analyser hver prøve in triplo.

3. miRNA Expression Analyser av in situ hybridisering (ISH)

1. Pre-Treatment of Vev
   1. Skjær 5 mikrometer seksjoner fra FFPE prostatakreft vevsblokker bruker en mikrotom.
   Merk: Objektglassene kan lagres ved romtemperatur i flere uker for miRNA analyser.
   2. Deparrafinize vev ved å dyppe objektglassene med xylen (2 x), i 15 minutter hver.
   3. Rehydrere vev ved inkubering av lysbildene i 5 min hver i gradert etanol (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%), etterfulgt av destillert vann (5 min).
   4. Fest lysbilder med 4% paraformaldehyd i PBS ved romtemperatur i 20 min.
   5. Vask objektglassene med PBS (2x) ved romtemperatur i 5 min hver.
   6. Behandle objektglassene med 10 ug / ml proteinase K ved 37 ° C i 10 minutter i forvarmet proteinase K-buffer (5 mM Tris-HCL pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCl).
   7. Etter proteinase-K behandling, skyll lysbildene med 0,2% glysin i PBS i 30 sek.
   8. Vask objektglass i PBS (1 x) ved romtemperatur i 5 min.
   9. Fest lysbilder med 4% Paraformaldehyde i PBS i 15 min.
   10. Skyll lysbilder medPBS i 5 min.
2. Hybridisering
   1. Pre-hybridisere objektglassene med pre-hybridisering løsning i 3-4 timer ved 55 ° C i et fuktet kammer. Bruk vev lab kluter fuktet i 50% formamid / 50% 5x SSC for å holde kammeret fuktet.
   2. Bruke 5 'digoksigenin-merkede prober i en konsentrasjon på 20 til 50 nM i hybridiseringsbuffer. Fortynne miRNA-spesifikk probe (20-50 nM) og små kjernefysiske RNA U6 kontroll probe (20 nM), varme ved 90 ºC i 4 min, legg det på is, og legge til is kaldt hybridiseringsbuffer (2-4 ng / mL ).
   3. Fjern prehybridisering løsning, tilsett hybridiseringsoppløsning (probe + hybridisering buffer, 100 ul pr lysbilde), inkuberes i 12-16 timer ved probe-spesifikk hybridisering temperatur (Hybridisering temperatur = Tm probe-21 ° C). Utføre hybridiseringer i et fuktet kammer (50% formamid / 50% 5x SSC).
3. Vaske Steps
   1. Vask objektglassene med 2 x SSC i 10 minutter ved 45 ° C.
   2. Vask than glir med 1,5x SSC i 10 minutter ved 45 ºC.
   3. Vask lysbildene med 0,2x SSC (2x) ved 37 ºC i 20 minutter hver.
   4. Inkuber objektglass med 1x blokkeringsoppløsningen i 1-2 timer ved romtemperatur
4. Detection
   1. Inkuber lysbilder med 1: 100 PBS fortynnet AP-konjugert anti-digoxigenin antistoff for 1-4 timer eller over natten ved 4 ºC.
   2. Vask objektglassene med PBS (3 x) ved romtemperatur i 10 minutter hver.
   3. Vask objektglassene (2x) med alkalisk fosfatase-buffer (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM _MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20) ved RT i 5 min hver.
   4. Inkuber objektglassene i BM Blue AP substratet i mørke ved romtemperatur i 1-20 timer.
   5. Skyll lysbildene med PBS inneholdende 0,1% Tween-20 og vask (2x) i vann.
   6. Monter lysbilder ved hjelp av en vandig monterings media og undersøke under et mikroskop.

Representative Results

Expression profilering av Mir-203 i LCM primære prostatakreft kliniske prøver ved RT-PCR-analyser (figur 1)

RT-PCR-analyser av relativ Mir-203-ekspresjon i LCM primære prostata kreftvev og de ​​tilpassede tilstøtende normale områder ble utført som beskrevet i Saini et al. ¹⁵ RNU48 ble anvendt som en kontroll. Tabellen nedenfor oppsummerer den relative Mir-203 uttrykk i prostatakreft tumorvev i forhold til tilstøtende normalt vev.

Sammenligning av Mir-383 uttrykk ved RT-PCR-analyser i microdissected vs laser capture microdissected PCA vev (figur 2)

Prostata kreftvev ble enten microdissected under mikroskop, eller ble underkastet LCM fulgt av RT-PCR-analyser av Mir-383-ekspresjon i tumorvevet i forhold til matchet tilstøtende normalt tissues.Relative Mir-383-ekspresjon i tumorprøverblir shown.RNU48 ble anvendt som en kontroll. Som vist i figur 2, ble forskjeller observert når miRNA ekspresjon ble analysert i disse vevene. LCM har en fordel over microdissection henhold mikroskop som det tillater isolering av en forholdsvis ren populasjon av prostata vev og er mer pålitelig.

ISH analyser av Mir-203 uttrykk i prostatakreft kliniske vev (figur 3)

In situ hybridisering analyser av Mir-203 ekspresjon i normale og beinmetastatisk prostata kreftvev ble utført som beskrevet i Saini et al., ¹⁵ prostata kreftvev mikroarray ble brukt for ISH analyser med 5'-DIG-merket LNA prober som er spesifikke for Mir-203 og U6. Representativt eksempel på ISH analyser er vist i figur 3, et tall delvis gjengitt fra Saini et al. (2011) ¹⁵ Figur 3A og 3B showsmiR-203 expresSion (til venstre) og U6 kontroll uttrykk (til høyre) i de angitte vev. ISH signalene var semi-kvantitativt gradert basert på intensiteten av fargingen og prosent av fargede celler og tilordnet en score på 1 til 4. intensitetspoeng av Mir-203 ekspresjon ble dividert med de av U6 uttrykk for å oppnå normalisert Mir-203 ekspresjonsnivåer som ble plottet i Figur 3C.

Figur 1: Ekspresjon profilering av Mir-203 i LCM primære prostatakreft kliniske prøver ved hjelp av RT-PCR-analyser. RT-PCR analyse av relativ Mir-203 uttrykk i LCM-prostatakreft vev og de matchet tilstøtende normale regioner. RNU48 ble anvendt som en kontroll. Tabellen nedenfor oppsummerer den relative Mir-203 uttrykk i prostatakreft tumorvev i forhold til tilstøtende normalt vev. Klikk herfor å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Sammenligning av Mir-383-ekspresjon ved RT-PCR-analyser i microdissected vs. laser capture microdissected PCA vev prostata kreftvev ble enten microdissected under mikroskop, eller ble underkastet LCM fulgt av RT-PCR-analyser av Mir-383-ekspresjon i. tumorvev i forhold til passet tilstøtende normalt vev. Relative Mir-383 uttrykk i tumorprøver er shown.RNU48 ble brukt som kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3:. ISH analyser av Mir-203 uttrykk i prostatakreft kliniske vev Dette tallet har blitt forandret fra ^15. Vev ble hybridisert med DIG-labelled låst nukleinsyre (LNA) baserte prober for mir-203 og U6 (kontroll), som beskrevet i ^15. Representativt eksempel på ISH analyse av Mir-203 uttrykk (venstre panel) og kontroll U6 uttrykk (høyre panel) i menneskelig prostatakreft normale og bein metastatisk vev som viser svekket Mir-203 uttrykk i bein metastatisk vev. Representative ISH eksempler vist i A på et høyere forstørrelse (40X). Relative Mir-203 uttrykk nivåer i normal prostata vev og bein metastatisk prostatakreft vev som vurderes av ISH analyse. Mir-203 uttrykk ble scoret, normalisert til U6 score og plottet. Horisontal linje representerer gjennomsnittsverdien. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

I denne artikkelen beskriver vi en forenklet arbeidsflyt for miRNA uttrykket profilering i arkivert FFPE eller fersk frosset prostatakreft kliniske vev. I prostatakreft, flere studier antyder en viktig rolle microRNAs i prostatakreft initiering, progresjon og metastasering. Imidlertid er motstridende resultater ofte oppnås på en bestemt miRNA ²² siden miRNA utvinning og analyserer metoder variere mye. I lys av den nye bevis som støtter den potensielle anvendelsen av mirnas som alternative prostata kreft biomarkører for prostatakreft prognose, diagnose og terapi, det er et behov for nøyaktig å kvantifisere miRNA ekspresjonsprofiler i kliniske vev.

Vi benytter en kombinasjon av kvantitativ real-time PCR og in situ hybridisering for miRNA analyser av prostatakreft kliniske prøver. Innenfor denne arbeidsflyten, vi optimalisert de eksisterende metoder for miRNA utvinning, analyser uttrykk ved TaqMannen primer basert RT-PCR og ISH analyser av LNA sonder. Under hele arbeidsflyten, er det av største betydning for å opprettholde en RNase fritt miljø. Alle reagenser / løsninger som brukes bør RNase fri og ekstra forsiktighet bør brukes ved håndtering av RNA og andre reagenser. Alle sanntid reaksjoner bør settes opp på isen for å minimere RNA degradering.

Nøyaktig uttrykk profilering i prostata kreft vev blir ofte hindret av heterogenitet og multifokal natur prostatakreft lesjoner ^25. Dette kan overvinnes ved hjelp av en laser-capture microdisssection teknikk som tillater separasjon av benigne og maligne epitelceller, og reduserer også forurensning stromal, slik at nøyaktige nedstrøms molekylære analyser av prostata vev ^22,25. Vi benytter LCM av arkiv FFPE- vev fulgt av miRNA uttrykket profilering ved hjelp av Taqman mikroRNA uttrykk analyser som har blitt rapportert å være pålitelig. miRNA profilering av LCM vev har significant potensial for å forbedre miRNA biomarkører. Faktisk, det er betydelig interesse i å analysere FFPE- vev med tanke på at disse vev er mye brukt av patologer for kliniske analyser, bevaring og arkivering, og er lett tilgjengelig ^3. Også, på grunn av sin lille størrelse og motstand mot endogen RNase aktivitet, mirnas er relativt mindre påvirket av FFPE avhengig nedbrytning og er attraktive potensielle biomarkører ^3. De miRNA ekspresjonsprofiler av formalinfikserte vev har blitt rapportert å være sterkt korrelert til de av frosne vev ^21.

Vi ansatt og sammenlignet to ulike kommersielle kits for miRNA utvinning fra FFPE- vev. Mens begge kits ga høy kvalitet RNA for RT-PCR-analyser, brukte vi en som bruker en enkel, strømlinjeformet protokoll for konsekvent rensing av mirnas og total RNA fra FFPE- vev.

Integritet, renhet og konsentrasjon av RNA should testes før RT-PCR-analyser. Prøver som viser lav A260 / A230 ratio (<1,8) bør re-utfelt og re-analysert for renhet før du bruker i en RT reaksjon. Også analyser real-time PCR av kliniske vev kan trenge å bli ytterligere optimalisert. Terskel syklus (Ct-verdier)> 33 indikerer lav forsterkning reflekterer lav start cDNA mal. I dette tilfellet kan cDNA-mal innganger økes. Dessuten er det av største betydning at tilstrekkelig kontroll brukes for å normalisere og bestemme relative miRNA quantifications mellom normale og tumorvev. Endogen kontroll (RNU48 / RNU24 / RNU6B) blir valgt basert på jevnheten av forsterkningssignaler på normal vs. tumorprøver.

Også beskriver vi en optimalisert protokoll for miRNA ISH analyser av prostata kreft vev basert på LNA- basert sonder. Vår optimalisert miRNA ISH-protokollen kan brukes til prostatakreft vev lysbilder eller prostatakreft microarray (TMA), med sistnevnte tilbyr den potenteial å akselerere miRNA biomarkører. Denne protokollen kan også anvendes på andre typer vev. Imidlertid kan varigheten av proteinaseKdigestionandparaformaldehydetreatment må optimaliseres. Proteinase K fordøyelsen gjør at miRNA probe for å komme inn i cellene mens paraformaldehyde fiksering er nødvendig for å hindre at miRNA tap etter permeabilization. Denne protokollen, opprinnelig utviklet for bruk med LNA prober ²⁶ er optimalisert for å få et bestemt signal med minimal bakgrunns i prostatavevet. Probe konsentrasjoner og inkuberingsbetingelser er optimalisert for prostata kreft vev. Vi benytter 5'digoxigeninlabeledprobes ved en konsentrasjon på 20 til 50 nM avhengig av overflod av miRNA. Imidlertid 3'digoxigeninlabeledprobes og dual-merket (5 'og 3') merkede prober kan være substituert. Faktisk to merkede prober tilby potensialet for bedre kolo utvikling for mikroRNA deteksjon og anbefales for lav overflod miRNA deteksjon. Dessuten kan varigheten av blokkering og antistoff inkuberingene optimaliseres. Lengre blokkering er anbefalt for lavere bakgrunn, spesielt med lav overflod mirnas. Thedurationofcolor reaksjon med BM lilla underlaget bør overvåkes nøye. Lengre inkuberinger kan generere bakgrunnsfarging. Vanligvis rikelig mirnas krever kortere inkuberinger (1-2 time) mens mindre rikelig miRNA oppdages med lengre inkuberingene. Under ISH, er det viktig å sikre at vevssnittene ikke tørker ut under noen av trinnene, da dette kan føre til flekker gjenstander.

I konklusjonen, men flere studier tyder mirnas som viktige prostatakreft biomarkører, er betydningen av flere av disse studiene ofte debattert på grunn av motstridende resultater. Her har vi definert en optimalisert arbeidsflyt for nøyaktig miRNA uttrykket analyser i prostatakreft kliniske prøver som har et potensial til å akselerere funn av miRNA som biomarkører for prostatakreft. Mensdenne arbeidsflyten har betydelig potensial for nøyaktig profil miRNA uttrykket i prostatakreft kliniske vev, det er iboende begrensninger i teknikker ansatt. Lave rikelig mirnas kan være vanskelig å profilere med optimalisert miRNA RT-PCR og ISH analyser beskrevet her. Selv om RT-PCR baserte profilering har et bredere dynamisk område enn ISH ^27,28 kan lave RNA mengder hentet fra LCM begrense påvisning av lave rikelig miRNAs. ISH-basert deteksjon av mirnas gir kraftige romlig informasjon er imidlertid sine begrensninger er at det er en semi-kvantitativ teknikk med et mindre dynamisk område ^28. Denne teknikk er avhengig av sensitiviteten og spesifisiteten til probene som anvendes, og også på optimalisering av betingelser for hybridisering og påvisning av miRNAs.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Leica Biosystems	RM2255
Arcturus Autopix for LCM	Arcturus/ Life Technologies	LCM1621/LCM1110	Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used.
CapSure Macro LCM Caps	Life Technologies	LCM0211
miRNeasy FFPE Kit	Qiagen	217504
7500 Fast Real-time PCR System	Applied Biosystems/ Life Technologies	4351106
Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit	Applied Biosystems/ Life Technologies	4366596
Taqman Fast Universal PCR master mix	Applied Biosystems/ Life Technologies	4352042
DIG labeled LNA probe for U6	Exiqon	99002-01
BM Purple AP substrate	Roche	11442074001
Pre-hybridization solution	Biochain	K2191050-1
Hybridization solution	Biochain	K2191050-2
Blocking solution	Biochain	K2191050-8
AP-conjugated anti-digoxigenin antibody	Biochain	K2191050-7
Aqueous mounting media	Vector Laboratories	H-5501
Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)	Life Technologies	15596-018
Harris hematoxylin	Statlab	SL200
Eosin	Statlab	SL201