Abstract
ووصف تشريح والتسجيل تقنية جديدة لتلطيخ الرصد البصري واجتثاث تلطيخ محطات سناني الشكل المحيطة بصيلات الشعر في الجلد من الصيوان الماوس. إعداد بسيط وسريع نسبيا، مما أسفر موثوق مناطق واسعة من وحدات المسمى متعددة من الذين يعيشون النهايات العصبية لدراسة امتصاص وإطلاق الأصباغ البيريدينيوم styryl تستخدم على نطاق واسع في الدراسات لإعادة تدوير حويصلة. تقسيم الاستعدادات قبل وضع العلامات يسمح اختبار مقابل مقارنات تحكم في نفس الأذن من فرد واحد. يتم إعطاء نصائح مفيدة لتحسين نوعية إعداد ووضع العلامات والمعلمات التصوير. هذا النظام الجديد هو مناسب لمعايرة دواء وامتصاص وإطلاق هذه الأصباغ الحيوية في محطات سناني الشكل في كل من النوع البري والحيوانات المعدلة وراثيا ميكانيكيا التي يسببها. وثمة أمثلة عن التأثيرات تغييري على وضع العلامات كثافة.
Introduction
النهايات العصبية ميكانيكية حسية وعادة ما تكون صغيرة، وزعت منتشرة ويصعب الوصول إليها في الموقع، وعادة ما يتم دفنها عميقا في الجلد أو الأنسجة المحيطة بها. تصور لهم، ولذلك عادة ما يتطلب باجتزاء تليها immunolabeling لفترة طويلة / فترة تلطيخ، أو التأخير وتكاليف الحصول على خطوط الفأر مع التعبير الجيني للتسميات فلوري مثل البروتين الفلوري الأخضر أو الأصفر (GFP / YFP) 1. نحن هنا تظهر الأنسجة مريحة وطريقة سريعة وبسيطة للوصول إلى أعداد كبيرة من afferents بصيلات الشعر للدراسة، وكيف يمكن أن توصف بسرعة للرصد البصري وظيفة محطة 2. مع الممارسة، ويمكن الانتهاء من تقنية كاملة من تشريح التصوير في اقل من 2 ساعة.
محطات سناني الشكل من المحاور الحسية التعصيب بصيلات الشعر في الثدييات تشكل الحواجز حول ظهارة الشعر المسام، مع كلمحطة تقع بين الدبقية خلية / شوان العمليات 2-4. والغرض من هذه المحطات هو الكشف عن تشريد الميكانيكية من الشعر يحيطون. هم خليط من النهايات التكيف بسرعة وببطء، ولكنها تنتج في الغالب رشقات نارية قصيرة من النشاط في الاستجابة لحركة الشعر. عادة، يتوقف اطلاق النار بسرعة كبيرة عندما تتوقف الحركة، حتى في وجود استمر النزوح.
هذا النموذج الصيوان الفئران لدراسة محطات سناني الشكل طريق وسائل بصرية لديها العديد من الميزات مفيدة لدراسة بنية ووظيفة هذه النهايات. الصيوان هو في الغالب طبقتين من الجلد الرئيسي يعارضها-العودة إلى الوراء، مع كمية صغيرة فقط من نسيج الغضروف بين. الجلد رقيقة جدا وتشريح بسهولة نظرا لكميات ضئيلة من النسيج الضام لاصقة ضعيفة بالنسبة إلى مناطق أخرى من الجسم. طبقات الجلد فصلها بسهولة، وبالتالي، تعطي سهولة الوصول إلى بصيلات والمحطات. تعصيبيمكن الوصول إليها بسهولة والتعرف. يتم توزيع بصيلات الشعر أكثر قليلة منه في مناطق الجلد الأخرى، وتسهيل التصوير من الأفراد أو الجماعات الصغيرة من المسام. طبقة الجلد الأساسية رقيقة يعطي الوصول جيدة لالأصباغ والأدوية الصيدلانية، وذلك هو المثل الأعلى للتصوير بواسطة المجهر مضان دون مزيد من المعالجة. التصوير من محطات المسمى إما أن تكون محطات الذين يعيشون أو، في حالة استخدام التناظرية صبغ قابل للتثبيت، بعد تثبيت ومزيد من المعالجة النسيجي.
وقد استخدمنا هذا التحضير لإظهار أن الغشاء يحدث إعادة التدوير في النهايات سناني الشكل، يتضح من امتصاص (الإلتقام) وإطلاق (إيماس) من صبغة styryl البيريدينيوم (FM1-43؛ ن - (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) البيريدينيوم ثنائي البروميد). الصبغة لا، ومع ذلك، يبدو أن تسمية بشكل كبير خلايا شوان الاستثمار العمليات 2. أظهرنا أيضا أن هذه الصبغة امتصاص / الإفراج عنهم، وبالتالي غشاء صecycling، يخضع للتعديل glutamatergic من خلال شاذة (فسفوليباز يقترن D) metabotropic مستقبلات الغلوتامات. ويوضح نتائج التحفيز وتحليل بروتوكولات بسيطة، وتسليط الضوء على قضايا تحليل المحتملة المشتركة أيضا.
Protocol
وقد استخدمت هذه الأساليب في البحث عنها في البنوك، RW وآخرون. و2 الفئران رصاصة الرحمة إنسانية من قبل خلع عنق الرحم. في المملكة المتحدة، وهذا هو وافق قانونا طريقة الجدول 1 المدرجة في الحيوانات (الإجراءات العلمية) قانون و 1986 و التوجيه الأوروبي 2010/63 / الاتحاد الأوروبي. يتم فرض هذا التشريع الاتحادي محليا في جامعة أبردين من قبل رعاية الحيوان ومجلس المراجعة الأخلاقية التي وافق جميع الإجراءات.
1. الآذان التحضير لوسم
- إعداد محلول فسيولوجي القياسية، مثل Liley في (1956) (5) وتشبع مع 90٪ O 2/5٪ CO 2 (كربوجين). المالحة Liley هي (ملم): NaHCO 3 (12)، بوكل (4)، KH 2 PO 4 (1)، كلوريد الصوديوم (138.8)، MgCl 2 (1)، CaCl 2 (2) والجلوكوز (11). ملاحظة: طوال الفترة المتبقية من هذه المخطوطة، "المالحة" سيتم الرجوع إلى المالحة التي كانت مشبعة تماما مع كربوجين. خلال dissectioن، وتجديد المياه المالحة التي تغطي إعداد كل 15-20 دقيقة.
- إنسانية الموت ببطء ماوس الكبار دون الإضرار الجمجمة. ملاحظة: لقد استخدمت C57 / Bl6J وMF1 الفئران ولكن أي سلالة الماوس يمكن استخدامها. الجانب الأكثر أهمية هو عدم استخدام البالغين كبيرة (> 25 غ). وضع العلامات في الفئران الأكبر هو أقل موثوقية، وغالبا ما ينحصر في مجموعات صغيرة ومتفرقة من المسام.
- إزالة آذان الخارجية (pinnae) بالقرب من قاعدة مع ~ 25 سم مقص، فقط فوق خط الشعر الكثيف، ويغرق في المياه المالحة في سيليكون المطاط مبطنة ثقافة / طبق بتري (50 مم عادة ما تكون مريحة).
- ضع الصيوان الأمامي (مقعرة) الجانب السلبي ويعلقون الهوامش إلى سيليكون على فترات منتظمة مع دبابيس غرامة حشرة (~ 6-8 في الأذن، ~ دبابيس 0.2 مم). تحديث المالحة كل 15-20 دقيقة، أو استخدام حمام perfused باستمرار.
- قشر بعناية بعيدا الجلد الخلفي من الجلد الأمامي عن طريق تشريح حادة، والوصول في البداية من قاعدة قطع من الصيوان علىالغضروف المركزي سميكة وتعمل بشكل منظم نحو، والهوامش الخارجية رقيقة خالية من الغضروف.
- للقيام بذلك، عقد مركز قطع حافة الجلد الخلفي مع زوج لا. 3 ملقط. ثم، مع فكي مغلقة، ووضع نقاط من مجموعة أخرى لا. 3 ملقط في الفجوة بين الجلد والغضروف الأساسي.
- العمل بلطف نقاط ملقط مغلقة من جنبا إلى جنب داخل الفجوة، وذلك باستخدام الحد الأدنى المطلوب للقوة، وتخفيف التصاقات بعناية في حين تقشير يعود الجلد الخلفي للفصل بين الطبقات.
- مع إزالة الجلد الخلفي، وترك الجلد الأمامي في الموقف. دبوس الجلد الخلفي، جنبا الجلدي فوق، بجانب الجلد الأمامي (كما في 1.5 أعلاه).
- المقبل، بعناية وبشكل كامل إزالة غضروف الصيوان الذي تقع بين طبقات البشرة من الجلد الأمامي بنفس الأسلوب تشريح حادة كما في 1.6. تجنب الوقوع في ثقب الثقوب مع ملقط.
- ثم، وأو كليهما المستحضرات الجلدية الصيوان قشر بلطف، نتف وفرك بعيدا طبقة رقيقة من النسيج الضام، تشبه توسيع رغوة البوليسترين، التي تغطي قواعد بصيلات الشعر. ملاحظة: يمكن الحصول على المقاصة المثلى تأخذ القليل من الممارسة. إزالة الأنسجة كافية تعرقل الوصول، سواء بالنسبة للمحلول الصبغة وللتصوير، في حين أن إلغاء بقوة أيضا يزيل الشبكات العصبية التي هي في قاعدة بصيلات.
- تحديث المالحة.
2. سناني الشكل محطة وصفها
ملاحظة: تم تحسين بروتوكول التالية لصبغ styryl البيريدينيوم. يجب أخرى مشابهة كيميائيا، والأصباغ البيريدينيوم styryl العمل، وربما بعد بعض التعديل في التركيز وحضانة الوقت. ارتداء القفازات ومعطف المختبر عند التعامل مع الحلول صبغ. إما شراء 10 ملي حل الأسهم صبغ مباشرة من الشركة المصنعة أو إعداد الأوراق المالية عن طريق إذابة مسحوق صبغة في المياه المالحة دون الجلوكوز. قسامة (10 ميكرولتر عادة مريحة، ولكن ضبط هذه لهيئة السلع التموينية كبيرةتجارب جنيه) وتخزينها المجمدة لمدة تصل إلى 6 أشهر في -20 درجة مئوية أو ~ 1 سنة في -80 درجة مئوية. سوف مسحوق تخزين لمدة 2 سنة على الأقل. تجنب تكرار تجميد / دورات ذوبان حلول صبغ. هذا يبدل طبيعة بسرعة الصبغة. مرة واحدة تفقد تجميدها، وتخزينها في 4 درجة مئوية، واستخدام في غضون أسبوع 1.
- قبل تسخين حمام مائي إلى 30 درجة مئوية، مع منصة ~ 3-5 ملم تحت سطح الماء.
- طازجة إعداد 10 ميكرومتر حل styryl البيريدينيوم صبغ (10 ميكرولتر من إذابة حديثا 10 ملي styryl البيريدينيوم الصبغة في 10 مل المالحة) وتتوازن في حمام مائي.
- دبوس كل إعداد في سيليكون المطاط اصطف 35 أطباق ثقافة مم غارقة في 1-2 ملم من المياه المالحة (حجم نموذجية، ~ 2 مل). وسيكون لكل إعداد الجلد الصيوان تسفر عن اثنين من الاستعدادات إذا خفضت الى النصف من قمة إلى قاعدة مع مقص صغير (10-15 سم طول)، للحد من استخدام الحيوانات.
- ضع الأطباق مم 35 التي تحتوي على الاستعدادات الصيوان المغطاة المالحة على منصة غارقة في 30 درجة مئوية بالحمام المائي. ضمانعمق المياه كافية لظاهرة الاحتباس كافية ولكن لا تلوث المياه المالحة في طبق مفتوح.
- غرامة دبوس (0.5 - القطر الخارجي 1 مم) أنابيب مع تدفق O 2 / CO 2 في قاعدة السيليكون من كل طبق على الغاز بشكل مستمر التحضيرات. وضع أيضا في حمام ماء 100 مل من المياه المالحة خالية من الصبغة لغسل / طبق منعش. استخدام زجاجة مقفول بإحكام للحفاظ على التشبع كربوجين ومنع تلوث المياه.
- تتوازن كل شيء عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم استبدال المالحة على مدى الاستعدادات الصيوان من 100 مل مقفول زجاجة. احتضان لمدة 30 دقيقة أخرى. ملاحظة: هذا بديل يعوض عن تبخر المياه المالحة وأي خسائر حجم الجزء الأكبر من الناتج محتدما خط الغاز.
- صب بعيدا المالحة صبغة خالية في كوب النفايات 100 مل، ثم سرعان ما وصمة عار بعناية بعيدا أي السائل المتبقي حول إعداد مع المناديل الورقية لتقليل الآثار التخفيف على محلول الصبغة التي يمكن ان تضاف المقبل. لا تأخذ الرعاية للمس (
- احتضان الاستعدادات الصيوان في 2-3 مل من 10 ميكرومتر styryl البيريدينيوم صبغ لمدة 40 دقيقة عند 30 درجة مئوية ثم العودة إلى R / T لبقية الإجراءات.
- إزالة غير المنضوية الصبغة في ثلاث مراحل، وذلك باستخدام حلول في R / T. ملاحظة: من الأفضل إجراء هذه الخطوات في ضوء الحد الأدنى المحيطة (ستائر التعتيم، أحمر / برتقالي الإضاءة المنخفضة الكثافة) للبدء في العين داكنة التكيف للتصوير.
- صب بعيدا الحل وضع العلامات من الأطباق في كوب من النفايات وشطف بسرعة في ثلاثة تغييرات من المياه المالحة خالية من الصبغة في تعاقب سريع. هذا يزيل بقايا styryl البيريدينيوم محلول الصبغة التمسك في الأعمال التحضيرية وأي صبغة التي departitions بسهولة من الأغشية المكشوفة.
- احتضان في تغيير النهائي من المياه المالحة خالية من الصبغة لمدة 30 دقيقة أخرى لdepartition صبغ معظم ما تبقى من الأغشية السطحية، أي صبغ ليس داخليا من قبل المحطات.
- إزالة الصبغة المستمر ر عالقةس النشرة الخارجية من الأغشية التي كشفها مخلبية مع المسلفنة-ب سيكلودكسترين مشتق (Advasep-7، 1 ملم، 5 دقيقة - انظر الجدول 1). وبالتالي، فإن جميع الصبغة المتبقية ستكون داخل الأنسجة.
- ضع في المياه المالحة جديدة خالية من الصبغة للتصوير ويجف السطح الخارجي للصحن تماما مع المناديل الورقية.
ملاحظة: المحطات هي الآن جاهزة للتصوير. من المهم أن ندرك أن النهايات سناني الشكل على قيد الحياة، وبالتالي، والإفراج عن endocytosed styryl البيريدينيوم صبغ ببطء مرة أخرى. على الرغم من أن هذا سوف يكون أبطأ في R / T، فمن المهم للحد من التأخير قبل / أثناء التصوير. إذا كانت التجربة يتطلب وضع العلامات الاستعدادات متعددة، والحفاظ في البداية كل منهم تحمل اسما عند 30 درجة مئوية. وسوف تكون قابلة للحياة لعدة ساعات. ثم تسمية بالتتابع على فترات، التي وصفها إعداد الثاني (الخطوات 2.7 - 2.8.3)، في حين التصوير لأول مرة.
3. التصوير إعتبر سناني الشكل النهايات.
ملاحظة: المراقبيجب أن يكون الظلام تكييفها لالخطوات التالية التصوير. على حدة الإبصار زيادة هذا يتيح تعني يطلب من مستويات ضوء أقل إثارة للعثور على بصيلات للتصوير. وهذا هو الأهم لتقليل الضيائية بدلا من الحد من الإزعاج من photobleaching من. الجذور الحرة الناتجة عن شدة إضاءة كاملة يمكن بسرعة (في غضون 60 ثانية) قتل يعيشون النهايات العصبية (GS Bewick، S. فضل وWJ بيتز، والملاحظات غير منشورة).
- قبل التصوير، والتحقق من إعداد تحت مجهر تشريحي تشريح وإزالة بعناية أي حطام السطح. وهذا ما يمنع لصناعة السيارات في مضان تلويث الصور.
- تركيب الطبق على مرحلة مجهر epifluorescence تستقيم مع مجموعة مرشح فلوريسئين القياسية (480-488 نانومتر الإثارة، 500-520 الانبعاثات نانومتر لstyryl البيريدينيوم صبغة).
- التخفيف من شدة الضوء الإثارة مع مرشحات الكثافة محايدة حتى مجرد كافية لتحديد مكان مريح للمحطةالصورة.
- تحديد موقع بصيلات المسمى من خلال مراقبة مع منخفضة (3.5X - 4X هدف الجاف)، ثم تدريجيا أهداف أعلى (الهدف الغمر 10x و 20x والماء) التكبير.
- التقاط الصور من محطات سناني الشكل المسمى من خلال 10X الهدف الجافة لانخفاض القوة و20x وأهداف غمر المياه لأعلى التكبير. تقليل كثافة والتعرض للضوء الوقت (الوقت التكامل الكاميرا 0.5 - يقترح 1 ثانية).
- التقاط الصور في الكاميرا الرقمية القياسية وحفظ الصور على القرص الصلب لجهاز الكمبيوتر باستخدام البرمجيات الاحتكارية. ملاحظة: يتم عرض والمثال النموذجي في الشكل 1.
- صورة ~ 20 النهايات سناني الشكل من كل إعداد. تبدأ في أبعد هامش من حافة القطع في قاعدة للجلد الصيوان والعمل جنبا إلى جنب هذا الهامش التصوير كل بصيلات بدوره. العمل عبر في تداخل قليلا المجالات موازية لقطع حافة، مع الحرص على عدم صورة نفس المسام مرتين وأي التي تضررت بشكل واضح. لاحظ الإعادة عادة الكثير من المحطات سناني الشكل لصورة لهم جميعا قبل أن يحدث كبيرا عفوية اجتثاث تلطيخ. وبالتالي، فإننا نقترح أخذ العينات بشكل منتظم السكان باستخدام بروتوكول التالية.
- بعد الانتهاء من قطاع هامشي، نقل أحد الميداني عرض نحو قاعدة الصيوان، وتكرار هذه العملية في الاتجاه المعاكس.
- صورة كل المحطات التي تواجهها، ما عدا تلك في بعض الأحيان موجهة بشكل واضح أكثر من ذلك بكثير جدا بشكل غير مباشر إلى الطائرة البصرية ومن غير المرجح أن تناسب تماما ضمن معيار العائد على الاستثمار تحليل الحلقي (انظر القسم 4). لا نستبعد lanceolates غير عادي أكثر إشراقا أو باهتة بالمقارنة مع محطات المحيطة بها، إلا إذا كانت معطوبة الواضح أو شدة خلفية مرتفع بشكل خاص، مشيرا إلى تلف الأنسجة المترجمة.
- تجاهل إعداد وإذا كان أكثر من 10٪ من مساحة الجلد / معطوبة محطات / غير صالحة للاستعمال. ملاحظة: كما lanceolates يزيل اللون مع مرور الوقت، والتصوير الكامل لكل إعداد في غضون 20 دقيقة من نهاية الغسيل.
- أناو باستخدام إعداد أكثر من واحد، وضمان مقارنات كثافة صالحة من الاستعدادات مطابقة الوقت. للقيام بذلك، ويقابل توقيت تلطيخ كل بإعداد ~ 30 دقيقة، لضمان إمكانية المقارنة المرات دي وصمة عار.
- لمراقبة دي وصمة عار (إيماس)، صورة نفس المحطة في 5 أو 10 فترات دقيقة. مع الممارسة، فمن الممكن أن الصور تصل إلى 3 محطات منفصلة في كل نقطة زمنية في أي تحضير واحدة.
4. إعتبر سناني الشكل النهايات تحليل.
ملاحظة: الإجراء التالي هو طريقة سريعة لتحليل كثافة الطرفية.
- جعل منطقة حلقية ذات الاهتمام (ROI) تركز على طرف جذع الشعرة في قاعدة بصيلات (الشكل 2). تعيين محيط الداخلي من العائد على الاستثمار الحلقي كبيرة بما يكفي لتجنب جذع الشعرة لصناعة السيارات في مضان في أي جراب ليتم تحليلها ولكن لا يزال يشمل جميع مضان المحطة. تأكد من أن محيط الخارجي كبيرة بما يكفي لإحاطة أكبر ترمنآل المرجح أن تكون واجهتها الذي يكون موجها قريب من المحور البصري / جريب الرئيسي.
- جعل العائد على الاستثمار خلفية متساوية تقريبا في المنطقة إلى بالطوق الهدف (مربع أو دائرة، وعادة ~ 400 ميكرون 2) لتحديد شدة تلطيخ المحلية في المنطقة المجاورة للمحطة قيد التحليل.
ملاحظة: يتم تعيين أحجام هذه رويس اثنين في بداية التحليل واستخدامها لتحليل كل بصيلات / محطات سناني الشكل لاحقة عبر كافة الاستعدادات في أي تجربة واحدة. لذا، فمن المهم أن تعيين المعلمات مع الرعاية في البداية. - وضع العائد على الاستثمار خلفية قريبة بما فيه الكفاية لبصيلات لتمثيل خلفية المحلية في الغدد الدهنية التي تكمن وراء المحطات، وليس أقل كثافة الجلد بين بصيلات، ولكن يجب الحرص على عدم إدراج أي المناطق الطرفية.
- تسجيل شدة متوسط من رويس اثنين باستخدام "قياس" أو "تحليل العائد على الاستثمار 'وظيفة من البيانات والبرمجيات ونقلها إلى جدول بيانات.
- في جدول البيانات، لكل جراب الفردية طرح كثافة الخلفية المحلية يعني من ذلك في الحلقة لإعطاء كثافة الصافية. هذا التعديل لخلفية المترجمة يقلل بدرجة كبيرة من التباين بين-المسام.
Representative Results
وينظر بصيلات الشعر في هذا الإعداد الصيوان بسهولة تحت تضوء دون مضان (الشكل 1A)، مما يدل على طبيعة ضئيلة للغاية من إعداد والسهولة النسبية في الحصول أنه يتيح لهذه المحطات ميكانيكية حسية. وتتميز كل من قاعدة عمود الشعر بارزة اختراق الهلال المظلم من الغدة الدهنية. تحت epifluorescence، محطات سناني الشكل المسمى المحيطة بكل بصيلات الشعر وينظر بشكل واضح وتظهر عادة قوية عفوية styryl صبغ امتصاص (الشكل 1B). يحدث هذا دون حركة المفروضة. وشهدت محطات سناني الشكل لتطويق عمود الشعر، وعلى الرغم من أن مدى تطويق هو متغير 6. الكثير من العلامات غير منقط (بقع) بدلا من الترتيب الخطي الذي كان متوقعا. ويعكس نمط منقط المحطات التي لوحظت في طائرة البصرية على طول المعبر. ثيالصورة إعداد تلقي أي مزيد من المعالجة لتصور بعد وضع العلامات، تم نقله ببساطة إلى مرحلة المجهر وتصويرها في الموقع، والذي يوضح مرة أخرى بساطة هذا المستحضر.
مثال التجارب التي هذا المستحضر الجديد هو مناسبة في الشكل 3. ويمكن استخدامه لدراسة كل الإلتقام وإيماس في محطات المعيشة، وكذلك تعديل بهم. وهكذا، على الإلتقام، يمكن أن الغلوتامات منبهات مستقبلات زيادة كثافة العلامات، في حين وقف الكالسيوم 2+ قنوات مع بروابط أو الكاتيونات مثل المغنيسيوم 2+، ني 2+ أو الكادميوم 2+ يقلل النتيجة 2. بدلا من ذلك، هذا المستحضر يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة حركية إيماس، كما هو مبين في الشكل 3C. أولا، ينظر إلى محطة المسمى دي تلطيخ من تلقاء أنفسهم. ومع ذلك، هو تسارع هذا يزيل اللون من قبل منبه إيماس، latrotoxin. المزيد دي ويمكن رؤية ذيول من النتائج التجريبية في البنوك، RW وآخرون. 2.
الشكل 1. قوية Styryl صبغ وصفها المسجلة في بينا ماوس. (أ) الفصل من إعداد الصيوان الخالي من الملصقات في الإضاءة المجال مشرق، والتي تبين بوضوح كيف تظهر بصيلات الشعر في المناطق التي تم تطهيرها من المغطي الأنسجة الهالي / الدهنية. الظلام، الفص عادة، الأشكال الهلال هي الغدد الدهنية المحيطة رمح الشعر المركزي. (ب) منطقة مماثلة، في التكبير أعلى قليلا والتقط مع epifluorescence، والتي تبين النهايات سناني الشكل المسمى مع صبغة styryl. أشرطة النطاق - 40 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
"1"> 
الشكل 2. تحليل Styryl صبغ وصفها كثافة. (أ) نمط دائري نموذجي لوضع العلامات بصيلات الشعر مع صبغ styryl، تركزت على جذع الشعرة (غير مرئية في هذه الصورة). ويعرف (ب) تحليل الرئيسي "المنطقة من الفوائد" (ROI) من قبل بالطوق القياسية فرضه على موقف جرف من النهايات العصبية سناني الشكل تطويق المسام. يتم الاحتفاظ هذا العائد على الاستثمار المستمر في الشكل والمنطقة لأي تجربة واحدة لضمان وضع العلامات كثافة يمكن مقارنتها إلى حد ما بين التحضيرات وفي جميع العلاجات. يتم احتساب صافي كثافة كل العائد على الاستثمار عن طريق طرح قوة من المنطقة الخلفية مربعة أو دائرية المجاورة (~ 400 ميكرون 2). مرة أخرى، يتم الاحتفاظ هذه المنطقة الخلفية مربع المستمر في الشكل ومنطقة في جميع أنحاء أي تجربة معينة.الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لا يتم توزيع الشكل 3. صفها كثافة الشعر المسام وارد Lanceloate النهايات عادة، ويمكن استخدامه لفحص كل من لانهائي وإيماس. البيانات النموذجية من قياسات كثافة styryl الصبغة في المحطات سناني الشكل المسمى بصورة تلقائية باستخدام أسلوب التحليل هو موضح أعلاه. (A) كثافة وصفها في ظل ظروف التحكم (54 جراب، 4 آذان) و1 الغلوتامات ملي (42 جراب، 4 آذان). يتم عرض القيم كثافة من النهايات الفردية والمؤامرات كتلة نقطة. وتمثل كل نقطة من شدة جرف محطة واحدة حول المسام. لاحظ أنه حتى في ظل ظروف سيطرة عدد قليل من نقاط البيانات (جراب) مكثفة للغاية، في حين تتجمع الأكثر عرضة للشدة أقل. النقطة الأولى في INTENS معينيتم رسم إيتي في المركز ويتم رسم نقاط البيانات اللاحقة من نفس كثافة تدريجيا أكثر إبداعا في أي من الجانبين. وبالتالي، يمثل انتشار الأفقي وتيرة بصيلات أي وضع العلامات كثافة معينة. خطوط أفقية تمثل متوسط ± 25٪ مجموعة الشرائح الربعية. الحضانة مع 1 ملم الغلوتامات تعزز كثافة وسيطة التي كتبها ~ 50٪ (*** P <0.001، مان ويتني)، ولكن وضع العلامات يمكن أن تتعزز 200-300٪ في بعض المحطات. (ب) الصور يدل بوساطة الغلوتامات تعزيز الصبغة امتصاص (الإلتقام). حضانة إعداد بصيلات الشعر في الغلوتامات (1 ملم) يزيد بشكل ملحوظ styryl صبغ امتصاص، كما تجلى في زيادة كثافة العلامات. مقياس شريط 20 ميكرون. (ج) تعزيز الإفراج صبغ (إيماس). بعد وضع العلامات، وصبغ styryl صدر من تلقاء أنفسهم مرة أخرى، كما وصفها في 0 دقيقة أكثر إشراقا بشكل واضح مما كانت عليه في 60 دقيقة، حتى بعد الطرح الخلفية للسيطرة ل photobleaching. هذا الإصدار هو إلى حد كبير بوtentiated التي كتبها latrotoxin، وهي أرملة السوداء العنكبوت السم التأسيسية، التي يطلق غير المنضبط إيماس حويصلة. بعد 60 دقيقة في السم، ووضع العلامات محطة غير قابل للكشف تقريبا. هذه العودة إلى الوراء من العلامات styryl صبغ يدعم فرضية أن يرجع إلى استيعاب خلال إعادة التدوير المحلي للحويصلات تشبه متشابك مضان المحطة. مقياس شريط 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
Bewick وبيتز وضعت أصلا لN- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) البيريدينيوم ثنائي البروميد ذات الصلة الأصباغ styryl البيريدينيوم 7-10 لمراقبة إعادة التدوير المحلي للغشاء الحويصلة متشابك. صبغ امتصاص، وبالتالي زيادة مضان، وبالتالي يعكس متشابك استيعاب غشاء الحويصلة (الإلتقام). وفي وقت لاحق، وهذا صبغ المنضوية يمكن إعادة إصدارها من قبل المزيد من النشاط الكهربائي، والتي تبين فقدان الصبغة تراقب تخريج غشاء الحويصلة (إيماس). في نقاط الاشتباك العصبي، وهذا هو وكيل لإفراز الناقل العصبي. في نفس الوقت، كما وجدنا هذه الأصباغ علامة مميزة النهايات العصبية ميكانيكية حسية الابتدائية 7. وفي الآونة الأخيرة 11، Bewick، البنوك وزملاؤه ثم أظهر أن هذا يعكس عملية مماثلة في ناضجة، والمحطات ميكانيكية حسية متباينة خارج الحي. هنا مرة أخرى، والأصباغ بوسم 50 نانومتر قطر الحويصلات "مثل متشابك" (يتعامل هؤلاء الموردون) أن إعادة تدوير جوهري للافراج عن الغلوتامات.في محطات ميكانيكية حسية، على عكس نظرائهم متشابك، وهذا التدوير هو عفوية في المقام الأول. والتضمين أيضا من قبل الميكانيكية، بدلا من مجرد الكهربائي، التحفيز.
لالخلايا العصبية الحسية في الثقافة وفي خلايا الشعر القوقعة، والأصباغ styryl بشكل عام وstyryl صبغ البيريدينيوم على وجه الخصوص وقد ثبت أن تمر عبر قنوات ميكانيكية حسية، ومنع القنوات ميكانيكية حسية وصفها بشكل لا رجعة فيه الأغشية الداخلية 12. ومع ذلك، في تركيزات styryl صبغ مماثلة في محطات ميكانيكية حسية متباينة في الموقع، وهنا في النهايات سناني الشكل 2، أو في نهايات الأول (أ) في مغزل العضلات 11، وفي خلايا الشعر التي لا يتم تحفيز ميكانيكيا 13 و 14 و وضع العلامات من قبل الإلتقام الغشاء. في النهايات العصبية ميكانيكية حسية، على سبيل المثال، وضع العلامات هو عكسها ولا يمنع الردود ميكانيكية حسية في التراكيز المستخدمة هنا 2، 11، 15. وفي حين أن بعض استيعاب صبغ من قبل تخلل قناة في هذه النهايات لا يمكن استبعاده تماما، ويزيل اللون شبه الكامل مع latrotoxin يشير إلى أن الغالبية العظمى من وضع العلامات في محطات الناضجة هي عن طريق استيعاب مع غشاء الحويصلة إعادة التدوير. لقد وبالتالي، وتستخدم هذه التقنية لدراسة اعتماد النشاط 11، ومؤخرا، والصيدلة 2 من إعادة التدوير السلفادور في المحطات وارد ميكانيكية حسية من خلال دراسة آثار المخدرات على امتصاص وإطلاق الأصباغ.
كما هو الحال مع معظم التقنيات العملية، واستنساخ يتطلب التكرار والممارسة. سيتم الآن مناقشة بعض النقاط الرئيسية لضمان موثوقية. وضع العلامات سناني الشكل في الحيوانات الأصغر سنا هو أكثر موثوقية - وكان أصغر حيوان استخدمنا 15 غرام من وزن الجسم. وليس من الواضح تماما لماذا هذا هو الحال، ولكن قد يكون ذلك بسبب تشريح النسيج الضام الشابة يتطلب أقل الصدمات الميكانيكية ولوأفيس أقل المتبقية بقايا عند إزالة الأنسجة التي تغمر طبقة تعصيب.
وعموما، فإن إعداد الأنسجة بسيط للغاية، مع تقشير طبقات الجلد عدا كونها الجانب العملي الأكثر تحديا تقنيا وبعد ذلك فقط في الفئران الأكبر سنا. في هذه، وطبقات الجلد تلتزم بقوة معا في القاعدة حيث يبدأ تشريح، ولكن حتى هنا الفصل بين طبقات يصبح أسهل بكثير نحو الهوامش. لحسن الحظ، أو ربما نتيجة لذلك، هذه مناطق الجلد هامشية أرق وعادة ما تعطي وصفها مرضية للغاية، وكذلك الجلد الأمامي بشكل عام. لذلك، لا سيما تجنب استيعاب الجلد رقيقة جدا في الهوامش. للحد من خطر تلف، والتعامل معها التحضيرات بشكل غير مباشر عن طريق دفع مع ملقط مغلقة بدلا من استيعاب مباشرة، أو إذا فهم أساسي الأنسجة فقط أكثر صرامة من غير المرجح أن يكون المسمى. كن دقيقا في إزالة طبقة "ورقة البوليسترين" المغطي على الفور المسام، وهذا هو لي الرئيسيانسداد chanical التصوير وصول المخدرات. ومع ذلك، فمن الضروري تقليل الاتصال الجسدي مع الهياكل الأساسية مثل هذا الضرر (أي تجرد بعيدا) والشبكات العصبية ومحطات أقل بقليل. إذا مضان السائد هو أصفر / أبيض في الغدد الدهنية، وبارز لصناعة السيارات في مضان من قواعد عمود الشعر وبعض أهلة برتقالي / أصفر النهايات سناني الشكل، وهذا يشير تم إزالة طبقة الضفيرة العصبية ومحطات سناني الشكل المقترنة أثناء إزالة. هذا ويبدو أن المشكلة الرئيسية مع كبار السن (> 30 ز) الفئران. من خلال كافة الإجراءات تلطيخ، وضمان كل شيء عند 30 درجة مئوية والاوكسيجين بشكل جيد. كن على علم بأن المحطات وصفت لا تزال على قيد الحياة. ونتيجة لذلك، سوف تفرز الصبغة التي كتبها عفوية (التأسيسي) الإفراج exocytic مستمر. هذا وسوف يكون أبطأ في R / T، وإنما هو ممارسة جيدة للحد من التأخير بين إزالة حل خالب والتصوير، للحد من فقدان الصبغة. وعلاوة على ذلك، لمدة تتراوح بين الجماعات الصورة المقارنةtudies من شدة، فمن الضروري لضمان تمثيل جميع الفئات غير المطابقة للوقت. استخدام عامل صباغة مخلبية قبل التصوير يحسن إلى حد كبير على النقيض من الصورة. لذلك، في حين أن تكلفة نسبيا، فإن الخطوة عملية إزالة معدن ثقيل مهمة جدا لضمان جودة الصورة جيدة. استخدام خالب يمكن التقليل عن طريق إعادة استخدام الحل عدة مرات، وحتى على 2-3 أيام متتالية، إذا المخزنة في 4 درجات مئوية بين الاستخدامات. تجاهل الحل خالب بمجرد أن يذهب بشكل ملحوظ وردي، والتي تبين عزل صبغ بها تقترب من مستويات التشبع.
أثناء التصوير، ويكون على بينة من احتمال حدوث ضرر الضوئي السمي لهذه المحطات الحية، وهي نتيجة تراكمية لكل من شدة ومدة التعرض للضوء الإثارة. وهذا الاعتبار هو أقل أهمية للصور timepoint واحد، حيث جودة الصورة هي الشغل الشاغل. ومع ذلك، فإنه من الأهمية بمكان أثناء التصوير تتكرر في دراسات حركية للحد من التعرض للضوء الإثارة إلى أدنى حد ممكن. في حين أن تطوير هذه الأصباغ لنقاط الاشتباك العصبي التسمية، وجدنا الإثارة ل> 1 دقيقة في السلطة الكاملة الإثارة الإضاءة سوف يتسبب في ضرر لا يمكن إصلاحه مثيرة وإلى النهايات العصبية. لأول مرة في وقت لاحق توسيع بشكل كبير، ثم تنهار تماما على مدى فترة من ~ 15 دقيقة. نحن لم يختبر بشكل منهجي المساهمات النسبية من وقت التعرض وشدته، ولكن هذه الملاحظات تشير إلى أن المبدأ التوجيهي يجب أن يكون للحد من كليهما. لذلك، فمن المستحسن أن ضوء الإثارة كثافة ومدة هي الحد الأدنى يتناسب مع الحصول على صور جيدة، وتؤخذ الصور الرقابة المناسبة في الدراسات قتا بالطبع. لاختبار أن البيانات لا تتأثر الضيائية في ظل ظروف التصوير المتكررة، في كل نقطة زمنية التقاط صورة إضافية من محطة unviewed سابقا. هذا هو التأكد من سلوك وصفها في محطات ساذجة يشبه في بصيلات يجري تصويره مرارا وتكرارا.
هناك عدد من العوامل يمكن أن تقلل من التباين داخل المجموعة من صافي كثافة دآتا. وضع دقيق للرويس، ولا سيما العائد على الاستثمار الخلفية، مهم، حتى مناطق صغيرة من تلطيخ غير مناسب يمكن أن تؤثر بشكل كبير بين-جراب تقلب البيانات. ويتأثر التغير في صافي كثافة أيضا كيف تماما المحاصرة كل بصيلات الشعر من جرف النهايات. مقارنة على سبيل المثال، على شكل هلال توزيع العلامات في الشكل 1B مع نمط تقريبا دائري تماما هو مبين في الشكل 2. المزيد تحليل مركب، ربما باستخدام برامج الكشف الآلي والعتبة والتي تكون ضرورية إذا كانت درجة تطويق معلمة ذات الصلة. يرجى ملاحظة أن توزع الكثافة حتى لجماعات بصيلات معظم تحليلها بدقة ليست موزعة بشكل طبيعي (انظر الشكل 3)، مما استلزم استخدام الإحصاءات غير المعلمية للمقارنات بين معاملة الوساطات السكان بدلا من الوسائل. تقنيات التطبيع، مثل التعبير عن شدة كنسبة مئوية من سيتم فرض رقابة F المقابل، أو وجود مجموعة مراقبة تتكون من عدة الاستعدادات، ويمكن تطبيقها للحد من زيادة التقلبات. البند الفني النهائي للنظر هو التصميم التجريبي لاختبار الدوائية. وخلال التحقيقات الدوائية، قبل احتضان إعداد في حل المخدرات لمدة 30 دقيقة قبل تطبيق الصبغة. ثم، والحفاظ على تركيز الدواء في محلول الصبغة. في الضوابط، استخدم إما مالحة أو، إذا تم حل المخدرات في سيارة، والمياه المالحة بالإضافة إلى السيارة.
توضح هذه المادة كيف يقدم هذا المستحضر الصيوان جديد صور عالية الجودة من النهايات ميكانيكية حسية في الجلد مع الحد الأدنى من الإعداد. وتبين لنا أيضا أنها يمكن أن تستخدم لدراسة الصيدلة من عنصرين هامين لإعادة تدوير حويصلة. وتبين لنا أولا أن ناهض مستقبلات الغلوتامات يمكن أن تزيد استيعاب صبغ (علامة من الإلتقام)، والثانية، يتم فقدان الصبغة من جديد مع latrotoxin (منبه من إيماس). وتكمن أهمية هذا preparatأيون والتقنية هو أنه يوفر سهولة الوصول إلى الذين يعيشون الجلد محطات mechanosenory في الموقع لتجارب التصوير، وتكفل فرصا فريدة لرصد بصري وظيفة الطرفية والهيكل وعلاقتها ببعضها. تحقيقا لهذه الغاية الأخيرة، وقد وضعنا أيضا أكثر من ذلك لاستخدامها في دراسات مشتركة البصرية / الكهربية (انظر شقيقة المادة إن الرب لمزيد من التفاصيل).
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة منحة المشروع G0601253 إلى GSB ومراسلون بلا حدود ومنحة SULSA Bioskape إلى GSB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS - Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera - basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Andres, K. H. On the microstructure of receptors on sinus hair. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).
- Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat. PLoS One. 9, e107073 (2014).
- Liley, A. W. An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat. J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).
- Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation. Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Drew, L., Wood, J. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).
