Summary
Medan transport av cellytproteiner är relativt lätt studeras, visualisera handeln med intracellulära proteiner är mycket svårare. Här använder vi konstruktioner innehåller fotoaktiverbara GFP och demonstrera en metod för att noggrant följa amyloidprekursorproteinet från Golgi-apparaten till nedströms fack och följer dess clearance.
Abstract
Beta-amyloid (Ap) är huvudbeståndsdelen av senila plack som har hittats i hjärnan hos patienter med Alzheimers sjukdom. Ap härrör från den sekventiella klyvning av amyloidprekursorprotein (APP) genom β och y-sekre. Trots betydelsen av Ap till AD patologi, är den subcellulära lokaliseringen av dessa klyvningar inte väl etablerad. Arbeta i vårt laboratorium och andra implicerar det endosomala / lysosomala systemet i APP bearbetning efter internalisering från cellytan. Dock är den intracellulära handel med APP relativt understudied.
Medan cell-ytproteiner är kan ändras för många märkningstekniker finns det inga enkla metoder för att följa handel med membranproteiner från Golgi. För detta ändamål har vi skapat APP konstruktioner som var märkta med foto aktiverbar GFP (paGFP) vid C-terminalen. Efter syntes, har paGFP låg basal fluorescens, men den kan stimuleras med 413 nm ljus to producera en stark, stabil grön fluorescens. Genom att använda Golgi markören galaktosyltransferas kopplad till Cyan fluorescerande protein (GalT-GFP) som ett mål, kan vi exakt photoactivate APP i trans-Golgi nätverket. Foto-aktiverad APP-paGFP kan sedan följas eftersom det trafikerar nedströms fack identifieras med fluorescerande taggade fack markörproteiner för tidig endosomen (Rab5), den sena endosomen (Rab9) och lysosomen (LAMP1). Dessutom använder inhibitorer till APP-bearbetning inklusive klorokin eller inhibitor L685 den γ-sekretas, 458, har vi möjlighet att utföra puls-chase experiment för att undersöka bearbetning av APP i enskilda celler.
Vi finner att en stor del av APP flyttar snabbt till lysosomen utan uppträder på cellytan, och försvinner sedan från lysosomen genom sekretas liknande klyvningar. Denna teknik visar nyttan av paGFP för att följa handel och bearbetning av intracellulära proteiner tillbakam Golgi till fack nedströms.
Introduction
Det kännetecknande för Alzheimers sjukdom (AD) är förekomsten av senila plack och neurofibrillära nystan (NFT) i hjärnan. Den viktigaste beståndsdelen i senila plack är β-amyloid (A-beta). Ap härrör från dess föregångare; amyloidprekursorproteinet (APP) 1. Den amyloidogena klyvningen av APP börjar med avlägsnande av ektodomänen från APP genom β-sekretas 2. De återstående 99-rest karboxylterminala fragmentet (CTF) kan klyvas av γ-sekretas att producera A-beta 3-7. Medan många experiment har dokumenterat klyvningen av cellytan APP efter internalisering från cellytan i det endosomala / lysosomala systemet har ett antal nya studier tyder på att intracellulära handel med APP är också viktigt för att reglera sin bearbetning 8-11.
Det har förekommit ett antal försök på modulera nivåerna av Ap med y-sekretas hämmare och Ap Immunotherapies. Den senaste tidens kliniska prövningar med dessa behandlingar visade ingen nytta, och i vissa fall, orsakat skada 12. En outnyttjad strategi för att modulera Ap produktion är att ändra sub-cellulära lokaliseringen av APP och γ-sekretas interaktion. Golgi, plasmamembran, och endosomer / lysosomer har alla föreslagits som möjliga lokaler för γ-klyvning av APP. Undersökningar i vår laboratorium visar att APP och γ-sekretas är bosatta proteiner av det lysosomala membranet 13. Vidare har vi funnit att det lysosomala γ-sekretas har ett surt optimalt pH 13. Dessutom alkalisering av endosomal / lysosomala systemet med klorokin eller NH4CI, har visat sig minska produktionen av Ap 14. y-sekretas hämning eller knockout eller Presenilin leder till APP-CTFs ackumulering i lysosomen 15-17. Dessutom stör APP endocytos sänker Ap produktion 18-20.
Trots betydelsen av Golgi som en sorteringsstation för begynnande proteiner och proteiner återvinns från endosomala / lysosomala systemet har den intracellulära handel med APP inte studerats i detalj 21. Senaste arbete har visat att APP kan återföras till det trans Golgi nät (TGN) via interaktion med retromer komplexet. Nedreglering av retromer komplexet minskar Ap produktion 8,22-24. Men utträde av APP från Golgi har inte studerats.
Medan efter endocytos av cell ytproteiner, såsom transferrinreceptorn är lätt märks och följs, efter handeln med intracellulära proteiner är mer utmanande. I själva verket har få proteiner hade deras intracellulära handel avbildas. Tillkomsten av fluorescerande protein taggar, såsom foto aktiveras-GFP (paGFP), har gett nya verktyg för att undersöka intracellulära människohandel. Foto-aktiverbar-GFP är en form av GFP som är nästan osynlig efter syntes, men utvecklar en stark grön (GFP) fluorescens efter att ha blivit aktiverad av 413 nm laserljus och denna signal är stabil under dagar 25,26. Konstruktioner använder paGFP har använts för att demonstrera intralysosomal handel av lysosomalt protein membranprotein 1 (LAMP1) 25, cellytan leverans av vesikulärt stomatitvirus glykoprotein (VSVG, en markör för den sekretoriska vägen) 27, och omsättningen av peroxisomer 28 och autophagosomes 29.
För att visualisera sortering av APP från TGN i levande celler, utformade vi plasmid som uttrycker de sista 112 aminosyrorna av APP kopplade till foto aktiveras (paGFP) på C-terminalen (benämnd PAPP-paGFP) 30. Vi har också utfört dessa experiment med full längd APP och uppnått liknande resultat; PAPP konstruktionen används här eftersom det ger ljusare bilder. Vi sedan foto aktivera &# 946; APP-paGFP bara i TGN, som avgränsas av TGN markören galaktosyltransferaset (GalT). Även om APP har märkts med paGFP att visualisera snabb axonal transport av APP och godkännande från den perinukleära regionen, är detta den första demonstrationen av APP människohandel från ett noggrant definierade utrymmet till en annan 11,31,32. Här visar vi exakt fotoaktivering i TGN och utträde av APP till nedströms fack och efterföljande klyvning och klartecken från lysosomer 30. Den exakta fotoaktivering i Golgi är allmänt gäller för andra proteinsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Plating och transfektion
- I en cellkultur huva, platta ~ 300.000 till ~ 500.000 SN56 celler (en slags gåva av Dr Jane Rylett) på en 35 mm glasbottnade konfokal skålen och täck med pre-transfektion media (Dulbeccos Modified Eagle Medium, DMEM, kompletterat med 10% FBS).
- Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C i en 5% CO2-inkubator för att föröka sig.
Obs: Celler bör vara ungefär 50% -70% sammanflytande innan transfektion. - I en cellkultur huva, transfektera celler med plasmider som uttrycker ett fluorescerande protein tagged TGN markör (galaktosyltransferas kopplad till cyan fluorescerande protein, GalT-GFP), ett fluorescerande protein tagged fack markör (här, lysosom associerat membranprotein 1, LAMP1, märkt med mRFP), och proteinet av intresse taggade med paGFP (PAPP-paGFP). (Dessa konstruktioner har tidigare beskrivits 30)
- Inkubera cellerna med transfektionsreagens och plasmid DNA feller 24 h vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. Använd ett förhållande ~ 2 pg av DNA till 5 il transfektion agent (t.ex. Lipofectamine 2000) till bästa balans cytotoxicitet och transfektion effektivitet. Faktiska koncentrationerna kan behöva optimeras för olika plasmider. I de experiment som beskrivs här, använd 1 mikrogram / konfokal maträtt av PAPP-paGFP, 0,3 mikrogram / konfokal maträtt av LAMP1-mRFP, och 0,2 mikrogram / konfokal maträtt av GalT-GFP.
Obs: Mängden plasmid som används kommer att bero på transfektionseffektivitet. - För neuronala cellinjer: Efter steg 1,4, i en cellkultur huva, avlägsna för-transfektion media och differentiera SN56-celler i 2 ml DMEM kompletterat med 0,1% penicillin / streptomycin med 1 mM dibutyryl cyklisk AMP (dbcAMP) under 24 timmar.
2. Mikroskop Stage Förberedelse
- Pre-varm fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och Hanks balanserade saltlösning (HBSS) till 37 ° C. Warm-up mikroskop scenen innan imaging till 37 ° C.
- Tvätta cellerna två gånger med PBS, för att avlägsna differentiering media och ersätta med 2 ml HBSS vid 37 ° C. Placera cellerna på mikroskopsteget värmdes till 37 ° C.
Obs: Celler är lönsamt för cirka 1,5-2 timmar i HBSS. - Tillåt 5-10 min för det konfokala plattans temperatur till jämvikt med mikroskop scenen.
3. Foto-aktivering av ROI över Golgi
- Med mikroskop okular, hitta celler transfekterade med GalT-GFP, LAMP1-mRFP och PAPP-paGFP.
- Använd en oljeimmersionslins med hög förstoring (dvs. 63X eller 100X). För visuell konforma av fluorescens, använda ett filter set kan visualisera FITC (för GFP och GFP fluorescens) och rodamin (för mRFP fluorescens).
- Ställ in konfokala skiva för varje kanal som en pm. Ta en lågupplöst bild.
- Beskär bilden endast cellen av intresse.
- Med hjälp av inställningsratten, manuelltfokalplanet till mitten av cellen. Detta är typiskt den del av cellen där kärnan är den största.
- Oavgjort 3-5 cirkulära Region intressen (ROI) inom TGN (GalT-GFP fluorescens).
- För att rita ROI (dvs. i Zeiss LSM-programmet), välj "Redigera ROI" knappen i kommandokonsolen.
- Välj den runda ROI-knappen.
- Klicka och dra över GalT-GFP positiva regioner i cellen.
Obs! Fotobleknings paket för många mikroskop har denna förmåga.
- Ta en bild av cellen med den överlagrade ROI. Spara en kopia av ROI för senare användning.
- Om du vill spara ROI på bilden, välj "Macro" -knappen.
- Tryck på "Load" knappen för att starta "CopyRoisToOverlay" (sökväg: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb).
Obs: En konfokalmikroskop utrustad med 475-525 nm (GFP) bandpass (BP), en 500-530 nm BP (GFP),och en 560 nm lång passning (LP) filteruppsättningar krävs. En argonlaser för 458 nm och 488 nm emission och en HeNe laser för 540 nm emission krävs också.
- Ställ upp mikroskopet för en blekningstidsförlopp.
- Ställ laserdioden (25 mW 405 nm laser) till maximal effekt.
Varning: Överdriven foto aktivering kan leda till fototoxicitet eller skador på cellmembran. Använd skyddsglasögon för att undvika skada på näthinnan. - Set-up mikroskop för 120 cykler av avbildning.
Obs: En avbildning cykel består av blekning inom ROI och avbildning av hela cellen. Detta är en bleknings tidsförloppet. - Ställ mikroskop för att bleka (foto aktivera) endast ROI för 20-30 iterationer efter varje bild. Tiden till bilden och blekmedel en bild kommer att variera. Ställ en tidsfördröjning mellan bilder så att varje cykel är cirka 30 sekunder.
Obs! Avbildning del av varje cykel tar cirka 15-30 sekunder beroende på bildstorleken. Blekn för varje ROJag är ca 50 msek. Blekning av alla 4 ROI för 20 iterationer kommer att ta fyra sekunder vid slutet av varje blekmedel / bildcykel.
- Ställ laserdioden (25 mW 405 nm laser) till maximal effekt.
- Starta blekmedel tidsförloppet.
- Stäng av blekning efter 15 min (30 cykler av avbildning och blekning), men fortsätter att fånga bilder av cellen.
Obs: Tid 0-15 minuter är "pulsen" period. - Fortsätt ta bilder under 45 minuter (utan blekning), att följa avslutningen av PAPP-paGFP.
Obs: Tid 15-45 min är "chase" -period. - Med den analysmetod som beskrivs i steg 6, co-lokalisera proteinet av intresse (här PAPP-paGFP) med facket av intresse (här LAMP1-mRFP) genom att göra ytor till varje kanal.
4. Bestäm nedströmskammaren
- För att bestämma om lysosomer (i dessa experiment) är det slutliga facket, lägg membrangenomträng proteashämmare för att bringa proteiner att ackumuleras i lysosomen.
- För PAPP, använd 0,5 pM L685, 458 (specifik γ-sekretas-inhibitor) över natten eller 100 pM klorokin (deacidifies lysosomer) under 30 minuter innan avbildning.
- Hitta celler och photoactivate som i steg från 3,1 till 3,8.
- Bild cellen för en ytterligare 45-min (utan foto-aktivering) för att avgöra var PAPP-paGFP ackumuleras i frånvaro av klyvning.
- Analysera leverans av protein till lysosomer (eller annan nedströmskammaren) och efterföljande spel enligt den metod som beskrivs i steg 6.
5. Se till noggrannhet Foto-aktivering i Golgi
- Warm-up HBSS till 37 ° C.
- Bered en 2 ml lösning för varje konfokala platta som ska avbildas, 66 iM nokodazol (behandling) eller DMSO (kontroll) i HBSS.
- För en konfokal platta, pipett 2 ml 37 ° C HBSS och tillsätt 7,96 ul av nokodazol från en 16,60 mM nokodazol lager.
- Som en kontroll sålution, pipett 2 ml av 37 ° C HBSS i en 2 ml rör och till 7,96 il DMSO.
- Inkubera cellerna i HBSS med nokodazol eller DMSO under 5 min före avbildning.
- Hitta celler som i steg 3.1.
- Innan fotoaktivering, förbereda mikroskop för att ta en Z-stack efter fotoaktiveringsperioden.
- Klicka på "Z Stack" -knappen. Börja skanna med användande av Fast XY.
- Justera fokalplanet med justerings mikroskop vredet till toppen av cellen. Tryck på 'Mark först "för att ställa in den första positionen i stacken.
- Justera fokalplanet vid justering mikroskop vredet till botten (närmast glaset) i cellen. Tryck på 'Mark Sista "för att ställa in den sista positionen i stapeln.
- I Z stacken panelen, tryck på 'Z sektionering "-knappen. Ställ in "Intervall" till 1 pm.
Obs! För en högre rumslig upplösning stapla en mindre stack intervall, men fler bilder kommer att behövatas förlänga avbildningstiden för stapeln.
- Bleach cellerna, såsom beskrivs i steg 3,7-3,8. Foto-aktivera och bild från 0 min till 15 min (30 bilder).
- Stoppa avbildning efter 30 bilder. Omedelbart spara en bild av videon.
Varning: Vissa mikroskop kan skriva över första videon om den inte sparas innan en andra avbildningssekvens. - När du har sparat videon omedelbart skaffa en Z-stack, användning av parametrarna från steg 5.5.
- Co-lokalisera PAPP-paGFP med GalT-GFP (eller annan Golgi markör), såsom beskrivs i steg 6.
Obs: CFP photobleaches snabbt och kanske inte syns i slutet av bildperioden. Colocalization kanske inte är möjligt med GalT-GFP. Om colocalization krävs, använd mRFP att märka GalT.
6. Vesikel Filtrering och samlokalisering
- Använd ett analysprogrammet (t.ex. Imaris) för att göra ytor av facket (t.ex. LAMP1-mRFP) och en protein of intresse (t.ex. PAPP-paGFP).
- Ange "Surpass" del av analysprogrammet genom att klicka på knappen Surpass på den övre menyraden.
- Välj Surface guideknappen högst upp i den längst till vänster panelen (5: e knappen från vänster).
- Välj en kanal för att filtrera vesiklar (dvs. PAPP-paGFP fluorescens, protein av intresse).
- Utför bakgrundssubtraktion genom att skicka in diametern på den största vesikeln i fältet till guiden och tryck på nästa. Analysprogrammet väljer automatiskt - som bygger på en tröskel som härrör från den största vesikeln i området - ett område i kanalen av intresse.
- Manuellt justera tröskel bakgrunden att förfina valet om det behövs.
- Längst ner på tröskeln valskärmen, kontrollera "Split röra föremål" möjlighet att separera den kombinerade ytor.
Obs: Om många vesiklar är nära grupperade tillmans, analysprogrammet kommer gruppera dessa föremål under en yta.- Välj 10-15 representativa vesiklar och beräkna den genomsnittliga vesikler diameter och ange svaret i guiden.
- Förfina utvalda groddpunkter genom att öka eller minska tröskeln på "kvalitet" (intensitet kanalen i mitten av varje plats).
Obs: Ytor av kanalen av intresse kommer att skapas. Ytterligare förfining av de valda ytorna kan utföras vid denna punkt. Tröskel vesiklar baserade på antalet bildpunkter i varje vesikel. - Maskera den ursprungliga kanalen med denna yta. För att maskera, välj 4. Fliken från vänster i guiden skapa ytan (penna).
- Välj "Mask alla". En ny kanal med blåsor av intresse kommer att skapas.
Obs: Under maskprocessen är ett alternativ för att kopiera den ursprungliga kanalen som erbjuds. Välj det här alternativet om den ursprungliga uppgifterna måste sparas. - Upprepa spakterna 6.1 till 6.7 för ofiltrerade kanalen (dvs. LAMP1 mRFP, fack).
- På toppen verktygsfältet, välj colocalization verktyget.
- I den övre panelen, som histogram av de kanaler som skall samlokaliserades visas väljer den nyligen skapade maskerade kanaler.
- Markera alla tillgängliga data. Det finns mörka bildpunkter som ibland förekommer efter analys. Välj inte dessa pixlar i histogrammet, kommer de att förvränga resultaten.
- Längst högra panelen, välj "Build Coloc Channel". Detta skapar en ny kanal som innehåller endast samlokaliserades pixlar. Uppgifterna kommer att vara i samma panel under "Channel statistik" -knappen. Uppgifterna kan exporteras som en CSV-fil.
- Använd "Procent av material samlokaliserades" statistik. Det här alternativet tar hänsyn till intensiteten hos pixlar och storleken av objektet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiska resultat visar PAPP lämnar TGN och verkar trafik snabbt till LAMP1 (Figur 1a och b). Under fotoaktiveringsperiod, kan vesiklar ses avgår Golgi avsett för lysosomer (Figur 1b). Utan behandling inhibitor kommer paGFP fluorescens att synas i lysosomer medan det finns fotoaktivering i TGN. Efter avslutad fotoaktivering, är PAPP-paGFP elimineras snabbt från lysosomen (jämför Figur 1a till 1b). Behandling med nokodazol leder till ansamling av APP inom GalT-GFP märkta fack och förhindrar handel till lysosomer (fig 1c).
Den svenska mutationen av APP (APPsw) ökar graden av β-klyvning med 10-faldig 34. Under snabb klyvning av βAPPsw-paGFP visas paGFP fluorescensen som en diffus fluorescenssignal i cytosolen. Förmodligen iar resultatet av snabba PAPP klyvning genom γ-sekretas befriande den C-terminala paGFP i till cytoplasman (figur 2). I närvaro av γ-sekretas-inhibitor, ackumulerar PAPP inom lysosomer.
Efter leverans av PAPP till lysosomen är paGFP fluorescens vinner snabbt. Den korta uppehållstiden kan vara resultatet av handeln från lysosomen till en annan kammare. Omvänt skulle förväntas spjälkning av PAPP genom γ-sekretas leder till diffusion av paGFP fluorescens från det lysosomala membranet (fig 3a). Den diffusa fluorescens är svårare att upptäcka genom konfokal mikroskopi. För att bestämma huruvida PAPP levereras till en annan avdelning eller rensas var SN56 celler behandlades med en specifik hämmare mot γ-sekretas (L685, 458) eller en alkaliniserande medel (klorokin). Tillsatsen av antingen L685, 458 eller klorokin resulterade i APP-ackumulering i lysosomen (
Det är allmänt accepterat att APP levereras till cellytan innan den endocytoseras och bearbetas i endosomer och lysosomer 35. Men i våra obehandlade celler, cellytan PAPP kunde inte upptäckas av konfokalmikroskopi. Foto-aktiverade PAPP får inte koncentreras till en viss region i plasmamembranet. Istället kan det finnas en diffus fluorescens över den stora ytarean hos plasmamembranet. Intressant nog leder behandling γ-sekretas-inhibitor till detekterbara PAPP-paGFP vid cellytan (figur 3b). γ-sekretas inhibitorbehandling dirigera mer PAPP till cellytan, förutom att inhibera enzymfunktion. Därför den stora ytarean av plasmamembranet sprider paGFP över en större yta och gör detektering svår, även om proteinet är trafikerade till facket.
1 "src =" / filer / ftp_upload / 53153 / 53153fig1.jpg "/>
Figur 1. Imaging handel med APP till lysosomer. SN56 celler transfekterades med LAMP1-mRFP, GalT-GFP, och PAPP-paGFP. A) Cellen var exakt foto aktiveras inom ROI placeras över Golgi (ROI betecknas med vita cirklar ). Cellen var alternativt foto aktiveras och avbildas i 15 minuter för att avgöra PAPP-paGFP människohandel. Infällda bilden visar människohandel inom perinukleära området från Golgi till lysosomer. Co-lokaliserade pixlarna gult. B) Handeln med en vesikel innehållande PAPP-paGFP till lysosomen. Gula pixlar betecknar LAMP1 och PAPP-paGFP colocalization. C) SN56-celler behandlades med nokodazol innan avbildning för att förhindra PAPP-paGFP utträda från TGN. En representativ bild som tas från utgången av fotoaktiveringsperioden. I den högra panelen, en Z-stapel av samma cell tas omedelbart efter fotoaktivering. Th e GalT-gemensamma fiskeripolitiken har varit falska färgade röda för att förbättra visualisering av samlokaliserades GalT-gemensamma fiskeripolitiken och PAPP-paGFP. Gula pixlar betecknar colocalization mellan GalT-GFP och PAPP-paGFP. Skalstrecken representerar 5 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Handel med βAPPsw-paGFP. SN56 celler transfekterades med LAMP1-mRFP, GalT-gemensamma fiskeripolitiken och βAPPsw-paGFP (PAPP med familjär svenska mutationen). Den svenska mutationen ökar hastigheten som APP klyvs. Celler alternativt inom Golgi fotoaktiverade och avbildas. En diffus fluorescens kan ses efter paGFP lösgörs från det lysosomala membranet för att diffundera in i cytoplasman. Skala stapel representerar 5 um.53 / 53153fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Fastställande av terminalorganell. SN56 celler transfekterades med LAMP1-mRFP, GalT-gemensamma fiskeripolitiken och PAPP-paGFP. Efter fotoaktivering, celler följdes under ytterligare 45 minuter. De två vänstra-panelerna visar cellerna före fotoaktivering (längst till vänster) och 15 minuter efter fotoaktivering (mitten). Panelen på längst till höger visar APP fluorescens efter 45 minuter av total avbildning i a) obehandlat, b) γ-sekretas hämmare behandlas eller c) klorokin behandlas. Pilspetsar pekar på APP samlokaliserade med LAMP1 efter 45 min av avbildning. Skalstrecken representerar 5 pm. Klicka här för att se en större version av thär figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna teknik beskriver exakt foto aktivering av membranproteiner taggade med paGFP i TGN att visualisera efterföljande handel och klyvning. Medan paGFP skapades över ett decennium sedan 25, är detta det första exemplet på exakt fotoaktivering att följa handel med begynnande proteiner till fack nedströms. Tidigare studier med APP-paGFP konstruerar foto aktiverat en peri-nukleär region i cellen, som ansågs vara Golgi 11. Men, kan så tydligt i våra mikrografer, lysosomer, tidiga endosomer, och sena endosomer också hittas i denna region (Figur 1 och referens 30). Dessa experiment har bedrivits framgångsrikt i HEK293-celler, COS7-celler, neuronala SN56 celler, SH-SY5Y celler och mus nervceller, även om transfektionseffektiviteten av mus nervceller är låg. Liknande experiment har utförts med hjälp av hellånga APP konstruktioner och förkortade konstruktioner, som omfattar de senaste 112 aminosyror av APP, med P- och γ-klyvningsställen, smält till paGFP. De förkortade konstruktionerna är lättare att transfektera och ge en högre fluorescenssignal, och dessa visas i bifogade figurer. Våra förkortade konstruktionerna saknar även den N-terminala ektodomän, som har odefinierade klyvningar och sorteringssignaler 38. Trots dessa N-terminal signaler och klyftor, finner vi att vår förkortad konstruktion har liknande lokalisering och handel som en fullängds APP-paGFP 30, 33.
På grund av de många organeller i peri-nukleära området i cellen var borgar för att säkerställa riktigheten av fotoaktivering. Under avbildningsperioden kommer cellen och Golgi flytta. Därför måste fotoaktiverings ROI följas noggrant under fotoaktiveringsperioden och justeras för att stanna kvar på toppen av Golgi. Konfokala mikroskop är känsliga för små förändringar i temperatur. Till exempel, AC eller värmefläktar över microscope skulle kunna resultera i en förändring av bildplanet.
För att bibehålla överensstämmelse mellan experiment, vi ställa in en tidsfördröjning mellan varje foto-aktivering / avbildning cykel. Tid krävs för att bleka ROI och bild cellen. Beroende på storleken av cellen och antalet ROI, till tiden bleka och ta en bild kommer att variera. För att upprätthålla konsistens från bild till bild, ställa in en tidsfördröjning mellan bilderna så att varje bild, inklusive blekning, kräver ungefär 30 sekunder. Ökad tidsupplösning kan uppnås genom användning av detektionssystem som utnyttjar ett strålformaren (t.ex. LSM5 Levande detektor). Dessa mikroskop kan bild på 120 bilder / sekund med ingen förlust i upplösning.
För att bekräfta riktigheten i fotoaktivering, är det nödvändigt att utföra en nokodazol kontroll. Genom att blockera transport ut ur Golgi under fotoaktivering, säkerställer detta att paGFP inte genom signifikant aktiverat i de andra facken.GFP foto blekmedel snabbt med upprepad avbildning och blekning och kan göra colocalization med GalT-GFP svårt. Om huvuddelen av paGFP fluorescens förblir i Golgi-området, kan det också finnas exakt fotoaktivering. Alternativt kan GalT märkas med mRFP, som är mer fotostabila än GFP i dessa experiment.
Förbättrad aktivering inom Golgi kan också uppnås med en multifotonmikroskop. Medan det konfokala avbildningsplanet i dessa experiment är typiskt en 1 ^ m skiva, lasern för avbildning och fotoaktivering kommer att passera genom hela cellen. En multifotonlaser skulle kunna användas för dessa experiment, och kan förbättra noggrannheten i alla tre dimensionerna 35. Men som visats här, är en traditionell 405 nm laserdiod är tillräcklig för att exakt foto aktivera PAPP-paGFP inom TGN.
Som en kontroll, har vi utfört liknande experiment för VSVG-paGFP fluorescens. VSVG-paGFP, som ärkonstitutivt levereras till cellytan 27,37, visualiserades levereras till specifika delregioner av plasmamembranet 30. Detta säkerställer att transport till intracellulära avdelningar inte utlöses av överexpression eller närvaron av paGFP taggen.
Diffus paGFP fluorescens kan vara svårt att lokalisera genom konfokal mikroskopi. Enligt vår erfarenhet är APP snabbt klyvs och verkar ha en kort livslängd som en fullängdsprotein på det lysosomala membranet. Detta problem förvärras av det svenska FAD mutation som accelererar hastigheten för APP-spjälkning 34. Att använda tekniken för att snabbt klyvs proteiner, är en inhibitor avgörande för att bestämma den slutliga nedströmskammaren. Hämning av γ-sekretas av L685, 458 eller klorokin leder till betydande ackumulering av APP i lysosomer; även med den svenska mutationen.
Om alltför mycket hämmare används, kan detta leda till intracellulär ackumulation av PAPP-paGFP, och kan leda till proteininneslutningar. Ackumulerat paGFP i inneslutningar resulterar i fluorescerande paGFP inneslutningar i cellen innan försöket har startat (våra opublicerade observationer, dvs behandling över natten med 40 | iM klorokin). En inhibitorkoncentration som förhindrar klyvning av proteinet av intresse, men inte leder till bildning integration bör användas. Över transfektion av celler med paGFP kan också orsaka uppenbara inneslutningar av paGFP, som fluorescerar utan fotoaktivering. Nyligen foto aktiverad paGFP kommer företrädesvis trafik till dessa inneslutningar och störa tolkningen av resultaten. När du letar efter celler till bilden, undvika celler med uppenbara paGFP inneslutningar. Enligt vår erfarenhet med PAPP-paGFP, finns det en mycket svag grön fluorescens i celler som uttrycker PAPP-paGFP på lämplig nivå. Denna svag fluorescens normalt inte kan avbildas och kan bara ses genom okularet.
(dvs. plasmamembran) kan vara svåra att upptäcka. Detta kan bero på att den fluorescerande signalen, sprids över ett stort område, utspädes eller eftersom membranet profilen i tvärsektion är mindre än upplösningen hos det konfokala mikroskopet. Det kan vara möjligt att kringgå detta problem genom avbildning med användning av ett epifluorescensmikroskop. Detta kommer dock att avsevärt minska den rumsliga upplösningen av tekniken.
En fördel med denna teknik är dess tillämplighet på andra membranproteiner. Även om denna teknik är beroende av överexpression av flera proteiner, verkar det som om protein trafficking inte är öppet avbryts, såsom har visats med VSVG-paGFP och PAPP-paGFP 30. Förutom lysosomen har andra markörer av det endosomala / lysosomala systemet också använts med framgång. Dessa inkluderar rab5-mRFP för tidigt slutosome och rab9-mchFP (körsbär fluorescerande protein) för det sena endosomen. Denna kraftfulla mikroskopi teknik kan utvidgas till att följa handel med andra proteiner från TGN. Det kan lika gärna användas för att följa handel mellan diskreta fack som väldefinierade fack markörer finns tillgängliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller intressekonflikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63X 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
References
- Masters, C. L., et al. Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).
- Vassar, R., et al. Beta-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science. 286 (5440), 735-741 (1999).
- De Strooper, B., et al. Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein. Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).
- Xia, W., et al. Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).
- Li, Y. M., et al. Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).
- Kim, W., Hecht, M. H. Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40. J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).
- Pawar, A. P., et al.
- Wen, L., et al. VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer's disease neuropathology. J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).
- Rogaeva, E., et al. The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease. Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).
- Andersen, O. M., et al. Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).
- Schmidt, V., et al. SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1. J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).
- Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer's disease: What are the most promising targets. Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).
- Pasternak, S. H., et al. Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane. J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).
- Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein. Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).
- Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives. Science. 255 (5045), 728-730 (1992).
- Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism. Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).
- Chen, F., et al. Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells. J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).
- Perez, R. G., et al. Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42. J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).
- Cirrito, J. R., et al. Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-β In Vivo. Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).
- Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein. BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).
- Traub, L. M., Kornfeld, S. The trans-Golgi network: a late secretory sorting station. Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).
- Vieira, S. I., et al. Retrieval of the Alzheimer's amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated. Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).
- Sullivan, C. P., et al. Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing. Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).
- Fjorback, A. W., et al. Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing. J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP. Methods. 32 (4), 445-450 (2004).
- Hirschberg, K., et al. Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells. J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).
- Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).
- Hailey, D. W., et al. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation. Cell. 141 (4), 656-667 (2010).
- Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid. Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).
- Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins. Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).
- Herl, L., et al. Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase. Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).
- Lorenzen, A., et al. Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway. Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).
- Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus. J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).
- Thinakaran, G., Koo, E. H. Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function. J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).
- Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region. Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).
- Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic. 11 (1), 13-22 (2000).
- Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites. J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).
