Abstract
Een nieuw dissectie en opnametechniek beschreven voor optische bewaking kleuring en de kleuring van lancetvormige terminals rond haarfollikels in de huid van de muis oorschelp. De bereiding is eenvoudig en relatief snel, betrouwbaar waardoor uitgebreide regio's van meerdere gelabelde eenheden van levende zenuwuiteinden om de opname en afgifte van styryl pyridinium kleurstoffen op grote schaal gebruikt in studies van blaasje recycling te bestuderen. Onderverdelen van de voorbereidingen voor de etikettering maakt testen versus controle vergelijkingen in hetzelfde oor van een enkel individu. Handige tips worden gegeven voor het verbeteren van de kwaliteit van de voorbereiding, de etikettering en de imaging parameters. Dit nieuwe systeem is geschikt voor het testen van farmacologisch en mechanisch geïnduceerde opname en afgifte van deze vitale kleurstoffen in lancetvormige terminals in zowel wildtype en genetisch gemodificeerde dieren. Voorbeelden van modulerende invloeden op de etikettering intensiteit worden gegeven.
Introduction
Mechanosensorische zenuwuiteinden zijn meestal klein, diffuus verspreid en moeilijk toegankelijk in situ, omdat ze doorgaans diep in de huid of andere omliggende weefsels zijn begraven. Visualiseren, dus meestal vereist snijden, gevolgd door een langdurige immunokleuring / vlekken periode, of de vertraging en de kosten van het verkrijgen van de muis lijnen met een genetische expressie van fluorescente labels, zoals groen of geel fluorescerend eiwit (GFP / YFP) 1. Hier tonen wij een geschikte weefsel en een snelle en eenvoudige manier toegang tot grote aantallen haarfollikel afferentia voor studie krijgen en hoe ze snel kunnen worden gelabeld voor de optische controle van terminal 2 functie. Met de praktijk, kan de gehele werkwijze van dissectie beeldvorming in minder dan 2 uur voltooid.
De lancetvormige terminals van sensorische axonen innerveren haarfollikels bij zoogdieren vormen palissaden rond het epitheel van de haar-follikel, met elkaarterminal ingeklemd tussen gliale / Schwann cel verwerkt 2-4. Het doel van de terminals mechanische verplaatsing van de haren ze omringen detecteren. Ze zijn een mengsel van snel en langzaam aanpassing eindes, maar voornamelijk produceren korte uitbarstingen van activiteit in reactie op haar beweging. Typisch het afvuren stopt snel wanneer beweging ophoudt, zelfs in aanwezigheid van voortdurende verplaatsing.
Dit murine oorschelp Modelmatige lancetvormige terminals door optische methoden heeft vele voordelige kenmerken voor het bestuderen van de structuur en functie van deze uitgangen. De oorschelp is overwegend twee huidlagen apposed back-to-back, met slechts een kleine hoeveelheid tussen kraakbeenweefsel. De huid is dun en gemakkelijk ontleed door minimale hoeveelheden lijm zwak bindweefsel opzichte van andere delen van het lichaam. De eenvoudig gescheiden huidlagen, daarom geven een goede toegang tot de follikels en terminals. de innervatieis gemakkelijk bereikbaar en herkenbaar. De haarfollikels dunner verdeeld dan in andere huidgebieden, vergemakkelijkt de beeldvorming van individuele of kleine groepen follikels. De dunne onderliggende huidlaag geeft een goede toegankelijkheid van kleurstoffen en farmacologische drugs, en is dus ideaal voor de beeldvorming door middel van fluorescentie microscopie zonder verdere verwerking. De beeldvorming van gelabelde terminals kan zowel van levende terminals of, bij gebruik van een opgelapt kleurstof analoog, na fixatie en verdere histologische verwerking.
We hebben dit preparaat gebruikt om dat membraan recycling plaatsvindt in de lanceolate eindes, blijkt uit de opname (endocytose) en afgifte (exocytose) van een styryl pyridinium kleurstof (FM1-43 te tonen; N - (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium dibromide). De kleurstof echter niet, lijken aanzienlijk te bestempelen het investeren Schwann cel verwerkt 2. We toonden ook aan dat deze kleurstof opname / release, en dus membraan reCycling, is onderworpen aan glutamaat modulatie door middel van een atypische (fosfolipase-D gekoppeld) metabotrope glutamaat receptor. De uitkomsten van eenvoudige stimulatie en analyse protocollen worden geïllustreerd, en gemeenschappelijke mogelijke analyse kwesties worden ook gewezen.
Protocol
Deze werkwijzen werden gebruikt in de gerapporteerde Banks onderzoek, RW et al. 2 muizen werden humane geëuthanaseerd door cervicale dislocatie. In het Verenigd Koninkrijk is dit een wettelijk goedgekeurde Schedule 1 methode in de Dieren (Scientific Procedures) vermeld Act, 1986 en de Europese Richtlijn 2010/63 / EU. Deze federale wetgeving wordt lokaal afgedwongen bij de Universiteit van Aberdeen door de Animal Welfare en Ethical Review Board, die alle procedures hebben goedgekeurd.
1. Voorbereiding Ears voor Labeling
- Bereid een standaard fysiologische zoutoplossing, zoals Liley's (1956) 5 en verzadigd is met 90% O2 / 5% CO 2 (carbogen). Liley's zoutoplossing (mM) NaHCO3 (12), KCl (4), KH 2PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCl2 (1), CaCl2 (2) en glucose (11). OPMERKING: Gedurende de rest van dit manuscript "saline" zal verwijzen zoutoplossing die volledig is verzadigd met carbogeen. tijdens dissection, vernieuw de zoutoplossing voor het voorbereiden om de 15 - 20 min.
- Humaan euthanaseren een volwassen muis zonder beschadiging van de schedel. LET OP: We hebben gebruikt C57 / Bl6J en MF1 muizen, maar elke muis stam kan worden gebruikt. Het belangrijkste aspect is groot volwassenen (> 25 g) te gebruiken. Labeling in grotere muizen is minder betrouwbaar, vaak wordt beperkt tot kleine en verspreide groepen van follikels.
- Verwijder de externe oren (oorschelpen) in de buurt van de basis met ~ 25 cm schaar, net boven de dichte haar lijn, en onderdompelen in een zoutoplossing in een siliconen-rubber bekleed cultuur / petrischaal (50 mm is meestal handig).
- Plaats de oorschelp anterior (holle) naar beneden en speld de marges aan de siliconen regelmatig met fijne insect pinnen (~ 6-8 per oor, ~ 0,2 mm diameter pinnen). Vernieuwen zoutoplossing elke 15 - 20 minuten, of gebruik een constant geperfundeerd bad.
- Verwijder voorzichtig weg het achterste vel van de voorste huid door stompe dissectie, in eerste instantie de toegang van de snede basis van de oorschelp voorbijde dikke centrale kraakbeen en systematisch werken aan de dunne, kraakbeen-vrije externe marges.
- Hiertoe houdt het centrum van de snijrand van het achterste vel met een paar niet. 3 forceps. Dan, met de kaken gesloten, plaats de punten van een andere set van niet. 3 forceps in de ruimte tussen de huid en de onderliggende kraakbeen.
- Voorzichtig werken met betrekking tot de gesloten tang van links naar rechts in de opening, met de minimale vereiste kracht, voorzichtig los verklevingen terwijl afpellen van het achterste vel om de lagen te scheiden.
- Met het achterste huid verwijderd, laat de voorste huid op zijn plaats. Speld de achterste huid, de huid naar boven, naast de voorste huid (volgens 1.5, hierboven).
- Vervolgens zorgvuldig en volledig verwijderen van de oorschelp kraakbeen dat is ingeklemd tussen de huidlagen van de voorste huid door dezelfde stompe dissectie techniek als in 1.6. Maak geen gaatjes met de tang.
- Vervolgens, fof beide oorschelp huid voorbereidingen zachtjes schil, pluk en wrijf weg de dunne laag van bindweefsel, die lijkt op geëxpandeerd polystyreenschuim, dat de haarfollikel bases dekt. NB: Het verkrijgen van een optimale clearing kan een beetje oefening nemen; onvoldoende weefselverwijdering hindert toegang, zowel kleurstofoplossing en beeldvorming, terwijl schrapen te krachtig verwijdert de neurale netwerken die aan de basis van de follikels.
- Vernieuw de zoutoplossing.
2. Lanceolate Terminal Labeling
Opmerking: Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor styryl pyridinium kleurstof. Andere, chemisch vergelijkbaar, styryl pyridinium kleurstoffen moeten werken, misschien na enige aanpassing in de concentratie en de incubatietijd. Draag handschoenen en een laboratoriumjas bij het hanteren van kleurstof oplossingen. Ofwel koopt 10 mM voorraad kleurstofoplossing rechtstreeks van de fabrikant of voor te bereiden voorraad door het oplossen van de kleurstof poeder in een zoutoplossing zonder glucose. Monster (10 ui is meestal handig, maar passen dit voor grote scale experimenten) en opslag ingevroren voor maximaal 6 maanden bij -20 ° C of ~ 1 jaar bij -80 ° C. Poeder worden opgeslagen gedurende ten minste 2 jaar. Vermijd herhaalde vries / dooi cycli van kleurstof-oplossingen; deze snel denatureert de kleurstof. Eenmaal ontdooid, bewaren bij 4 ° C en gebruik binnen 1 week.
- Verwarm een waterbad tot 30 ° C, met een platform ~ 3-5 mm onder het oppervlak van het water.
- Vers bereid 10 uM styryl pyridinium kleurstofoplossing (10 ui vers ontdooide 10 mM styryl pyridinium kleurstof in 10 ml zoutoplossing) en equilibreren waterbad.
- Pin elke bereiding in een siliconen-rubber bekleed 35 mm cultuur gerechten ondergedompeld in 1-2 mm van een zoutoplossing (typisch volume ~ 2 ml). Elke oorschelp huid voorbereiding zal twee bereidingen opleveren als in tweeën gesneden van apex naar de basis met een klein schaartje (10 - 15 cm lengte), om het gebruik van dieren zoveel mogelijk te beperken.
- Plaats de 35 mm schaaltjes met de met zoutoplossing behandelde pinna preparaten in de ondergedompeld platform in het 30 ° C waterbad. Zorg ervoor dat dewaterdiepte voldoende is voor een adequate opwarming, maar niet het zoute verontreinigen in de open schotel.
- Pin prima (0,5-1 mm buitendiameter) buis met vloeiende O 2 / CO 2 in de siliconen basis van elk gerecht om continu gas de voorbereidingen. Ook te plaatsen in het waterbad van 100 ml van de kleurstof-free zoutoplossing voor het wassen / schotel verfrissend. Gebruik een goed afgesloten fles om carbogen verzadiging behouden en waterverontreiniging te voorkomen.
- Evenwicht alles bij 30 ° C gedurende 30 minuten en plaats de zoutoplossing over de oorschelp voorbereidingen van het 100 ml afgesloten fles. Incubeer nog eens 30 minuten. LET OP: Deze vervanging compenseert voor zout verdamping en eventuele bulk volume verliezen als gevolg van gas-lijn borrelen.
- Giet weg dye-vrije zoutoplossing in een 100 ml afval beker, dan snel en voorzichtig dep weg eventuele resterende rond de voorbereiding met papieren zakdoekje vloeistof tot een minimum te beperken verwatering effecten op de kleurstof oplossing naast worden toegevoegd. Neem zorg niet aan te raken (
- Incubeer pinna preparaten in 2-3 ml 10 pM styryl pyridinium kleurstof gedurende 40 minuten bij 30 ° C dan terug naar R / T voor de rest van de procedure.
- Verwijder niet-geïnternaliseerde kleurstof in drie fasen via oplossingen bij R / T. LET OP: Deze stappen zijn het best uitgevoerd in een mum van omgevingslicht (verduisterende rolgordijnen, rood / oranje lage intensiteit verlichting) om te beginnen met het oog dark-aanpassing voor de beeldvorming.
- Giet weg de etikettering oplossing uit de gerechten in een verspilling beker en snel te spoelen in drie veranderingen van de dye-vrije zoutoplossing in hoog tempo op. Dit verwijdert de resterende styryl pyridinium kleurstof oplossing vast te houden aan de voorbereidingen en elke kleurstof die gemakkelijk departitions uit blootgesteld membranen.
- Incubeer in een verandering kleurstof-zoutoplossing gedurende nog eens 30 min meeste resterende kleurstof departition oppervlak van membranen, dat wil zeggen, kleurstof niet geïnternaliseerd door de terminals.
- Verwijder hardnekkige kleurstof vast to de externe bijsluiter van blootgestelde membranen door chelerende met gesulfoneerde b-cyclodextrinederivaat (Advasep-7, 1 mM, 5 min - zie tabel 1). Zo zullen alle resterende kleurstof in het weefsel.
- Plaats in verse kleurstofvrije zoutoplossing beeldvorming en de buitenkant van de schaal drogen met tissue papier.
OPMERKING: De klemmen zijn nu klaar voor beeldvorming. Het is belangrijk om te beseffen dat de lanceolate eindes zijn in leven en dus weer langzaam het vrijgeven van de endocytosed styryl pyridinium kleurstof. Hoewel trager bij R / T zal zijn, is het belangrijk om vertragingen voor / minimaliseren tijdens de beeldvorming. Indien het experiment kenmerken van verschillende preparaten vereist, aanvankelijk behouden ze allemaal unlabeled bij 30 ° C. Zij levensvatbaar gedurende enkele uren. label vervolgens achtereenvolgens met tussenpozen, door het labelen van de tweede opstelling (stappen 2.7 - 2.8.3), terwijl het afbeelden van de eerste.
3. Imaging gelabelde Lanceolate Endings.
LET OP: De waarnemermoet donker aangepast voor de volgende beeldvormende stappen. De verhoogde gezichtsscherpte dit levert betekent lagere excitatielicht niveaus moeten de follikels voor beeldvorming vinden. Dit is heel belangrijk voor het minimaliseren fototoxiciteit plaats van het verminderen van het ongemak van fotobleken. Vrije radicalen gegenereerd door volle intensiteit verlichting kan snel (binnen 60 sec) te doden wonen zenuwuiteinden (GS Bewick, S. Fadul en WJ Betz, ongepubliceerde waarnemingen).
- Voor de beeldvorming, controleer dan de voorbereiding onder een dissectie stereomicroscoop en verwijder voorzichtig elk oppervlak puin. Dit voorkomt auto-fluorescentie besmetting van de beelden.
- Plaats de schotel op het podium van een rechtopstaande epifluorescentie microscoop met een standaard fluoresceïne filter set (480-488 nm excitatie, 500-520 nm emissie voor styryl pyridinium kleurstof).
- Verzwakken de excitatie lichtintensiteit met neutrale dichtheid filters tot net genoeg om comfortabel te lokaliseren van de terminals.
- Lokaliseren gelabeld follikels door het observeren met een lage (3.5x - 4x droog objectief), dan steeds hogere (10x en 20x water immersie objectief) vergroting doelstellingen.
- Maak foto's van gelabeld lanceolate terminals tot 10x droog doelstelling voor laag vermogen en 20x water immersie doelstellingen voor een hogere vergroting. Minimaliseren van de lichtintensiteit en belichtingstijd (een camera integratie tijd van 0,5-1 sec wordt gesuggereerd).
- Maak foto's op een standaard digitale camera's en beelden op de computer van de harde schijf op te slaan met behulp van propriëtaire software. OPMERKING: Een typisch voorbeeld wordt getoond in figuur 1.
- Afbeelding ~ 20 lanceolate eindes van elk preparaat. Vanaf de rand het verst van de snijrand aan de basis van de oorschelp huid en werken langs deze rand beeldvorming elke follikel beurt. Werk aan de overkant in een iets overlappende gebieden evenwijdig aan de snijkant, zorg ervoor dat het imago van de dezelfde follikel twee keer en iemand die duidelijk beschadigd. LET OP: Dere zijn meestal te veel lanceolate terminals op de foto om ze allemaal voordat belangrijke spontane de-kleuring optreedt. Zo raden we systematisch bemonsteren van de bevolking met behulp van het volgende protocol.
- Na de marginale strook, beweegt één veld breedte naar de basis van de oorschelp en gaat in de omgekeerde richting.
- Afbeelding alle terminals ondervonden, behalve af en toe die duidelijk gericht heel veel meer schuin naar de optische vliegtuig en waarschijnlijk niet volledig passen binnen de standaard ringvormige analyse ROI (zie paragraaf 4). Sluiten niet uit ongewoon helderder of dimmer lanceolates in vergelijking met de omliggende terminals, tenzij ze zijn duidelijk beschadigd is of de achtergrond intensiteit is bijzonder hoog, wat aangeeft plaatselijke weefselschade.
- Gooi de bereiding als meer dan 10% van het huidgebied / aansluitingen beschadigd / onbruikbaar. OPMERKING: lanceolates Destain tijd, volledige beeldvorming elk preparaat binnen 20 min na het einde van de was.
- ikf het gebruik van meer dan één preparaat, zorgen voor intensiteit vergelijkingen zijn geldig op de tijd die overeenkomen met de voorbereidingen. Om dit te doen, offset timings van kleuring elk preparaat door ~ 30 min, om de vergelijkbaarheid van de-vlek keer te verzekeren.
- Om de-vlek (exocytose), image dezelfde terminal te bewaken op 5 of 10 minuten intervallen. Met de praktijk is het mogelijk om het tot 3 afzonderlijke terminals op elk tijdstip één preparaat.
4. Analyseren gelabelde Lanceolate Endings.
Opmerking: De volgende procedure is een snelle werkwijze voor het analyseren terminal intensiteit.
- Maak een ringvormig gebied van belang (ROI) gecentreerd op het uiteinde van de haarschacht aan de basis van de follikel (figuur 2). Stel de binnenomtrek van de ringvormige ROI groot genoeg om de haarschacht auto-fluorescentie in elke follikel voorkomen worden geanalyseerd maar omvatten alle terminal fluorescentie. Zorg ervoor dat de buitenste omtrek is groot genoeg om de grootste termin omsluitenal waarschijnlijk zal worden geconfronteerd, dat gericht is dicht bij de belangrijkste optische / follikel as.
- Wordt achtergrond ROI ongeveer even vlak voor het doel annulus (vierkant of cirkel, typisch ~ 400 um 2) aan de lokale kleurintensiteit in de nabijheid van de terminal die geanalyseerd bepalen.
Opmerking: De afmetingen van deze twee ROI worden aan het begin van de analyse en alle daaropvolgende follikels / lancetvormige terminals in alle preparaten analyseren per experiment. Het is dus belangrijk om hun parameters zorgvuldig aan het begin. - Plaats de achtergrond ROI dicht genoeg bij de follikel aan de lokale achtergrond in de talgklieren dat de terminals, niet de lagere intensiteit huid tussen de follikels ten grondslag liggen te vertegenwoordigen, maar wees voorzichtig om geen terminale gebieden omvatten.
- Noteer de gemiddelde intensiteit van de twee ROI gebruiken "actie" of "analyse ROI 'functie van de software en gegevensoverdracht naar een spreadsheet.
- In de spreadsheet, voor elk follikel aftrekken van de gemiddelde achtergrond plaatselijke intensiteit van die in de annulus om een netto-intensiteit geven. Deze aanpassing voor gelokaliseerde achtergrond vermindert tussen follikel variabiliteit.
Representative Results
De haarzakjes in deze oorschelp voorbereiding zijn gemakkelijk gezien onder transilluminatie zonder fluorescentie (Figuur 1A), ter illustratie van de flinterdunne aard van het preparaat en het relatieve gemak van de toegankelijkheid die het biedt om deze mechanosensorische terminals. Elk wordt gekenmerkt door de prominente haarschacht basis piercing de donkere halve maan van de talgklier. Onder epifluorescentie, worden de gelabelde lanceolate terminals omliggende elke haarfollikel duidelijk te zien en tonen de typisch robuuste spontane styrylkleurstof opname (Figuur 1B). Dit gebeurt zonder opgelegde beweging. De lancetvormige terminals gezien de haarschacht omringen, hoewel de omvang van encirclement varieert 6. Veel van de etikettering puntvormige (spots) in plaats van de lineaire ordening die te verwachten zijn. De gestippelde patroon weerspiegelt terminals wordt waargenomen in een optische vlak langs de lengte van de terminal. This preparaat ontving geen verdere verwerking voor visualisering na labeling, werd slechts overgebracht naar een microscoop podium en afgebeeld in situ, die weer illustreert de eenvoud van dit preparaat.
Voorbeeldexperimenten waarop dit nieuwe preparaat geschikt zijn weergegeven in figuur 3. Het kan worden gebruikt om zowel endocytose en exocytose in levende terminals, evenals hun modulatie bestuderen. Zo endocytose, glutamaat receptor agonisten kan de etikettering intensiteit te verhogen, terwijl het blokkeren van Ca 2+ kanalen met liganden of kationen zoals Mg 2+, Ni 2+ of Cd 2 + 2 verlaagt. Alternatief kan dit preparaat ook worden gebruikt om de kinetiek van exocytose bestuderen, zie figuur 3C. Eerst wordt een gelabeld terminal spontaan gezien de-kleuring. Maar deze ontkleuring versneld door de exocytose stimulerende, alfa-latrotoxine. meer destaarten van de experimentele resultaten blijkt Banks RW et al. 2.
Figuur 1. Robuuste styrylkleurstof Labeling Opgenomen in de Mouse Pinna. (A) Een deel van een ongemerkt oorschelp voorbereiding helderveld verlichting, waaruit blijkt hoe duidelijk haarzakjes verschijnen in gebieden vrijgemaakt van bovenliggende areolar / vetweefsel. De donkere, meestal bilobed, halve maan vormen zijn talgklieren rond de centrale haarschacht. (B) een vergelijkbaar gebied, op een iets hogere vergroting en afgebeeld met epifluorescentie, met lancetvormige uiteinden gelabeld met styrylkleurstof. Schaal bars -. 40 urn Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
"1"> 
Figuur 2. Analyse van styrylkleurstof Labeling Intensity. (A) Typische cirkelpatroon van haarfollikel labeling met styrylkleurstof, gecentreerd op de haarschacht (niet zichtbaar in dit beeld). (B) De belangrijkste analyse 'region of interest' (ROI) wordt gedefinieerd door een standaard ring gelegd op de positie van de palissade van lanceolate zenuwuiteinden rondom de follikel. Deze ROI is constant in vorm en ruimte gehouden voor eventuele enkel experiment om ervoor te zorgen etikettering intensiteit kan eerlijk worden vergeleken tussen de voorbereidingen en over alle behandelingen. Netto intensiteit van elke ROI wordt berekend door de intensiteit van een aangrenzend vierkante of ronde achtergrondgebied (~ 400 um 2). Ook deze vierkante achtergrond regio constant in vorm en omgeving gedurende een bepaald experiment gehouden.target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Labeling Intensiteit van de haarfollikel Afferente Lanceloate Endings is niet normaal verdeeld, en kan worden gebruikt om zowel endo- en Exocytosis Onderzoek. Typische gegevens van styrylkleurstof intensiteit metingen in spontaan gelabeld lanceolate terminals met behulp van de analysemethode zoals hierboven beschreven. (A) intensiteit Labeling onder controle omstandigheden (54 follikels, 4 oren) en 1 mM glutamaat (42 follikels, 4 oren). De intensiteit waarden van de afzonderlijke uitgangen worden weergegeven als cluster puntdiagrammen. Elk punt staat de intensiteit van één terminal palissade rond een follikel. Merk op dat zelfs onder controle omstandigheden een paar datapunten (follikels) zijn zeer intens, terwijl de meeste zijn geclusterd bij lagere intensiteiten. Het eerste punt op een bepaald intensity is uitgezet in het midden en vervolgens gegevenspunten van dezelfde intensiteit zijn progressief lateraal weergegeven langs beide zijden. Aldus uitbreiding vertoont vertegenwoordigt de frequentie van follikels van elke specifieke labeling intensiteit. De horizontale lijnen geven mediaan ± 25% interkwartielbereik. Incubatie met 1 mM glutamaat verbetert de mediane intensiteit van ~ 50% (*** p <0,001, Mann-Whitney), maar labeling kan worden verbeterd door 200-300% in sommige terminals. (B) Afbeeldingen tonen glutamaat-gemedieerde verhoogde kleurstof opname (endocytose). Incubatie van de haarfollikel preparaat glutamaat (1 mM) aanzienlijk verhoogt styryl kleurstofopname, zoals blijkt uit de verhoogde intensiteit labeling. Schaal bar 20 urn. (C) Enhancing vrijmaking van kleurstof (exocytose). Na labeling wordt styrylkleurstof spontaan weer vrijgegeven, de etikettering op 0 min duidelijk helderder dan 60 minuten, zelfs nadat achtergrond aftrek te controleren voor fotobleken. Deze release is sterk potentiated door alfa-latrotoxine, een zwarte weduwe spin gif bestanddeel, die ongecontroleerde blaasje exocytose triggers. Na 60 min in toxine, terminal labeling is bijna niet op te sporen. Deze omkeerbaarheid van styrylkleurstof etikettering ondersteunt de hypothese dat terminal fluorescentie door internalisatie tijdens plaatselijke recyclage van synaptische blaasjes-achtige. Schaal bar 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Bewick en Betz eerste het N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium dibromide-gerelateerde pyridinium styryl kleurstoffen 7-10 plaatselijke recyclage van synaptische blaasjes membraan volgen. Dye opname, en dus verhoogde fluorescentie, weerspiegelt daarom synaptische blaasje membraan verinnerlijking (endocytose). Vervolgens wordt dit geïnternaliseerde kleurstof kan worden opnieuw uitgebracht door verdere elektrische activiteit, waaruit blijkt kleurstof verlies bewaakt blaasje membraan externalisering (exocytose). In synapsen, dit is een indicatie voor neurotransmitterafscheiding. Tegelijkertijd hebben wij ook deze kleurstoffen label primaire mechanosensorische zenuwuiteinden 7. Meer recent 11, Bewick, Banks en collega's toen bleek dat dit weerspiegelt een soortgelijk proces in de volwassen, gedifferentieerde mechanosensorische terminals ex vivo. Ook hier, de kleurstoffen label 50 nm diameter 'synaptische-achtige' blaasjes (SLV's), die constitutief recyclen tot glutamaat vrij te geven.In mechanosensorische terminals, in tegenstelling tot hun tegenhangers synaptische Deze recycling voornamelijk spontaan. Ook wordt gemoduleerd door mechanische in plaats van simpelweg elektrische stimulatie.
Voor sensorische neuronen in de cultuur en in het slakkenhuis haarcellen, styrylkleurstoffen in het algemeen en styryl pyridinium kleurstof in het bijzonder is aangetoond dat door het mechanosensorische kanalen te passeren, het blokkeren van de mechanosensorische kanalen en onomkeerbaar labelen van interne membranen 12. Echter, op vergelijkbare styrylkleurstof concentraties gedifferentieerde mechanosensorische terminals in situ zoals hier lancetvormige uitgangen 2, of Ia einde in spierspoeltjes 11, en haarcellen die niet mechanisch gestimuleerd 13, 14, etikettering door membraan endocytose. In mechanosensorische zenuwuiteinden, bijvoorbeeld labeling is reversibel en niet de mechanosensorische reacties bij de concentraties hier gebruikte 2, 11, 1 blokkeren5. Terwijl sommige kleurstof internalisatie per kanaal doordringen in deze endings niet volledig kan worden uitgesloten, de bijna totale destain met alfa-latrotoxine geeft aan dat de grote meerderheid van de etikettering in volgroeide terminals is door internalisering met recycling blaasje membraan. We hebben daarom gebruik gemaakt van deze techniek om de activiteit afhankelijkheid 11 bestuderen en, het meest recent, de farmacologie 2 van SLV recycling in mechanosensorische afferente terminals door het onderzoeken van effecten van geneesmiddelen op de opname en afgifte van de kleurstoffen.
Zoals bij de meeste praktische technieken, reproduceerbaarheid vereist herhaling en oefening. Enkele van de belangrijkste punten die betrouwbaarheid zal nu worden besproken. Lanceolate etikettering bij jongere dieren is meer betrouwbaar - de kleinste dieren die we hebben gebruikt was 15 g lichaamsgewicht. Het is niet geheel duidelijk waarom dit het geval is, maar kan het zijn dat ontleding van de jongere bindweefsel minder mechanische trauma en le vereistaves minder resterende residu bij het verwijderen van het weefsel bovenop de innervatie laag.
Over het algemeen, het weefsel voorbereiding is heel eenvoudig, met het schillen van de huidlagen apart zijn de meest technisch uitdagende praktische aspect en dan alleen bij oudere muizen. Hierin huidlaag sterk hechten samen bij de basis waar de ontleding begint, maar zelfs hier scheiding van de lagen wordt veel gemakkelijker naar de randen. Gelukkig, of misschien wel daardoor, deze dunnere marginale delen van de huid geven meestal de meest bevredigende etikettering, net als de anterior huid in het algemeen. Daarom is het bijzonder te voorkomen grijpen de zeer dunne huid op de marges. Om het risico van schade te minimaliseren, te manipuleren voorbereidingen indirect door te duwen met gesloten tang in plaats van vast te pakken direct, of als essentieel greep alleen hardere weefsels waarschijnlijk niet te worden geëtiketteerd. Je grondig verwijderen van de "plaat polystyreen 'laag direct bovenop de follikels, aangezien dit de belangrijkste mechanische belemmering voor imaging en toegang drug. Echter, is het essentieel om fysiek contact met onderliggende structuren dit schade (bijv ontdoet) het neurale netwerken en terminals net onder minimaliseren. Als het zwaartepunt fluorescentie geel / wit in de talgklieren, zichtbare auto-fluorescentie van de haarschacht bases en enkele crescents oranje / geel lancetvormige eindes, geeft dit de zenuwplexus laag en bijbehorende lancetvormige terminals zijn verwijderd tijdens klaring. Dit schijnt het grootste probleem met oudere (> 30 g) muizen. Gehele kleuringen, zorgen alles is bij 30 ° C en goed zuurstof. Wees ervan bewust dat het label terminals nog in leven zijn. Bijgevolg zal kleurstof worden afgescheiden door voortdurende spontane (constitutieve) exocytose-release. Dit zal langzamer bij R / T, maar het is een goede gewoonte om de vertraging tussen het verwijderen van chelator oplossing en imaging een minimum te beperken, om kleurstof verlies te minimaliseren. Bovendien, voor tussen-groep vergelijking studies intensiteit, is het essentieel om beeldvorming van alle groepen waarborgen is tijd afgestemd. Het gebruik van een kleurstof-cheleringsmiddel voor de beeldvorming sterk verbetert het contrast. Dus, terwijl relatief duur, de chelatietherapie stap is heel belangrijk om te zorgen voor een goede beeldkwaliteit. Chelator gebruikt kan worden geminimaliseerd door hergebruik oplossing meerdere keren, en zelfs op 2-3 opeenvolgende dagen, indien bewaard bij 4 ° C tussen toepassingen. Gooi de chelator oplossing zodra het merkbaar roze gaat, toont zijn kleurstof opslag nadert verzadiging.
Tijdens de beeldvorming, zich bewust zijn van de mogelijke fototoxische schade aan deze levende terminals, die een cumulatieve gevolg van zowel de intensiteit en de belichtingstijd van het excitatielicht. Deze overweging is minder belangrijk voor alleenstaande tijdstip beelden, waarbij de beeldkwaliteit is de primaire zorg. Het is echter van cruciaal belang tijdens herhaalde beeldvorming in kinetiek studies om excitatielicht de blootstelling tot een minimum beperkt. Hoewel de ontwikkeling van deze kleurstoffenlabel synapsen, vonden we excitatie gedurende> 1 min op volle kracht excitatie verlichting zal dramatisch en onherstelbare schade aan zenuwuiteinden veroorzaken. Het eerste waarna ze breiden, dan samenvouwen volledig gedurende ~ 15 minuten. We hebben niet systematisch testen van de relatieve bijdrage van de blootstelling tijd en intensiteit, maar deze waarnemingen suggereren dat de leidraad moet zijn om beide te minimaliseren. Dus, is het raadzaam dat excitatielicht intensiteit en duur zijn de minimale verhouding staan tot het krijgen van goede foto's, en passende controlemaatregelen beelden worden opgenomen in tijdsverloop studies. Om te testen dat de gegevens niet door de fototoxiciteitstest worden beïnvloed onder herhaalde beeldvorming omstandigheden, op elk tijdstip neemt een extra afbeelding van een eerder ongelezen terminal. Dit is om te zorgen voor het gedrag van de etikettering in naïeve terminals lijkt op die in de follikels herhaaldelijk in beeld wordt gebracht.
Een aantal factoren kan de binnen-groep variabiliteit van de netto-intensiteit te verminderen data. Nauwkeurige plaatsing van het ROI, in het bijzonder de achtergrond ROI is belangrijk, aangezien zelfs kleine gebieden van ongepaste kleuring sterk kan voorkomen bij follikel data variabiliteit. De variabiliteit van de netto-intensiteit wordt ook beïnvloed door hoe geheel elke haarfollikel wordt omringd door de palissade van eindes. Vergelijk bijvoorbeeld de halvemaanvormige etikettering distributie in figuur 1B met vrijwel cirkelvormig patroon gezien in figuur 2. Complexere analyse, wellicht met behulp van geautomatiseerde software detectie en drempelwaarden, zijn noodzakelijk om de mate van isolement is een relevante parameter. Let op de intensiteitsverdelingen voor zelfs de meest nauwkeurig geanalyseerde follikel groepen niet normaal verdeeld (zie figuur 3), in het gebruik van niet-parametrische statistieken voor tussen-behandeling vergelijkingen bevolking medianen dan op middelen. Normalisatie technieken, zoals expressie intensiteiten procenten of contralaterale controle of een controlegroep bestaande uit verschillende preparaten, kan worden toegepast variabiliteit verder te verminderen. De definitieve technische punt te worden beschouwd is het experimenteel ontwerp voor farmacologische testen. Tijdens farmacologische onderzoeken pre-incubeer de bereiding van geneesmiddeloplossing voor 30 minuten voordat kleurstof toepassing. Daarna houden de geneesmiddelconcentratie in de kleurstofoplossing. In controles worden zoutoplossing of, indien het geneesmiddel wordt opgelost in een vehikel, zoutoplossing plus voertuig.
Het onderhavige artikel laat zien hoe deze nieuwe oorschelp voorbereiding biedt een hoge beelden van mechanosensorische eindes kwaliteit in de huid met een minimale voorbereiding. We tonen ook kan worden gebruikt om de farmacologie van twee kritische aspecten van blaasje recycling onderzoeken. We tonen eerst dat een glutamaat receptor agonist kleurstof internalisatie (een marker van endocytose) kan verhogen, en ten tweede is dat de kleurstof weer verloren met alfa-latrotoxine (een stimulerend middel van exocytose). De betekenis van deze preparation en techniek is dat het biedt een uitstekende toegang tot levende huid mechanosenory terminals in situ voor imaging experimenten, bieden unieke kansen voor optische controle van de terminal functie, structuur en hun onderlinge relaties. Om dit laatste doel, hebben we ook verder ontwikkeld voor gebruik in de gecombineerde optische / elektrofysiologische studies (zie zus Jove artikel voor meer informatie).
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het werk werd gefinancierd door de Britse Medical Research Council projectsubsidie G0601253 aan GSB en RWB en een SULSA Bioskape subsidie aan GSB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS - Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera - basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Andres, K. H. On the microstructure of receptors on sinus hair. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).
- Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat. PLoS One. 9, e107073 (2014).
- Liley, A. W. An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat. J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).
- Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation. Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Drew, L., Wood, J. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).
