Abstract
טכניקה לנתיחת הקלטת רומן מתוארת מכתים ניטור אופטי מכתים דה מסופי האזמלים סביב זקיקי שיער בעור של אפרכסת אוזן העכבר. ההכנה היא פשוטה ומהירה יחסית, מניב באזורים נרחבים מהימן של מספר יחידות שכותרתו מחיה מסוף העצב ללמוד ספיגה ושחרור של צבעי פירידיניום styryl בשימוש נרחב במחקרים של מחזור שלפוחית. לחלק את ההכנות לפני התיוג מאפשר בדיקה לעומת השוואות מלאות באותה אוזן מאדם יחיד. עצות מועילות ניתנות לשיפור האיכות של התכשיר, התיוג ואת פרמטרי ההדמיה. המערכת החדשה זה מתאים assaying פרמקולוגית מכנית הנגרמת ספיגת ושחרור צבעים חיוניים אלה מסופי אזמלי בשני wild-type ובעלי חיים מהונדסים גנטית. דוגמאות של השפעות modulatory על עוצמת תיוג מקבלים.
Introduction
קצות העצבים mechanosensory הם בדרך כלל קטנים, להפיץ מתפזרים וקשה גישה באתרו, כפי שהם בדרך כלל קבורים עמוק בתוך העור או הרקמות הסובבות אחרים. חזותי אותם, ולכן, בדרך כלל דורש חתך ואחריו immunolabeling ממושכת / תקופה מכתימה, או העיכוב והוצאות קבלת קווי עכבר עם ביטוי גנטי של תוויות ניאון כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק או צהוב (GFP / YFP) 1. כאן אנו מצביעים על רקמה נוחה שיטה מהירה ופשוטה כדי לקבל גישה למספר גדול של afferents זקיק שיער למחקר, וכיצד הם יכולים להיות מתויגים במהירות ניטור אופטי של מסוף פונקציה 2. בעזרת תרגול, את הטכניקה כולו מן לנתיחה כדי הדמיה ניתן להשלים קטנה כמו 2 שעות.
המסופים אזמלי של אקסונים חושי innervating זקיקי שיער אצל יונקי יוצרי Palisades ברחבי האפיתל של זקיק השיער, עם כלהמסוף הדחוק בין תאי גלייה / שוואן מעבד 2-4. מטרת המסוף היא לזהות תזוזה מכאנית של השערות הם מקיפים. הם תערובת של במהירות ולאט לאט סופים התאמה, אבל הם בעיקר לייצר צרורות קצרות של פעילות בתגובת תנועת שיער. בדרך כלל, ירי מפסיק מהר מאוד כאשר התנועה נפסקת, אפילו בנוכחות של עקירה המשיך.
פינה murine זה מודל ללימוד מסופי אזמלי בשיטות אופטיות יש תכונות רבות יתרון ללימוד המבנה והתפקוד של סופים אלה. אפרכסת האוזן היא בעיקר שתי שכבות של עור apposed גב אל גב, עם כמות קטנה בלבד של רקמת סחוס בין. העור הוא דק מאוד גזור בקלות בשל כמויות מינימאליות של יחסי רקמת חיבור דבקים בחולשה לאזורים אחרים בגוף. שכבות העור להפריד בקלות, ולכן, לתת גישה טובה הזקיקים והמסוף. העצבובנגיש וקל לזיהוי בקלות. זקיקי השיער הם יותר בדלילות מופץ מאשר באזורים אחרים לעור, הקלת ההדמיה של קבוצות בודדות או קטנות של זקיקים. שכבת הדרמיס הדקה הבסיסית נותנת נגישות טובה צבעים ותרופות פרמקולוגיים, כך הוא אידיאלי עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ללא עיבוד נוסף. ההדמיה של מסוף מסווג יכולה להיות מסוף חי או, אם באמצעות אנלוגי לצבוע לתקן, לאחר קיבוע ועיבוד היסטולוגית נוסף.
השתמשנו בתכשיר להראות הממברנה כי מיחזור מתרחשת סופים אזמלי, שמעידים ספיגת (אנדוציטוזה) ולשחרר (exocytosis) של צבע styryl פירידיניום (FM1-43; N - (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) dibromide פירידיניום). לצבוע לא, עם זאת, נראה לתייג את תא שוואן להשקיע מעבדת משמעותית 2. גם הראינו כי ספיגת צבע זה / שחרור, ומכאן קרום reCycling, כפוף אפנון glutamatergic דרך קולטן לגלוטמט (D מצמיד פוספוליפאז) הטיפוסי metabotropic. התוצאות של פרוטוקולי גירוי וניתוח פשוטים מומחשות, ונושאי ניתוח פוטנציאל משותפים גם מודגש.
Protocol
שיטות אלו שימשו במחקר דיווחו הבנקים, RW et al. 2 עכברים היו euthanised בצורה אנושית על ידי נקע בצוואר הרחם. בבריטניה, זוהי שיטה בתוספת 1 אושרה כחוק הרשום בעלי החיים (הליכים מדעיים) Act, 1986 הדירקטיבה אירופה 2010/63 / איחוד האירופי. חקיקה זו פדרלית נאכפת באופן מקומי באונ' אברדין ידי צער בעלי חי המועצה לביקורת אתית שאשרה כל ההליכים.
1. אוזני הכנות לקראת תיוג
- הכן תמיסת מלח פיזיולוגית סטנדרטיים, כגון של Liley (1956) 5 ו להרוות את זה עם 90% O 2/5% CO 2 (carbogen). מלוחים של Liley הוא (מ"מ): NaHCO 3 (12), KCl (4), KH 2 PO 4 (1), NaCl (138.8), MgCl 2 (1), CaCl 2 (2) וגלוקוז (11). הערה: לאורך כל השארית של כתב היד הזה, "מלוח" יתייחס מלוח כי הוא רווי לחלוטין עם carbogen. במהלך dissection, לרענן את מלוחים מכסים את ההכנה כל 15 - 20 דקות.
- ברוב אנושי להרדים עכבר מבוגר מבלי לפגוע הגולגולת. הערה: השתמשנו C57 / Bl6J ו MF1 עכברים אבל כל זן העכבר יכול לשמש. ההיבט החשוב ביותר הוא לא להשתמש מבוגרים גדולים (> 25 גרם). תיוג בעכברים גדולים הוא פחות אמין, לעתים קרובות להיות מרותק בקבוצות קטנות מפוזרות של זקיקים.
- הסר את האוזניים החיצוניות (pinnae) סמוך לבסיס במספריים ~ 25 סנטימטר, בדיוק מעל קו השיער הצפוף, לצלול מלוח בצלחת פטרי / תרבות סיליקון מצופה גומי (50 מ"מימ הם בדרך כלל נוחים).
- מקם את הצד פינה קדמית (קעור) למטה להצמיד השוליים אל סיליקון במרווחי זמן קבועים עם סיכות חרקים קנס (~ 6 - 8 לכל אוזן, ~ 0.2 סיכות מ"מ קוטר). רענן מלוחים כל 15 - 20 דקות, או להשתמש באמבט perfused כל הזמן.
- בזהירות לקלף את העור האחורי מהעור הקדמי על ידי דיסקציה קהה, בתחילה הגישה מבסיס חתך של אפרכסת האוזן מעלהסחוס המרכזי העבה באופן שיטתי לעבוד לקראת השולים החיצוניים הדקים ונטול הסחוס.
- כדי לעשות זאת, חזק במרכז קץ החתך של העור האחורי עם זוג לא. 3 מלקחיים. לאחר מכן, עם הלסתות סגורות, למקם את הנקודות של קבוצה נוספת של שום. מלקחיים 3 בפער בין העור והסחוס הבסיסי.
- בעדינות לעבוד את הנקודות של המלקחיים הסגורים מצד אל צד בתוך הפער, באמצעות הכח המינימאלי הנדרש, לשחרר הידבקויות בקפידה תוך לקלף את העור האחורי כדי להפריד בין השכבות.
- עם העור האחורי הוסר, להשאיר את העור הקדמי בעמדה. הצמד את העור האחורי, בצד עורי למעלה, ליד העור הקדמי (לפי 1.5, לעיל).
- לאחר מכן, בזהירות להסיר לחלוטין את הסחוס פינה כי היתה דחוקה בין שכבות העור מפני העור הקדמי על ידי באותה טכניקה דיסקציה קהה כמו 1.6. הימנע עושה חורים לנקב עם מלקחיים.
- לאחר מכן, fאו שניהם הכנות העור פינה בעדינות לקלף, למרוט ו לשפשף את השכבה הדקה של רקמת חיבור, דומת קצף פוליסטירן, המכסה את בסיסי זקיק שיער. הערה: קבלת סליקה אופטימלית יכולה לקחת קצת להתאמן; הסרת רקמות די מפריעה גישה, היא פתרון לצבוע הדמיה, תוך גירוד מדי במרץ מסירה את הרשתות העצביות שהן בבסיס הזקיקים.
- רענן המלוח.
2. תיוג Terminal אזמלי
הערה: הפרוטוקול הבא הוא מותאם במיוחד לצבוע styryl פירידיניום. צבעים אחרים, פירידיניום דומה, styryl כימי אמורים לעבוד, אולי לאחר התאמה מסוימת בזמן ריכוז דגירה. יש להשתמש בכפפות וחלוק מעבדה בעת טיפול פתרונות לצבוע. כך או לקנות פתרון לצבוע מניית 10 מ"מימ ישירות מהיצרן או להכין מלאה על ידי המסת אבקת הצבע מלוח ללא גלוקוז. Aliquot (10 μl הוא בדרך כלל נוח, אבל להתאים את זה עבור SCA גדולle ניסויים) ולאחסן להקפיא עד 6 חודשים ב -20 ° C או ~ 1 שנה ב -80 מעלות צלזיוס. האבקה תשמור עבור 2 שנים לפחות. הימנע להקפיא חוזרות / מחזורי הפשרה של פתרונות צבע; זה במהירות denatures לצבוע. לאחר ההפשרה, ולאחסן ב 4 ° C ולהשתמש תוך 1 בשבוע.
- טרום לחמם באמבט מים עד 30 מעלות צלזיוס, עם פלטפורמה ~ 3 - 5 מ"מ מתחת לפני השטח של המים.
- טרי להכין 10 מיקרומטר פתרון צבע styryl פירידיניום (10 μl של מופשר טרי 10 מ"מ צבע styryl פירידיניום ב 10 מ"ל תמיסת מלח) לאזן באמבט מים.
- פין כל הכנת סיליקון-גומי מצופה 35 מנות מ"מ תרבות שקועות ב 1 - 2 מ"מ של תמיסת מלח (נפח טיפוסי, ~ 2 מיליליטר). כל הכנת העור פינה תניב שני תכשירים אם לחתוך לשניים מן הקודקוד לבסס עם מספריים קטנים (10 - 15 ס"מ אורך), כדי למזער את השימוש בבעלי חיים.
- מניח את כלי 35 מ"מ המכילים הכנות פינת מכוסים המלוחות בפלטפורמה השקועה בתוך waterbath 30 ° C. ודאעומק מים הוא מספיק עבור התחממות נאותה אך לא לזהם את מלוחים בצלחת הפתוחה.
- פין בסדר (0.5 - 1 מ"מ קוטר חיצוני) צינורות עם זורם O 2 / CO 2 לתוך הבסיס סיליקון של כל מנה לתדלק את ההכנות ברציפות. גם למקם לאמבטיה מים 100 מ"ל של תמיסת מלח צבען חינם עבור מרענן כביסה / תבשיל. השתמש בקבוק פקוק בחוזקה לשמור רווית carbogen ומניעת זיהום מים.
- לאזן את הכל בבת C 30 מעלות במשך 30 דקות ולאחר מכן להחליף את מלוחים על ההכנות פינה מן 100 מ"ל פקוק בקבוק. דגירה מינימלי 30 נוספים. הערה: החלפה זה מפצה על אידוי מלוח ובניכוי הפסדים נפח בתפזורת נובע מבעבע הגז אונליין.
- יוצקים משם מלוחים צבען חינם לתוך מבחנה פסולת 100 מ"ל, ואז במהירות ובזהירות למחוק משם כל נוזל שנשאר סביב הכנת בנייר טישו כדי למזער את ההשפעות דילול על הפתרון לצבוע להתווסף הבא. יש להיזהר שלא לגעת (
- דגירה ההכנות פינה ב 2 - 3 מ"ל של צבע 10 מיקרומטר styryl פירידיניום במשך 40 דקות ב 30 מעלות צלזיוס ואז לחזור R / T למשך שארית של ההליך.
- סור לצבוע הלא הפנים בשלושה שלבים, באמצעות פתרונות ב- R / T. הערה: צעדים אלה מבוצעים טובים אור הסביבה מינימאלי (תריסי אפלה, אדום / תאורה בעצמה נמוכה כתומה) כדי להתחיל עין הכהה לאימוצו הדמיה.
- יוצק משם פתרון התיוג מן הכלים לתוך מבחנה פסולת ולשטוף במהירות שלושה שינויים של מלוחים צבען חינם ברצף מהיר. פעולה זו מסירה את דבקות הפתרון לצבוע שיורית styryl פירידיניום להכנות וכל לצבוע כי departitions בקלות מן הקרומים חשוף.
- מדגירים את השינוי הסופי של מלוחים צבען חינם למשך 30 דקות נוספות כדי departition לצבוע הנותרת ביותר מן הקרומים השטח, כלומר, לצבוע לא הפנימו ידי המסופים.
- הסר צבע מתמשך t תקועo את העלון החיצוני של ממברנות נחשפות על ידי chelating עם נגזרת ב-cyclodextrin פעיל מעץ (Advasep-7, 1 מ"מ, 5 דק '- ראה טבלה 1). לפיכך, כל צבע הנותרים יהיה בתוך הרקמות.
- מניחים מלוחים צבען חינם טרי הדמיה ולייבש את החלק החיצוני של הצלחת ביסודיות בנייר טישו.
הערה: המסופים מוכנים כעת הדמיה. חשוב להיות מודעים לכך הסיומים אזמלי הם בחיים, ולכן לאט משחררים את צבען פירידיניום styryl endocytosed שוב. אמנם זה יהיה איטי יותר ב- R / T, חשוב למזער את העיכובים לפני / במהלך ההדמיה. אם הניסוי דורש תיוג של הכנות מרובות, בתחילה לשמור את כולם ללא תווית על 30 מעלות צלזיוס. הם יהיו קיימא במשך מספר שעות. עליו מדבקה ברצף במרווחים, על ידי תיוג הכנת השני (שלבי 2.7 - 2.8.3) תוך ההדמיה הראשונה.
הדמית 3. תווית Endings אזמלים.
הערה: המשקיףצריך להיות כהה מותאם על צעדי ההדמיה הבאות. חדות הראייה הגדלות זו פותחת פתח פירושו רמות אור העירור נמוך נדרשות למצוא את זקיקי הדמיה. זה חשוב ביותר עבור מזעור phototoxicity ולא צמצום אי הנוחות של photobleaching. רדיקלים חופשיים, שנוצרים כתוצאה תאורה בעוצמה מלאה יכול במהירות (תוך 60 שניות) להרוג חיה מסופי העצב (GS Bewick, ס פדול ו WJ בץ, תצפיות לא פורסם).
- לפני ההדמיה, לבדוק את ההכנה תחת סטראו לנתיחה ובזהירות להסיר כל פסולת משטח. הדבר מונע קרינה אוטומטית לזהם את התמונות.
- הר את המנה על הבמה של מיקרוסקופ epifluorescence זקוף עם סט מסנן והעמסה סטנדרטי (480 - 488 עירור ננומטר, 500 - 520 פליטה ננומטר עבור לצבוע styryl פירידיניום).
- להחליש את עוצמת אור העירור עם מסנני צפיפות ניטראליים עד ממש מספיק כדי לאתר את המסוף בנוחותים.
- אתר זקיקים שכותרתו ידי התבוננות עם נמוך (3.5x - 4x אובייקטיבי יבש), ולאחר מכן בהדרגה גבוהה (10x ו 20x אובייקטיבי טבילה במים) מטרות הגדלה.
- צלם תמונות של מסופי אזמלים שכותרתו באמצעות 10x אובייקטיבי יבש עבור צריכת חשמל נמוכה ויעדי טבילה במי 20x עבור גדלה גבוהה. מזער את הזמן עוצם חשיפה לאור (זמן אינטגרצית מצלמה של 0.5 - 1 שניות הוא הציע).
- צלמו תמונות על מצלמה דיגיטלית רגילה ולשמור תמונות על שימוש בתוכנה קניינית כונן קשיח במחשב. הערה: דוגמא טיפוסית מוצגת באיור 1.
- תמונה ~ 20 סופי אזמלים מכל הכנה. התחל הכי רחוק השוליים מהקצה חתך בבסיס העור פינה ולעבוד יחד הדמיה מרווח זה כל זקיק בתורו. עבודת חוצת חופפות מעט בתחומים מקבילים אל הקצה לחתוך, נזהר שלא תמונה הזהה הזקיק פעמים וכל כי הם פגומים ברורים. הערה:מחדש הם בדרך כלל יותר מדי מסופי האזמלים לתדמית כולם לפני מתרחש דה-מכתים ספונטני משמעותי. לפיכך, אנו ממליצים באופן שיטתי דגימה באוכלוסייה באמצעות הפרוטוקול הבא.
- לאחר השלים הרצועה השולית, להזיז אחד בשדה-רוחב לעבר הבסיס של אפרכסת האוזן, וחזור על התהליך בכיוון ההפוך.
- מסופי כל התמונה נתקלו, למעט אלה מדי פעם אורינטציה ברורה הרבה יותר באלכסון למישור האופטי ולא סביר כדי להתאים לחלוטין בתוך ROI הניתוח טבעתי הסטנדרטי (ראה סעיף 4). אל תוציא מהכלל מהרגיל lanceolates בהירים או דימר לעומת המסופים שמסביב, אלא אם ברור שהם פגומים או עוצמת רקע גבוה במיוחד, מה שמצביע על נזק לרקמות מקומי.
- מחק את ההכנה אם יותר מ -10% משטח העור / מסופים פגומים / שמישים. הערה: ככל lanceolates destain עם זמן, הדמיה מלאה כל היערכות בתוך 20 דקות של הסוף בכביסה.
- אניf באמצעות יותר מ הכנה אחד, להבטיח השוואות בעצמה תקפות על-ידי הכנות התאמה אמת. לשם כך, לקזז תזמונים של מכתים כל הכנה על ידי ~ 30 דקות, על מנת להבטיח יכולת ההשוואה של פעמים כתם דה.
- כדי לפקח דה-כתם (exocytosis), התמונה זהה למסוף במרווחי 5 או 10 דקות. בעזרת תרגול, אפשר תמונה עד 3 מסופים נפרדים בכל נקודת זמן בכל כנות.
ניתוח 4. תווית אזמלי Endings.
הערה: ההליך הבא הוא שיטה מהירה לניתוח עוצם סופנית.
- תן באזור טבעתי של עניין (ROI) מרוכז על קצה השערה בבסיס הזקיק (איור 2). הגדר את היקפו הפנימי של ROI טבעתי גדול מספיק כדי למנוע את הקרינה אוטומטי השערה בכל זקיק להיות מנותח אבל עדיין להקיף את כל הקרינה סופנית. ודא כי ההיקף החיצוני הוא גדול מספיק כדי להקיף את termin הגדולאל צפויים כי מכוון קרוב לציר אופטי / הזקיק הראשי.
- הכן ROI רקע שווה בערך באזור אל annulus היעד (ריבוע או עיגול, בדרך כלל ~ 400 מיקרומטר 2) כדי לקבוע את עוצמת מכתים המקומי בקרבת הטרמינל תחת ניתוח.
הערה: גודלן של שני קבוצות ROIs אלה מוגדרים בתחילת הניתוח להשתמש כדי לנתח את כל הזקיקים עוקבים / מסופי אזמלים בכל ההכנות בכל ניסוי אחד. אז, חשוב להגדיר את הפרמטרים שלהם בתשומת לב בהתחלה. - מניח את ההחזר על השקעת הרקע קרובה מספיק כדי הזקיק לייצג רקע מקומי בבלוטות החלב העומדים בבסיס המסופים, לא העור בעצימות הנמוך בין הזקיקים, אבל להיזהר שלא לכלול אזורים סופנית.
- רשום את עוצמת הממוצע של שתי ROIs באמצעות 'מידה' או 'לנתח ROI' פונקציה של תוכנה נתונים והעברת לגיליון אלקטרוני.
- בגיליון האלקטרוני, עבור כל זקיק הפרט להפחית את עוצמת רקע המקומי הממוצע מתחילת כי annulus לתת עוצמת נטו. התאמה זו עבור רקע מקומי מקטינה באופן משמעותי השתנות בין-הזקיק.
Representative Results
זקיקי השיער כהכנת פינה זו נתפסים בקלות תחת שקוף ללא קרינה (איור 1 א), הממחישים את הטבע הדקיק של התכשיר ואת הקלות היחסית של נגישות הוא פותח פתח אל מסופי mechanosensory אלה. כל מאופיין בבסיס הפיר הבולט שיער פירסינג הסהר האפל של בלוטת החלב. תחת epifluorescence, מסופי אזמלי שכותרתו סביב כל זקיק שיער ניתן לראות בבירור ולהראות את ספיגת styryl לצבוע ספונטנית בדרך כלל חזקים (איור 1B). זו מתרחשת ללא תנועה מוטלת. המסופים אזמלי נראים להקיף את השערה, אם כי מידת הכיתור היא משתנה 6. חלק ניכר מן התיוג הוא punctate (כתמים) ולא סדר הליניארי שניתן היה לצפות. דפוס punctate משקף מסופי הנצפה במטוס אופטי לאורך הטרמינל. תיהכנה של קיבל שום עיבוד נוסף להדמיה לאחר תיוג, היא הועברה פשוט לשלב מיקרוסקופ הדמיה באתרו, אשר שוב ממחיש את פשטות ההכנה זה.
דוגמא ניסויים שאליו כנת הרומן הזה היא מתאימה מוצגים באיור 3. ניתן להשתמש בו כדי ללמוד הן אנדוציטוזה ו exocytosis במסופי חיים, כמו גם האפנון שלהם. כך, אנדוציטוזה, אגוניסטים לקולטן גלוטמט יכול להגביר את עוצמת תיוג, תוך חסימת Ca 2 + ערוצים עם ליגנדים או קטיונים כגון Mg 2+, Ni 2 + או Cd 2+ מקטין אותה 2. לחלופין, הכנה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד את קינטיקה של exocytosis, כפי שמוצג באיור 3C. ראשית, מסוף שכותרתו נתפס מכתים דה ספונטני. עם זאת, destain זה מואץ על ידי ממריץ exocytosis, latrotoxin. עוד de זנבות של תוצאות הניסוי ניתן לראות בנקים, RW et al. 2.
איור 1. Styryl יציב תיוג דיי נזקף עכבר הפינה. (א) חלק המכיל תערובת פינה ללא תווית ב תאורה בשדה בהירה, מראה כיצד בבירור זקיקי שיער מופיעים באזורי פינה של מכסת רקמות areolar / שומן. בחושך, בדרך כלל bilobed, צורות הסהר הן בלוטות חלב סביב השערה המרכזית. (ב) שטח דומה, בהגדלה גבוהה במקצת צילמו עם epifluorescence, מראה סופים אזמלי שכותרתו עם צבע styryl. ברי סולם -. 40 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
"1"> 
ניתוח איור 2. עוצמת תיוג Styryl דיי. (א) בתבנית עגולה אופיינית של תיוג זקיק השיער עם צבע styryl, מרוכז על השערה (לא נראה בתמונה זו). (ב) "האזור של עניין" הניתוח הראשי (ROI) מוגדר על ידי annulus סטנדרטי על גבי זו עמדת המשוכה של קצות עצבי אזמלי כיתור הזקיק. ROI זה נשמר קבוע בכושר ואזור עבור כל ניסוי בודד כדי להבטיח עוצמת תיוג שניתן לבצע השוואה הוגנת בין הכנות ועל פני כל הטיפולים. עוצמת נטו של כל ROI מחושבת על ידי הפחתת עוצמת אזור רקע ריבועים או עגול סמוך (~ 400 מיקרומטר 2). שוב, באזור רקע ריבועים זה נשמר קבוע בכושר ואזור לאורך כל ניסוי נתון.Target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Intensity תיוג איור 3. של זקיק השיער מביא Lanceloate Endings אינו מופץ בדרך כלל, והוא יכול לשמש כדי לבחון שני פְּנִים ו Exocytosis. נתונים אופייניים ממדידות עוצמות צבע styryl במסופי אזמלים שכותרתו ספונטנית בשיטת הניתוח שתוארה לעיל. (א) עוצמת תיוג בתנאים מבוקרים (54 זקיקים, 4 אוזניים) ו 1 גלוטמט מ"מ (42 זקיקים, 4 אוזניים). את ערכי העצמה של סופי הפרט מוצגים מגרשים נקודת אשכול. כל נקודה מייצגת את עוצמת משוכת מסוף אחד סביב זקיק. יש לציין כי אפילו בתנאים מבוקרים כמה נקודות נתונים (זקיקים) הם מאוד אינטנסיביות, בעוד רוב המקובצים בעוצמות נמוכות יותר. הנקודה הראשונה בכל intens בפרטity זמם במרכז ונקודות נתונים הבאות של באותה העצמה הם זממו בהדרגה יותר רוחבי צידיו. לפיכך, התפשטות לרוחב מייצגת את התדר של זקיקים של כל עוצמת תיוג מסוימת. הקווים האופקיים מייצגים טווח בין-רבעוני חציון ± 25%. דגירה עם הגלוטמט 1 מ"מ משפרת את עוצמת החציוני על ידי ~ 50% (*** P <0.001, Mann-Whitney), אבל תיוג ניתן לשפר ב -200 - 300% ב מסופים מסוימים. תמונות (B) הוכחת ספיגת צבע משופר בתיווך גלוטמט (אנדוציטוזה). דגירה של תכשיר זקיק שיער גלוטמט (1 מ"מ) עולה באופן ניכר ספיגה צבע styryl, כפי שמוצגת על ידי עוצמת התיוג הגדלה. סרגל קנה מידה 20 מיקרומטר. (ג) שחרור לצבוע שיפור (exocytosis). לאחר תיוג, לצבוע styryl הוא שוחרר באופן ספונטני שוב, כמו תיוג ב 0 דקות בהיר בבירור מאשר ב -60 דקות, גם לאחר חיסור רקע לשלוט עבור photobleaching. גרסה זו היא מאוד potentiated ידי latrotoxin, מרכיב ארס אלמנה שחורה עכביש, אשר מפעיל exocytosis שלפוחית בלתי מבוקרת. לאחר 60 דקות ב רעלן, תיוג הטרמינל הוא כמעט בלתי מורגש. הפיכות זה של תיוג לצבוע styryl תומכות בהשערה כי קרינת מסוף הוא עקב הפנמה במהלך המחזור המקומי של שלפוחית דמוית הסינפטי. סרגל קנה מידה 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
במקור Bewick ו בץ פיתחה את N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) פירידיניום dibromide הקשורות צבעי styryl פירידיניום 7-10 לפקח המיחזור המקומי של קרום שלפוחית סינפטית. ספיג דיי, ומכאן קרינה גדלה, ולכן משקף הפנמת קרום שלפוחית סינפטית (אנדוציטוזה). בהמשך לכך, לצבוע הפנים זה יכול להיות שפורסמה מחדש על ידי פעילות חשמלית הלאה, מראה הפסד לצבוע מפקחת החצנת קרום שלפוחית (exocytosis). סינפסות, זה מה שמייצג הפרשת הנוירוטרנסמיטר. במקביל, מצאנו גם צבעים אלה תווית קצות עצבים mechanosensory עיקריים 7. לאחרונה 11, Bewick, בנקים ועמיתיו מכן הראו כי זה משקף תהליך דומה בוגרת, מסופי mechanosensory בדיל vivo לשעבר. הנה שוב, צבעים לתייג 50 ננומטר בקוטר 'הסינפטי דמוי' שלפוחית (ספקים חד-לשוניים) כי למחזר constitutively לשחרר גלוטמט.לכך במסופי mechanosensory, בניגוד לעמיתיהם סינפטיים שלהם, מחזור זה ספונטני בעיקר. זה הוא מווסת גם על ידי מכאני, ולא רק חשמל, גירוי.
עבור עצב סנסורי בתרבות בתאי השיער שבלול, צבעי styryl ב לצבוע פירידיניום בכלל styryl בפרט הוכחו לעבור בצינורות mechanosensory, חסימת ערוצי mechanosensory ובאופן בלתי הפיך תיוג ממברנות פנימיות 12. עם זאת, בריכוזים דומים לצבוע styryl במסופי mechanosensory בדיל באתרו, כמו כאן סופים אזמלי 2, או סופי Ia ב כישור שריר 11, ו בתאי שיער שאינם מגורים באופן מכאני 13, 14, תיוג הוא על ידי אנדוציטוזה הממברנה. לכך במסופי עצב mechanosensory, למשל, התיוג הוא הפיך ואינו חוסם את תגובות mechanosensory בריכוזים משמשים כאן 2, 11, 15. בעוד כמה הפנמה לצבוע ידי חלחול ערוץ הסופים אלה לא ניתן לשלול לחלוטין, destain כמעט המוחלטת עם latrotoxin מציינת את הרוב הגדול של התיוג במסופי בוגרת הוא על ידי הפנמה עם קרום שלפוחית מחזור. יש לנו, אם כן, השתמשתי בטכניקה זו כדי לחקור את תלות פעילות 11, ולאחרונה, הפרמקולוגיה 2 של מחזור SLV במסופים מביאים mechanosensory ידי בחינת שפעות תרופה על ספיגת שחרורו של הצבעים.
כמו ברוב טכניקות מעשיות, שחזור דורש חזרה ותרגול. כמה נקודות מפתח עבור הבטחה אמינה יידונו עכשיו. תיוג אזמלים בחי צעיר הוא אמין יותר - החיה הקטנה השתמשנו הייתה משקל גוף 15 גרם. זה לא לגמרי ברור מדוע זה מקרה, אבל זה יכול להיות בגלל דיסקציה של רקמת החיבור הצעירה דורשת טראומה מכאנית פחות leAves פחות הנותרים שאריות בעת הסרת רקמות שמעל שכבת העצבוב.
באופן כללי, הכנת הרקמה היא די פשוטה, עם קילוף שכבות העור מלבד היותו ההיבט המעשי המאתגר ביותר מבחינה הטכנית וגם אז רק עכברים מבוגרים. בשינה אלה שכבות העור לדבוק יחד בחום בבסיס שבו לנתיחה מתחילה, אך גם כאן הפרדת השכבות הופכת לקלה הרבה יותר לכיוון השולי. למרבה המזל, או אולי כתוצאה מכך, אזורי העור השוליים המדללים אלה בדרך כלל לתת התיוג משביע הרצון ביותר, כפי שעושה את העור הקדמי בדרך כלל. לכן, במיוחד להימנע לתפוס את העור מאוד דק בשוליים. כדי למזער את הסיכון לניזק, לתפעל הכנות בעקיפין על ידי דחיפה עם מלקחיים סגורים ולא האחיזה ישירות, או אם להיות מתויגות קשות לתפוס חיוני רק רקמות סבירות. להיות יסודי הסרת שכבת 'גיליון הקלקר' מייד שמעל הזקיקים, כמו זה האני הראשיחסימת chanical הדמיה וגישת תרופה. עם זאת, זה חיוני כדי למזער מגע פיזי עם מבנים בסיסיים כפיצויים זה (כלומר, רצועות ממנו) הרשתות העצביות ומסופים ממש מתחת. אם הקרינה השולטת היא צהובה / לבן בבלוטות החלב, קרינה אוטומטית הבולטת של בסיסי ההשערה כמה סהרוני קצים כתומים / צהובים אזמלים, זה מצביע על שכבת מקלעת עצבים ומסופי האזמלים קשורים הוסרו במהלך פינוי. זו כנראה הבעיה העיקרית עם מבוגרים (> 30 גרם) עכברים. לאורך כל ההליכים המכתימים, לוודא שהכל הוא על 30 מעלות צלזיוס היטב מחומצן. עליך להיות מודע לכך מסופי שכותרתו הם עדיין בחיים. כתוצאה מכך, לצבוע יהיה מופרש על ידי שחרור exocytic ספונטני מתמשך (מכונן). זה יהיה איטי יותר ב- R / T, אבל זהו תרגול טוב כדי למזער את העיכוב בין הסרת פתרון chelator והדמיה, כדי להקטין את איבוד הצבע. יתר על כן, עבור בין-קבוצות של השוואתיtudies של אינטנסיביות, זה הכרחי כדי להבטיח הדמיה של כל הקבוצות היא בהתאמה זמן. שימוש סוכן צבען chelating לפני ההדמיה משפר באופן משמעותי לעומת תמונה. כך, בעוד יקר יחסית, צעד קלאציה הוא די חשוב להבטחת איכות תמונה טובה. ניתן למזער שימוש chelator על ידי שימוש חוזר הפתרון מספר פעמים, ואף על 2 - 3 ימים רצופים, אם מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בין השימושים. מחק את פתרון chelator פעם זה הולך ורוד ניכר, מראה קיבוע הצבע שלה מתקרב לרוויה.
במהלך הדמיה, להיות מודעים לפוטנציאל עבור נזק phototoxic מסופי חיים אלה, שהינה תוצאה מצטברת של שני האינטנסיביות ואת זמן החשיפה של האור עירור. שיקול זה הוא פחות חשוב עבור תמונות timepoint היחיד, שבו איכות התמונה היא הדאגה העיקרית. עם זאת, חשוב במהלך ההדמיה חזרה במחקרים קינטיקה להפחית עירור חשיפה לאור למינימום. תוך פיתוח צבעים אלה כדיסינפסות תווית, מצאנו עירור עבור> 1 דקות ב תאורה עירור מלוא העוצמה תגרום נזק דרמטי בלתי הפיך מסופי העצב. הם ראשונים ובהמשך מרחיבים עצום, ואז להתמוטט לחלוטין על פני תקופה של ~ 15 דק '. אנחנו באופן שיטתי לא בודקים את התרומה היחסית של זמן חשיפה ועוצם, אך תצפיות אלה מראים העיקרון המנחה צריך להיות כדי למזער את שניהם. אז, מומלץ כי עירור אור עוצם ומשך הם המינימום בקנה אחד עם מקבל תמונות טובות, ותמונות בקרה נאותות נלקחות במחקרי זמן כמובן. כדי לבדוק שהנתונים אינם מושפעים phototoxicity בתנאי הדמיה חוזר ונשנים, בכל נקודת זמן לקחת תמונה נוספת של טרמינל בעבר שלא נצפה. זאת על מנת להבטיח את התנהגותם של התיוג במסופים נאיביים דומה לזו בזקיקים להיות הדמיה שוב ושוב.
מספר גורמים יכולים להפחית את ההשתנות בתוך הקבוצה של ד העוצם נטואתא. מיקום מדויק של ROIs, במיוחד את ההחזר על ההשקעה רקע, חשוב, כמו גם אזורים קטנים של מכתים הולם יכול להשפיע בין-זקיק מאוד השתנות הנתונים. ההשתנות של עוצמת נטו גם מושפעת כיצד לחלוטין כל זקיק שיער מוקף המשוכה של הסופים. השוואה למשל, חלוקת תיוג בצורה חצי הסהר באיור 1B עם הדפוס כמעט לחלוטין עגול שניתן לראות באיור 2. ניתוח מורכב יותר, אולי באמצעות זיהוי תוכנה אוטומטיים thresholding, נחוצה אם מידת הכיתור היא פרמטר רלוונטי. שים לב כי ההפצות בעצמה אפילו קבוצות הזקיק נתחו בצורה המדויקת ביותר אינן מתחלקים בדרך כלל (ראה איור 3), דבר המחייבות את השימוש בסטטיסטיקה הלא פרמטרית להשוואות בין-הטיפול של חציוני אוכלוסייה ולא אמצעי. טכניקות נורמליזציה, כגון לבטא עוצמות כמו o אחוזשליטה נגדית f, או של קבוצת ביקורת מורכבת הכנות כמה, ניתן ליישם כדי להפחית עוד יותר השתנות. הפריט הטכני הסופי שיש לקחת בחשבון הוא תכנון הניסוי לבדיקה תרופתית. במהלך חקירות תרופתיות, טרום דגירה הכנה בפתרון תרופה למשך 30 דקות לפני יישום צבע. לאחר מכן, לשמור על ריכוז התרופה בתמיסת הצבע. בשינה שולטת, השתמש באחת מלוח או, אם התרופה מומסת רכב, מלוח פלוס רכב.
המאמר הנוכחי מדגים כיצד הכנה פינה חדשה זו מציעה תמונות באיכות גבוהות של סופי mechanosensory בעור עם הכנה מינימאלית. אנחנו גם להראות את זה יכול לשמש כדי לבחון את פרמקולוגיה של שני היבטים קריטיים של מחזור שלפוחית. אנחנו מראים הראשון אגוניסט קולטן הגלוטמט יכול להגדיל הפנמה לצבוע (סמן של אנדוציטוזה), ושנית, לצבוע, כי הוא איבד שוב עם latrotoxin (ממריץ של exocytosis). המשמעות של preparat זהיון וטכניקה הוא שהיא מציעה גישה מצוינת לחי מסופי mechanosenory עור באתרו לניסויי הדמיה, ונותן הזדמנויות ייחודיות עבור ניטור אופטי של פונקצית מסוף, מבנה-היחסים בין שלהם. לשם אחרון זה, פתחנו גם אותו עוד יותר לשימוש במחקרים אופטיים / אלקטרו משולבים (ראה מאמר יופיטר אחות לפרטים נוספים).
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
העבודה מומנה על ידי מענק G0601253 הפרויקט המועצה למחקר רפואי בבריטניה GSB ו RWB ומענק SULSA Bioskape כדי GSB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS - Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera - basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Andres, K. H. On the microstructure of receptors on sinus hair. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).
- Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat. PLoS One. 9, e107073 (2014).
- Liley, A. W. An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat. J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).
- Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation. Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Drew, L., Wood, J. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).
