Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

प्रोस्टेट कैंसर के नैदानिक ​​ऊतकों में miRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण

Published: September 8, 2015 doi: 10.3791/53123
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Urology, Veterans Affairs Medical Center, San Francisco, University of California San Francisco

Abstract

प्रोस्टेट कैंसर (पीसीए) नैदानिक ​​प्रबंधन में एक महत्वपूर्ण चुनौती रोग जांच, निदान, रोग का निदान और उपचार के लिए वर्तमान में इस्तेमाल किया बायोमार्कर की अपर्याप्तता से उत्पन्न कर रहा है। हाल के वर्षों में, microRNAs (miRNAs) प्रोस्टेट कैंसर के निदान और रोग का निदान के लिए के रूप में होनहार वैकल्पिक बायोमार्कर में उभरा है। हालांकि, प्रोस्टेट कैंसर के लिए प्रभावी बायोमार्कर के रूप में miRNAs की विकास भारी नैदानिक ​​ऊतकों में उनकी सटीक पता लगाने पर निर्भर करता है। miRNA अक्सर ट्यूमर विविधता, नमूने त्रुटियों, स्ट्रोमल संदूषण आदि miRNA एक संयोजन का उपयोग करते हुए संग्रहीत FFPE या ताजा जमे हुए प्रोस्टेट कैंसर नैदानिक ​​नमूनों में विश्लेषण के लिए इस लेख के लक्ष्य के लिए एक सरल कार्यप्रवाह वर्णन करने के लिए है के कारण चुनौती दे रहा है प्रोस्टेट कैंसर नैदानिक ​​नमूनों में विश्लेषण करती है मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (आरटी पीसीआर) और स्वस्थानी संकरण में (ISH)। इस कार्यप्रवाह के भीतर, हम FFPE से miRNA निकासी के लिए मौजूदा तरीके और जमे हुए प्रोस्टेट tissu अनुकूलनतों और अभिव्यक्ति miRNA आरटी पीसीआर आधारित TaqMan जांच से विश्लेषण करती है। आधारित जांच - इसके अलावा, हम ISH के लिए एक अनुकूलित विधि बंद कर दिया न्यूक्लिक एसिड (LNA) का उपयोग कर प्रोस्टेट ऊतकों में formiRNA का पता लगाने का विश्लेषण करती है का वर्णन है। हमारे अनुकूलित miRNA ISH प्रोटोकॉल प्रोस्टेट कैंसर ऊतक स्लाइड या प्रोस्टेट कैंसर ऊतक (टीएमए) के लिए आवेदन किया जा सकता है।

Introduction

प्रोस्टेट ग्रंथि के कैंसर पुरुषों में कैंसर से संबंधित मृत्यु दर के प्रमुख कारणों में से एक है कि एक सामान्य निदान पुरुष द्रोह है। अमेरिका में, एक 220,800 नए मामलों का अनुमान है और 27,540 लोगों की मृत्यु 2015 1 में सूचित किया जाएगा।

प्रोस्टेट कैंसर के ट्यूमर अकर्मण्य या बहुत आक्रामक हो सकते हैं पाठ्यक्रम अत्यधिक चर रोग के साथ एक विषम रोग है। प्रोस्टेट कैंसर के नैदानिक ​​प्रबंधन में एक महत्वपूर्ण चुनौती रोग जांच, निदान, रोग का निदान और उपचार के 2 के लिए वर्तमान में इस्तेमाल किया तरीकों / बायोमार्कर की अपर्याप्तता से उत्पन्न कर रहा है। वर्तमान स्क्रीनिंग तरीकों प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन (पीएसए) के परीक्षण और प्रोस्टेट बायोप्सी 3 के बाद एक डिजिटल गुदा परीक्षा (DRE) शामिल हैं। प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन (पीएसए) काफी नैदानिक ​​प्रबंधन और बेहतर जीवित रहने की दर 4 क्रांति ला दी है कि सबसे अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल प्रोस्टेट कैंसर बायोमार्कर है। हालांकि, पीएसए सहित लाख के निहित सीमाओं कोविशिष्टता, पीएसए आधारित स्क्रीनिंग की कश्मीर निदान पर और रोग के इलाज पर करने के लिए प्रेरित किया है। इसे देखते हुए, गहन प्रयासों, वैकल्पिक प्रोस्टेट कैंसर बायोमार्कर के लिए एक खोज की दिशा में रोग की आक्रामकता की भविष्यवाणी और बेहतर इलाज के फैसले 4,5 ड्राइव कर सकते हैं, जो विशेष रूप से उन का निर्देश दिया जा रहा है। पिछले कुछ वर्षों में, microRNAs (miRNAs) होनहार वैकल्पिक प्रोस्टेट कैंसर बायोमार्कर के रूप में उभरा है।

MicroRNAs (miRNAs) आत्मीय mRNA लक्ष्य की 3'- ग़ैर-अनुवादित क्षेत्रों (UTRs) के साथ अनुक्रम विशिष्ट बातचीत के माध्यम से पोस्ट-transcriptionally जीन अभिव्यक्ति को दबाने कि छोटे गैर-कोडिंग RNAs के एक evolutionarily संरक्षित वर्ग का गठन। यह mRNAs का 60% miRNAs 6 के लक्ष्यों को संरक्षित कर रहे हैं> कि अनुमान है। miRNA जीन intergenic क्षेत्रों में या इंट्रोन्स या जीन 7 प्रोटीन कोडिंग / गैर प्रोटीन की एक्सॉनों के भीतर स्थित हैं। इन जीनों अधिमान्यतया प्राइमा में शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय द्वारा लिखित रहे हैंRY miRNAs (पंचायती राज-miRNAs, कई kilobases लंबे) है कि फार्म के लिये कांटा के आकार स्टेम पाश माध्यमिक संरचनाओं। ये पंचायती राज-miRNAs कोशिका द्रव्य को निर्यात किया है और आगे 8-10 (18-25 न्यूक्लियोटाइड लंबे) परिपक्व miRNAs में कार्रवाई कर रहे हैं कि अग्रदूत miRNAs (60-75 न्यूक्लियोटाइड लंबे पूर्व miRNAs,) में कार्रवाई कर रहे हैं। miRNAs प्रसार, विकास, भेदभाव और apoptosis 11 सहित प्रमुख सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित। अध्ययन में प्रोस्टेट कैंसर 12-15 सहित विभिन्न मानव दुर्दमताओं में miRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल के एक बड़े पैमाने पर अनियंत्रण सुझाव देते हैं। miRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल व्यापक रूप से प्राथमिक और मेटास्टेटिक प्रोस्टेट कैंसर में dysregulated होने की सूचना दी गई है। बदल miRNA अभिव्यक्ति miRNAs 12,14,16-19 के शकुन संभावित प्रकाश डाला प्रोस्टेट कैंसर की प्रगति, आक्रामकता और पुनरावृत्ति के साथ जोड़ा गया है। सबूत के एक बढ़ती शरीर miRNAs प्रोस्टेट कैंसर दीक्षा, विकास, प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं यंत्रवत इंगित करता है किआयन और मेटास्टेसिस। कुल मिलाकर, miRNAs प्रोस्टेट ट्यूमर 12 के स्तरीकरण में सामान्य और कैंसर के ऊतकों और सहायता के बीच भेद कर सकते हैं कि प्रोस्टेट कैंसर के निदान और रोग का निदान के लिए के रूप में होनहार वैकल्पिक बायोमार्कर में उभर रहे हैं। इसके अलावा, miRNAs प्रोस्टेट कैंसर के 20 के खिलाफ प्रभावी चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य कर रहे हैं।

अंतर्जात RNase गतिविधि के लिए उनके छोटे आकार और प्रतिरोध के कारण, miRNAs आसानी formalin तय ऊतकों 21 में और प्रोस्टेट बायोप्सी 22 में पता लगाया जा सकता है कि स्थिर बायोमार्कर हैं। इसके अलावा, miRNAs की अभिव्यक्ति प्रोफाइल तय जमे हुए और formalin ऊतकों में तुलना की गई है और जोरदार होना 21 सहसंबद्ध पाया गया है। हालांकि, प्रोस्टेट कैंसर नैदानिक ​​ऊतकों में रूपरेखा miRNA अभिव्यक्ति अक्सर आदि प्रोस्टेट कैंसर भारी धर्म के लिए प्रभावी बायोमार्कर के रूप में miRNAs की विकास ट्यूमर विविधता, नमूने त्रुटियों, स्ट्रोमल संदूषण के कारण चुनौती दे रहा हैनैदानिक ​​ऊतकों में उनकी सटीक पता लगाने पर तों। यहाँ हम संग्रहीत FFPE या ताजा जमे हुए प्रोस्टेट कैंसर नैदानिक ​​नमूनों में रूपरेखा miRNA अभिव्यक्ति के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है एक सरल कार्यप्रवाह का वर्णन है। हम मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का एक संयोजन को रोजगार और miRNA के लिए स्वस्थानी संकरण में पूर्व उपज अधिक मात्रात्मक जानकारी और ऊतकों की एक सरणी में संभावित miRNA बायोमार्कर का अंतर अभिव्यक्ति दृश्यमान करने के लिए बाद के साथ, नैदानिक ​​नमूनों का विश्लेषण करती है। इस कार्यप्रवाह के भीतर, हम FFPE और जमे हुए प्रोस्टेट ऊतकों से miRNA निकासी के लिए मौजूदा तरीके में अनुकूलन, अभिव्यक्ति जांच 23 आधारित बंद कर दिया न्यूक्लिक एसिड (LNA) का उपयोग miRNA आरटी पीसीआर और miRNA सीटू संकरण तकनीक में आधारित TaqMan जांच से विश्लेषण करती है। LNA आधारित जांच DNA- या RNA- आधारित जांच की तुलना में वृद्धि की संवेदनशीलता और विशिष्टता प्रदान करते हैं और उनके जीसी सामग्री की परवाह किए बिना, सभी miRNA दृश्यों के मजबूत पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है और यह भी discrimina की अनुमति देते हैंmiRNA परिवारों के tion। हमारे अनुकूलित miRNA ISH प्रोटोकॉल miRNA बायोमार्कर की खोज में तेजी लाने की क्षमता की पेशकश उत्तरार्द्ध के साथ, प्रोस्टेट कैंसर के ऊतकों स्लाइड या प्रोस्टेट कैंसर ऊतक (टीएमए) के लिए आवेदन किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Formalin तय, आयल एम्बेडेड (FFPE) या ताजा जमे हुए प्रोस्टेट कैंसर के नमूनों SFVAMC से प्राप्त किया गया। नमूने SFVAMC पर कट्टरपंथी prostatectomy कराना पड़ा है जो प्रोस्टेट कैंसर के रोगियों में से थे। लिखित सूचित सहमति सभी रोगियों से प्राप्त हुई थी और अध्ययन मानव अनुसंधान पर UCSF समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। वैकल्पिक रूप से, प्रोस्टेट कैंसर के ऊतकों प्रोटीन वाणिज्यिक सूत्रों से प्राप्त और miRNA ISH द्वारा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया। विश्लेषण किया प्रोस्टेट कैंसर रोगियों के लिए clinicopathological और अनुवर्ती कार्रवाई के बारे में जानकारी एकत्र किया गया था।

1. ऊतक के नमूने

  1. एच एंड ई निर्माता प्रोटोकॉल का पालन के साथ एक सूक्ष्म और दाग का उपयोग कर 10 माइक्रोन वर्गों में प्रोस्टेट कैंसर के ऊतकों के नमूनों में कटौती।
  2. प्रोस्टेट कैंसर के foci के पहचान के लिए दाग स्लाइड के रूप में अच्छी तरह से सटे सामान्य ग्रंथियों के उपकला की समीक्षा करें।
    नोट: एक बोर्ड प्रमाणित रोगविज्ञानी एच एंड ई दाग स्लाइड और एमए की समीक्षा करनी चाहिएट्यूमर और सामान्य क्षेत्रों के लिए आर। MiRNA के लिए आने वाले खंड में गाइड सामान्य क्षेत्रों बनाम ट्यूमर से विश्लेषण करती है के रूप में चिह्नित स्लाइड्स का प्रयोग करें।

मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा 2. miRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण

नोट: लेजर कैद microdissection, (miRNA और mRNA सहित) कुल शाही सेना के अलगाव, निम्न वर्गों में विस्तृत रूप TaqMan microRNA अभिव्यक्ति assays का उपयोग परिपक्व miRNAs की परख करने की क्रिया: इस कार्यप्रवाह निम्नलिखित कदम शामिल है।

  1. शाही सेना निकालना
    1. प्रोस्टेट कैंसर FFPE ऊतकों से miRNA के अलगाव
      1. लेजर कब्जा microdissection (एलसीएम)
        नोट: चरणों का प्रदर्शन 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 एक रासायनिक धूआं हुड में।
        1. एलसीएम के लिए ऊतक स्लाइड (10 माइक्रोन वर्गों) तैयार करें। 10 मिनट प्रत्येक के लिए, (2x) ज़ाइलीन में भिगोने से Deparrafinize ऊतक वर्गों, तो आसुत द्वारा पीछा वर्गीकृत इथेनॉल (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) में प्रत्येक 5 मिनट के लिए स्लाइड incubating द्वारा ऊतकों rehydrate पानी(5 मिनट)।
        2. पुनर्जलीकरण के बाद, 30 सेकंड के लिए hematoxylin साथ दाग वर्गों के पानी से पीछा किया।
        3. प्लेस वर्गीकृत इथेनॉल में ऊतकों (70%, 95% से 90%, 80%, 70%) (5 मिनट प्रत्येक) और xylene (5 मिनट)।
        4. तो सूखी एक धूआं हुड में स्लाइड और microdissection के लिए एलसीएम साधन में जगह है।
        5. निर्माता के निर्देशों 24 के अनुसार एलसीएम सिस्टम के साथ microdissections प्रदर्शन करते हैं। उपयोग रोगविज्ञानी प्रोस्टेट कैंसर foci के पहचान के रूप में अच्छी तरह से सटे सामान्य ऊतकों के लिए मार्गदर्शक के रूप में स्लाइड के रूप में चिह्नित। 70-90 मेगावाट की शक्ति के साथ एक 10-20 माइक्रोन व्यास दालों पर लेजर बीम का उपयोग करें।
        6. एलसीएम टोपियां पर अवरक्त लेजर दालों के साथ ब्याज की कैद क्षेत्रों में। नमूना प्रति miRNA निकासी के लिए 2-5 टोपियां से कोशिकाओं का मिश्रण। तुरंत निकाले शाही सेना की अखंडता को सुनिश्चित miRNA निकासी के लिए कब्जा कर लिया कोशिकाओं प्रक्रिया के लिए।
        7. वैकल्पिक रूप से, miRNA निष्कर्षण बफर में ल्य्से कोशिकाओं (निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार) और sto-80 डिग्री सेल्सियस पर lysates रहे हैं।
      2. एलसीएम microdissected ऊतकों से miRNA निष्कर्षण एवं विश्लेषण
        1. निर्माता के निर्देशों का पालन एक वाणिज्यिक किट का उपयोग microdissected FFPE ऊतकों से कुल शाही सेना निकालें।
          नोट: लेजर कब्जा miscrodissection से शाही सेना की उपज आम तौर पर कम है। इसलिए, आरएनए कम मात्रा (20-30 μl) में eluted और निर्माता के निर्देशों का पालन TaqMan microRNA अभिव्यक्ति assays का उपयोग अभिव्यक्ति की रूपरेखा (धारा 2.2 में वर्णित) के लिए प्रयोग किया जाता है। परिपक्व miRNAs की वास्तविक समय पीसीआर का पता लगाने के लिए इनपुट शाही सेना के अनुकूलन eluted शाही सेना के 5 μl प्रत्येक miRNA-विशिष्ट रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए इष्टतम है कि पता चलता है। एक अंतर्जात नियंत्रण के रूप में, RNU48 / RNU24 प्रयोग किया जाता है। नियंत्रण प्रतिक्रियाओं के लिए, eluted शाही सेना के 2 μl रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए प्रयोग किया जाता है।
    2. प्रोस्टेट कैंसर के फ्रोजन ऊतकों से miRNA के अलगाव
      1. Homogeएक मोर्टार और मूसल का उपयोग तरल नाइट्रोजन में ऊतकों पीस द्वारा जमे हुए उच्छेदन प्रोस्टेट ऊतकों nize। एक ठंडा रंग का उपयोग कर एक microcentrifuge ट्यूब homogenized ऊतक स्थानांतरण। आसानी से स्थानांतरित किया जा सकता तरल नाइट्रोजन इसलिए homogenized ऊतक में सूई से ही तापमान पर मोर्टार / मूसल और रंग को बनाए रखें।
      2. Homogenized ऊतक के लिए वाणिज्यिक guanidine आइसोथियोसाइनेट फिनोल अभिकर्मक (ऊतक के 1 मिलीग्राम / 0.1 ग्राम) जोड़ें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
        नोट: वाणिज्यिक guanidine आइसोथियोसाइनेट फिनोल अभिकर्मक में homogenized ऊतकों कई महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
      3. Homogenate (0.2 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म / एमएल) के लिए क्लोरोफॉर्म जोड़ें और 30 सेकंड के लिए सख्ती से हिला। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 10,000 XG पर centrifugation द्वारा पीछा 3-5 मिनट के लिए आरटी पर नमूने सेते हैं।
      4. एक ताजा बाँझ RNase मुक्त 1.5 मिलीलीटर ट्यूब ऊपरी जलीय चरण हस्तांतरण।
      5. Isopropyl शराब की एक समान मात्रा में जोड़ें। मिक्स और 10 मील के लिए सेतेएन आरटी पर शाही सेना गोली से 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 12,000 XG पर centrifugation द्वारा पीछा किया।
      6. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 70% इथेनॉल के 1 एमएल के साथ शाही सेना गोली धोने। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
      7. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण। 5-10 मिनट के लिए आरटी पर सूखी आरएनए छर्रों। 50-100 μl nuclease मुक्त पानी में शाही सेना भंग।
      8. एक NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग शाही सेना की मात्रा का ठहराव प्रदर्शन और एक Bioanalyzer के साथ शाही सेना अखंडता का निर्धारण। 10 एनजी / μl के लिए शाही सेना सांद्रता समायोजित करें। पीसीआर का विश्लेषण करती है वास्तविक समय (धारा 2.2) के बाद miRNA- विशिष्ट सीडीएनए प्रतिक्रिया के लिए 10-50 एनजी शाही सेना का प्रयोग करें।
  2. MiRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर
    नीचे वर्णित के रूप में एक दो कदम आरटी पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग परख परिपक्व miRNAs: ध्यान दें।
    1. रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी)
      1. रिवर्स निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक miRNA रिवर्स प्रतिलेखन किट का उपयोग कर शाही सेना से सीडीएनए टाइप करना।MicroRNA assays और आरटी किट से miRNA विशिष्ट प्राइमर के साथ कुल शाही सेना के 10-50 एनजी का प्रयोग करें। नियंत्रण के रूप में RNU48 / RNU24 / RNU6B का प्रयोग करें। (विश्लेषण किया miRNA की बहुतायत पर निर्भर करता है) 1:10 से 5 और निम्न चरण में वर्णित के रूप में वास्तविक समय पीसीआर का पता लगाने में उपयोग करें: सीडीएनए 1 पतला।
    2. परिपक्व miRNA की जांच के लिए वास्तविक समय पीसीआर
      1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक फास्ट यूनिवर्सल मास्टर मिश्रण के साथ MicroRNA assays का उपयोग सीडीएनए नमूनों से पीसीआर उत्पादों बढ़ाना। RNU48 / RNU24 / RNU6B नियंत्रण के लिए नमूने मानक के अनुसार। फास्ट रीयल टाइम पीसीआर सिस्टम पर जीन अभिव्यक्ति में रिश्तेदार परिवर्तन की गणना करने के लिए तुलनात्मक सीटी (दहलीज चक्र) विधि का प्रयोग करें। तीन प्रतियों में प्रत्येक नमूने का विश्लेषण करें।

स्वस्थानी संकरण में से 3. miRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण (ISH)

  1. ऊतकों के पूर्व उपचार
    1. एक microtome का उपयोग कर FFPE प्रोस्टेट कैंसर ऊतक ब्लॉक से 5 माइक्रोन वर्गों में कटौती।
      2. नोट: miRNA विश्लेषण के लिए स्लाइड कई हफ्तों के लिए आरटी पर संग्रहित किया जा सकता है।
    2. 15 मिनट प्रत्येक के लिए, (2x) xylene साथ स्लाइड्स भिगोने से ऊतकों Deparrafinize।
    3. आसुत जल (5 मिनट) द्वारा पीछा वर्गीकृत इथेनॉल (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%) में 5 मिनट के लिए प्रत्येक स्लाइड incubating द्वारा ऊतकों rehydrate।
    4. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस में 4% paraformaldehyde के साथ स्लाइड को ठीक करें।
    5. 5 मिनट प्रत्येक के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस (2x) के साथ स्लाइड धो लें।
    6. पूर्व गर्म proteinase कश्मीर बफर में 10 मिनट (5 मिमी Tris एचसीएल पीएच 7.4, 1 मिमी EDTA, 1 मिमी NaCl) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 माइक्रोग्राम / एमएल Proteinase कश्मीर के साथ स्लाइड्स समझो।
    7. Proteinase-कश्मीर उपचार के बाद, 30 सेकंड के लिए पीबीएस में 0.2% ग्लाइसिन साथ स्लाइड्स कुल्ला।
    8. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस (1x) में स्लाइड्स धो लें।
    9. 15 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde के साथ स्लाइड को ठीक करें।
    10. साथ कुल्ला स्लाइड्स5 मिनट के लिए पीबीएस।
  2. संकरण
    1. एक humidified कक्ष में 55 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 घंटे के लिए पूर्व संकरण समाधान के साथ स्लाइड्स पूर्व संकरण। चैम्बर humidified रखने के लिए 50% formamide / 50% 5x एसएससी में भिगो ऊतक प्रयोगशाला पोंछे का प्रयोग करें।
    2. संकरण बफर में 20-50 एनएम के एक एकाग्रता में 5 'digoxigenin लेबल जांच का प्रयोग करें। 4 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर miRNA विशेष जांच (20-50 एनएम) और छोटे परमाणु शाही सेना U6 नियंत्रण जांच (20 एनएम), गर्मी पतला बर्फ पर जगह है, और ठंड संकरण बफर बर्फ में जोड़ें (2-4 एनजी / μl )।
    3. जांच-विशिष्ट संकरण तापमान पर 12-16 घंटे के लिए सेते, संकरण समाधान (जांच + संकरण बफर, स्लाइड प्रति 100 μl) जोड़ने, पूर्व संकरण समाधान निकालें (संकरण तापमान = टीएम जांच -21 डिग्री सेल्सियस)। एक humidified कक्ष (50% formamide / 50% 5x एसएससी) में hybridizations प्रदर्शन करते हैं।
  3. धोने कदम
    1. 45 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2x एसएससी के साथ स्लाइड धो लें।
    2. धो टीवह 45 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1.5x एसएससी के साथ स्लाइड।
    3. 20 मिनट प्रत्येक के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.2X एसएससी (2x) के साथ स्लाइड धो लें।
    4. कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए 1x अवरुद्ध समाधान के साथ स्लाइड्स सेते
  4. खोज
    1. 1 के साथ स्लाइड्स सेते: 100 पीबीएस 1-4 घंटे के लिए या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर एपी संयुग्मित विरोधी digoxigenin एंटीबॉडी पतला।
    2. 10 मिनट प्रत्येक के लिए कमरे में अस्थायी पीबीएस (3x) के साथ स्लाइड्स धो लें।
    3. 5 मिनट प्रत्येक के लिए आरटी पर alkaline फॉस्फेट बफर (100 मिमी Tris पीएच 9.5, 50 मिमी 2 MgCl, 100 मिमी NaCl, 0.1% बीच 20) के साथ स्लाइड्स (2x) धो लें।
    4. 1-20 घंटे के लिए आरटी पर अंधेरे में बी.एम. बैंगनी एपी सब्सट्रेट में स्लाइड्स सेते हैं।
    5. पीबीएस पानी में 0.1% बीच 20 और धोने (2x) युक्त के साथ स्लाइड्स कुल्ला।
    6. एक जलीय बढ़ते मीडिया का उपयोग कर स्लाइड माउंट और एक माइक्रोस्कोप के तहत जांच करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

आरटी पीसीआर द्वारा एलसीएम प्राथमिक प्रोस्टेट कैंसर नैदानिक ​​नमूनों में मीर 203 की अभिव्यक्ति की रूपरेखा का विश्लेषण करती है (चित्रा 1)

आरटी पीसीआर एलसीएम प्राथमिक प्रोस्टेट कैंसर के ऊतकों में रिश्तेदार मीर 203 अभिव्यक्ति का विश्लेषण करती है और एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था सैनी एट अल। 15 RNU48 में वर्णित के रूप में मिलान किया आसन्न सामान्य क्षेत्रों के बाहर किया गया था। टेबल के नीचे से सटे सामान्य ऊतकों के सापेक्ष प्रोस्टेट कैंसर ट्यूमर ऊतकों में रिश्तेदार मीर 203 अभिव्यक्ति का सार।

आरटी पीसीआर द्वारा मीर 383 अभिव्यक्ति की तुलना लेजर कब्जा पीसीए ऊतकों microdissected बनाम microdissected में विश्लेषण करती है (चित्रा 2)

प्रोस्टेट कैंसर के ऊतकों या तो माइक्रोस्कोप के तहत microdissected थे या आरटी पीसीआर द्वारा पीछा एलसीएम के अधीन थे ट्यूमर ऊतकों में मीर 383 अभिव्यक्ति का ट्यूमर के नमूनों में मिलान आसन्न सामान्य tissues.Relative मीर 383 अभिव्यक्ति के सापेक्ष का विश्लेषण करती हैshown.RNU48 एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था रहे हैं। चित्रा 2 में दिखाया गया है miRNA अभिव्यक्ति इन ऊतकों में विश्लेषण किया गया था, जब मतभेद मनाया गया। यह प्रोस्टेट ऊतकों की एक अपेक्षाकृत शुद्ध आबादी के अलगाव की अनुमति देता है और अधिक विश्वसनीय है के रूप में एलसीएम खुर्दबीन के नीचे microdissection पर एक फायदा है।

ISH प्रोस्टेट कैंसर नैदानिक ​​ऊतकों में मीर 203 अभिव्यक्ति का विश्लेषण करती है (चित्रा 3)

15 प्रोस्टेट कैंसर ऊतक माइक्रोएरे ISH के लिए इस्तेमाल किया गया था एट अल। सैनी के रूप में वर्णित स्वस्थानी संकरण में सामान्य और हड्डी मेटास्टेटिक प्रोस्टेट कैंसर के ऊतकों में मीर 203 अभिव्यक्ति के विश्लेषण का उपयोग 5'- डीआईजी मीर 203 और के लिए विशिष्ट LNA जांच लेबल विश्लेषण प्रदर्शन किया गया था U6। ISH के प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 3, आंशिक रूप से सैनी एट अल से reproduced एक चित्र में दिखाया गया है विश्लेषण करती है। (2011) 15 चित्रा 3 ए और 3 बी showsmiR-203 अभिव्यक्तिसंकेत दिया ऊतकों में सायन (बाएं) और U6 नियंत्रण अभिव्यक्ति (दाएं)। ISH संकेतों अर्द्ध मात्रात्मक धुंधला और दाग कोशिकाओं के प्रतिशत की तीव्रता के आधार पर वर्गीकृत और सामान्यीकृत मीर 203 अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के U6 अभिव्यक्ति के उन लोगों से विभाजित किया गया मीर 203 अभिव्यक्ति के 1 से 4 तीव्रता के स्कोर के स्कोर सौंपा गया है कि चित्रा 3 सी में प्लॉट किए जाते थे।

चित्र 1
चित्रा 1: आरटी पीसीआर द्वारा एलसीएम प्राथमिक प्रोस्टेट कैंसर नैदानिक ​​नमूनों में मीर 203 की अभिव्यक्ति की रूपरेखा का विश्लेषण करती है। एलसीएम-प्रोस्टेट कैंसर के ऊतकों और मिलान आसन्न सामान्य क्षेत्रों में रिश्तेदार मीर 203 अभिव्यक्ति की आरटी पीसीआर विश्लेषण। RNU48 एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। टेबल के नीचे से सटे सामान्य ऊतकों के सापेक्ष प्रोस्टेट कैंसर ट्यूमर ऊतकों में रिश्तेदार मीर 203 अभिव्यक्ति का सार। कृपया यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्र 2
चित्रा 2: आरटी पीसीआर द्वारा मीर 383 अभिव्यक्ति की तुलना लेजर कब्जा पीसीए ऊतकों microdissected बनाम microdissected में विश्लेषण करती है प्रोस्टेट कैंसर के ऊतकों या तो माइक्रोस्कोप के तहत microdissected थे या आरटी पीसीआर द्वारा पीछा एलसीएम के अधीन थे में मीर 383 अभिव्यक्ति का विश्लेषण करती है। मिलान किया आसन्न सामान्य ऊतकों के सापेक्ष ट्यूमर ऊतकों। ट्यूमर के नमूनों में रिश्तेदार मीर 383 भाव shown.RNU48 एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। ISH प्रोस्टेट कैंसर नैदानिक ​​ऊतकों में मीर 203 अभिव्यक्ति का विश्लेषण करती है यह आंकड़ा 15 से संशोधित किया गया है। ऊतकों डीआईजी Labe साथ संकरित थे15 में वर्णित के रूप में भरी बंद कर दिया न्यूक्लिक एसिड (LNA) मीर-203 और U6 (नियंत्रण) के लिए आधारित जांच। मीर 203 अभिव्यक्ति (बाएं पैनल) और मानव प्रोस्टेट कैंसर सामान्य और हड्डी मेटास्टेटिक ऊतकों में नियंत्रण U6 अभिव्यक्ति (सही पैनल) की ISH विश्लेषण के प्रतिनिधि उदाहरण हड्डी मेटास्टेटिक ऊतकों में मीर 203 अभिव्यक्ति तनु दिखा रहा है। एक उच्च आवर्धन (40X) पर एक में दिखाया प्रतिनिधि ISH उदाहरण हैं। सामान्य प्रोस्टेट ऊतकों और हड्डी मेटास्टेटिक प्रोस्टेट कैंसर के ऊतकों में सापेक्ष मीर 203 अभिव्यक्ति के स्तर ISH विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन के रूप में। मीर 203 अभिव्यक्ति U6 स्कोर करने के लिए सामान्यीकृत, रन बनाए और साजिश रची गई थी। क्षैतिज रेखा औसत मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस अनुच्छेद में, हम संग्रहीत FFPE या ताजा जमे हुए प्रोस्टेट कैंसर नैदानिक ​​ऊतकों में रूपरेखा miRNA अभिव्यक्ति के लिए एक सरल कार्यप्रवाह का वर्णन है। प्रोस्टेट कैंसर के अलावा, कई अध्ययनों से प्रोस्टेट कैंसर दीक्षा, प्रगति और मेटास्टेसिस में microRNAs की एक महत्वपूर्ण भूमिका सुझाव देते हैं। हालांकि, परस्पर विरोधी परिणाम अक्सर miRNA निकासी के बाद से एक विशिष्ट miRNA 22 पर प्राप्त की और तरीकों व्यापक रूप से अलग विश्लेषण कर रहे हैं। प्रोस्टेट कैंसर रोग का निदान, निदान और उपचार के लिए वैकल्पिक प्रोस्टेट कैंसर बायोमार्कर के रूप में miRNAs की संभावित आवेदन का समर्थन उभरते सबूत को देखते हुए, सही नैदानिक ​​ऊतकों में miRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल quantitate करने की जरूरत है।

MiRNA प्रोस्टेट कैंसर नैदानिक ​​नमूनों के विश्लेषण के लिए हम मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर की और स्वस्थानी संकरण में एक संयोजन को रोजगार। इस कार्यप्रवाह के भीतर, हम miRNA निकासी के लिए मौजूदा तरीके में अनुकूलित किया है, अभिव्यक्ति Taq से विश्लेषण करती हैआरटी पीसीआर और ISH आधारित आदमी प्राइमर LNA जांच से विश्लेषण करती है। पूरे कार्यप्रवाह के दौरान, यह एक RNase मुक्त वातावरण बनाए रखने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। इस्तेमाल सभी अभिकर्मकों / समाधान मुक्त RNase किया जाना चाहिए और अतिरिक्त सावधानी शाही सेना और अन्य अभिकर्मकों से निपटने में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। सभी वास्तविक समय प्रतिक्रियाओं आरएनए गिरावट को कम करने के लिए बर्फ पर स्थापित किया जाना चाहिए।

प्रोस्टेट कैंसर के ऊतकों में सटीक अभिव्यक्ति की रूपरेखा अक्सर विविधता और प्रोस्टेट कैंसर के घावों 25 की मल्टीफोकल प्रकृति द्वारा रुकावट है। यह प्रोस्टेट ऊतकों 22,25 के सटीक नीचे की ओर आणविक विश्लेषण की अनुमति देता है, सौम्य और घातक उपकला कोशिकाओं की जुदाई की अनुमति देता है और यह भी स्ट्रोमल संदूषण कम कर देता है कि एक लेजर कब्जा microdisssection तकनीक का उपयोग करके दूर किया जा सकता है। हम विश्वसनीय होने की सूचना दी गई है कि TaqMan microRNA अभिव्यक्ति assays का उपयोग रूपरेखा miRNA अभिव्यक्ति के द्वारा पीछा संग्रहीत FFPE ऊतकों की एलसीएम रोजगार। एलसीएम ऊतकों की miRNA प्रोफाइलिंग signif गया हैicant संभावित miRNA बायोमार्कर की खोज को बढ़ाने के लिए। वास्तव में, इन ऊतकों में व्यापक रूप से नैदानिक ​​विश्लेषण, संरक्षण, और संग्रह करने के लिए पैथोलॉजिस्ट द्वारा उपयोग किया जाता है कि विचार FFPE ऊतकों का विश्लेषण करने में काफी रुचि 3 आसानी से उपलब्ध हो रहा है। इसके अलावा, उनके छोटे आकार और अंतर्जात RNase गतिविधि के प्रतिरोध के कारण, miRNAs अपेक्षाकृत कम FFPE निर्भर गिरावट से प्रभावित कर रहे हैं और आकर्षक संभावित बायोमार्कर 3 रहे हैं। formalin तय ऊतकों की miRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल दृढ़ता से जमे हुए ऊतकों 21 में से उन लोगों के लिए सहसंबद्ध होने की सूचना दी गई है।

हम कार्यरत हैं और FFPE ऊतकों से miRNA निकासी के लिए दो अलग-अलग वाणिज्यिक किट की तुलना में। आरटी पीसीआर विश्लेषण के लिए दोनों किट उच्च गुणवत्ता शाही सेना झुकेंगे, वहीं हम FFPE ऊतकों से miRNAs की लगातार शुद्धि और कुल शाही सेना के लिए एक सरल, सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल का उपयोग करता है कि एक प्रयोग किया।

अखंडता, पवित्रता और आरएनए shoul की एकाग्रताआरटी पीसीआर का विश्लेषण करती है पहले परीक्षण किया घ। कम A260 / A230 अनुपात (<1.8) दिखाने के नमूने एक आरटी प्रतिक्रिया में उपयोग करने से पहले फिर से उपजी और पवित्रता के लिए फिर से विश्लेषण किया जाना चाहिए। इसके अलावा, वास्तविक समय पीसीआर आगे अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है नैदानिक ​​ऊतकों का विश्लेषण करती है। दहलीज चक्र (सीटी मूल्यों)> 33 कम मूल्य उस सीडीएनए टेम्पलेट को दर्शाती कम प्रवर्धन संकेत मिलता है। इस मामले में, सीडीएनए टेम्पलेट आदानों बढ़ाया जा सकता है। इसके अलावा, यह पर्याप्त नियंत्रण को सामान्य बनाने और सामान्य और ट्यूमर ऊतकों के बीच सापेक्ष miRNA quantifications का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि अत्यंत महत्व का है। अंतर्जात नियंत्रण (RNU48 / RNU24 / RNU6B) ट्यूमर के नमूनों बनाम सामान्य में प्रवर्धन संकेतों की एकरूपता के आधार पर चुना जाता है।

MiRNA ISH LNA- आधारित जांच के आधार पर प्रोस्टेट कैंसर के ऊतकों के विश्लेषण के लिए इसके अलावा, हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन है। हमारे अनुकूलित miRNA ISH प्रोटोकॉल समेत कई शक्तिशाली साथ, प्रोस्टेट कैंसर के ऊतकों स्लाइड या प्रोस्टेट कैंसर ऊतक (टीएमए) को लागू किया जा सकताmiRNA बायोमार्कर की खोज में तेजी लाने के लिए ial। इस प्रोटोकॉल भी अन्य प्रकार के ऊतकों को लागू किया जा सकता है। हालांकि, proteinaseKdigestionandparaformaldehydetreatment की अवधि के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है। Proteinase कश्मीर पाचन paraformaldehyde निर्धारण permeabilization निम्नलिखित miRNA नुकसान को रोकने की जरूरत है, जबकि miRNA जांच कोशिकाओं में शामिल होने की अनुमति देता है। मूल रूप से LNA जांच 26 के साथ उपयोग के लिए विकसित इस प्रोटोकॉल, प्रोस्टेट ऊतकों में कम से कम पृष्ठभूमि के साथ एक विशेष संकेत पाने के लिए अनुकूलित है। जांच सांद्रता और ऊष्मायन शर्तों प्रोस्टेट कैंसर के ऊतकों के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। हम miRNA की बहुतायत के आधार पर 20-50 एनएम के एक एकाग्रता में 5'digoxigeninlabeledprobes रोजगार। हालांकि, 3'digoxigeninlabeledprobes और दोहरी (5 'और' 3) लेबल जांच प्रतिस्थापित किया जा सकता लेबल। वास्तव में, दोहरी लेबल जांच microRNA का पता लगाने के लिए बेहतर वर्णमिति विकास के लिए क्षमता प्रदान करते हैं और कम बहुतायत miRNA का पता लगाने के लिए सिफारिश कर रहे हैं। इसके अलावा, अवरुद्ध और एंटीबॉडी incubations की अवधि के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। अब ब्लॉकिंग विशेष रूप से कम बहुतायत miRNAs के साथ, कम पृष्ठभूमि के लिए सिफारिश की है। बी.एम. बैंगनी सब्सट्रेट के साथ Thedurationofcolor प्रतिक्रिया बारीकी से निगरानी की जानी चाहिए। अब incubations पृष्ठभूमि धुंधला उत्पन्न कर सकते हैं। कम प्रचुर मात्रा में miRNA अब incubations के साथ पाया जाता है, जबकि आमतौर पर, प्रचुर मात्रा में miRNAs कम incubations (1-2 घंटा) की आवश्यकता होती है। ISH के दौरान, यह इस धुंधला कलाकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में ऊतक वर्गों के किसी भी कदम के दौरान बाहर सूखी नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

अंत में, हालांकि कई अध्ययनों महत्वपूर्ण प्रोस्टेट कैंसर बायोमार्कर के रूप में miRNAs, इन अध्ययनों के कई के महत्व के कारण अक्सर परस्पर विरोधी परिणाम के लिए बहस हो रही है सुझाव देते हैं। यहाँ हम सटीक miRNA अभिव्यक्ति के लिए एक अनुकूलित कार्यप्रवाह प्रोस्टेट कैंसर के लिए बायोमार्कर के रूप में miRNA की खोज में तेजी लाने के लिए एक संभावित है कि प्रोस्टेट कैंसर नैदानिक ​​नमूनों में विश्लेषण करती है परिभाषित किया है। जबकिइस कार्यप्रवाह महत्वपूर्ण क्षमता प्रोस्टेट कैंसर नैदानिक ​​ऊतकों में सही प्रोफ़ाइल miRNA अभिव्यक्ति के लिए किया है, कार्यरत तकनीक के निहित सीमाएं हैं। कम प्रचुर मात्रा में miRNAs अनुकूलित miRNA आरटी पीसीआर के साथ प्रोफ़ाइल करने के लिए मुश्किल हो सकता है और ISH यहाँ वर्णित विश्लेषण करती है। आरटी पीसीआर आधारित प्रोफाइलिंग ISH 27,28 तुलना में एक व्यापक गतिशील रेंज है, हालांकि, एलसीएम से प्राप्त कम आरएनए मात्रा कम प्रचुर मात्रा में miRNAs की सीमा का पता लगाने सकता है। MiRNAs की ISH आधारित पता लगाने हालांकि अपनी सीमाएं यह एक कम गतिशील रेंज 28 के साथ एक अर्द्ध मात्रात्मक तकनीक है कि कर रहे हैं, शक्तिशाली स्थानिक जानकारी अर्जित करता है। इस तकनीक में कार्यरत जांच की संवेदनशीलता और विशिष्टता पर और भी संकरण और miRNAs का पता लगाने के लिए शर्तों का अनुकूलन पर निर्भर करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि की तैयारी के साथ अपने समर्थन और सहायता के लिए डॉ रोजर एरिक्सन धन्यवाद।

इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों में राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित किया गया

(अनुदान संख्या RO1CA177984; RO1CA138642), प्रोस्टेट कैंसर (BX001604) पर वीए कार्यक्रम परियोजना।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microtome Leica Biosystems  RM2255
Arcturus Autopix for LCM Arcturus/ Life Technologies LCM1621/LCM1110 Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. 
CapSure Macro LCM Caps Life Technologies LCM0211
miRNeasy FFPE Kit  Qiagen 217504
7500 Fast Real-time PCR System  Applied Biosystems/ Life Technologies 4351106
Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit  Applied Biosystems/ Life Technologies 4366596
Taqman Fast Universal PCR master mix  Applied Biosystems/ Life Technologies 4352042
DIG labeled LNA probe for U6 Exiqon 99002-01
BM Purple AP substrate Roche 11442074001
Pre-hybridization solution  Biochain K2191050-1
Hybridization solution  Biochain K2191050-2
Blocking solution  Biochain K2191050-8
AP-conjugated anti-digoxigenin antibody Biochain K2191050-7
Aqueous mounting media  Vector Laboratories  H-5501  
Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)  Life Technologies 15596-018
Harris hematoxylin Statlab SL200
Eosin  Statlab SL201 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
  3. Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
  4. Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
  5. Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what's new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
  6. Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
  7. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
  8. Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
  9. Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
  10. Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
  11. Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  12. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
  13. Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
  14. Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
  15. Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
  16. Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
  17. Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
  18. Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
  19. Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
  20. Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
  21. Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
  22. Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
  23. Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
  24. Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
  25. Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
  26. Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
  28. Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).

Tags

चिकित्सा अंक 103 MicroRNAs प्रोस्टेट कैंसर नैदानिक ​​ऊतकों अभिव्यक्ति का विश्लेषण करती है वास्तविक समय पीसीआर,
प्रोस्टेट कैंसर के नैदानिक ​​ऊतकों में miRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bucay, N., Shahryari, V., Majid, S., … More

Bucay, N., Shahryari, V., Majid, S., Yamamura, S., Mitsui, Y., Tabatabai, Z. L., Greene, K., Deng, G., Dahiya, R., Tanaka, Y., Saini, S. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. J. Vis. Exp. (103), e53123, doi:10.3791/53123 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter