Abstract
Bir yeni bir diseksiyon ve kayıt tekniği optik izleme boyama ve fare kulak kepçesi derisinde saç köklerinin çevresinde mızrak şeklinde terminalleri de boyaması için tarif edilmektedir. Hazırlık güvenilir yoğun vezikül geri dönüşüm çalışmalarında kullanılan stiril piridinyum boyaların alımını ve serbest çalışmaya sinir terminallerinin yaşayan çok sayıda etiketli birimlerinin geniş bölgeleri verimli, basit ve nispeten hızlı. etiketleme öncesi hazırlıkları subdividing tek bir kişi aynı kulakta kontrol karşılaştırmalar vs testi sağlar. Yararlı ipuçları hazırlanması, etiketleme ve görüntüleme parametrelerinin kalitesini artırmak için verilmiştir. Bu yeni sistem farmakolojik tahlil ve alımı ve her ikisi de vahşi tip mızrak şeklinde terminallerinde vital boyaların ve genetik olarak tadil edilmiş hayvanların serbest mekanik olarak indüklenmiş için uygundur. etiketleme yoğunluğuna düzenleyici etkilerin örnekler verilmiştir.
Introduction
Genellikle deri veya diğer çevre dokularda derinliklerine gömülü olarak mechanosensory sinir uçları, yerinde erişmek için, genellikle küçük diffüz dağıtılan ve zordur. Görselleştirerek, bu nedenle genellikle, yeşil veya sarı floresan proteini (GFP / YFP) 1 ile floresan etiketler genetik ekspresyonu fare hatları elde etmek için bir uzun immunolabeling / boyama süresi veya gecikme ve gider ardından Kesit gerektirir. Burada uygun bir doku ve çalışma için kıl folikülü afferentleri çok sayıda erişmek için hızlı ve basit bir yöntem göstermek ve hızlı bir şekilde terminali fonksiyon 2 optik izlenmesi için etiketli nasıl. Uygulama ile, görüntüleme diseksiyonu bütün teknik olarak en az 2 saat içinde tamamlanabilir.
duyusal akson hançer terminalleri her biri, memelilerde saç köklerinin saç folikülünün epiteli etrafında palisades oluştururlar innerveglial / Schwann hücresi arasında sıkışmış terminali 2-4 işler. Terminallerin amacı, çevreleyen kılların mekanik deplasman tespit etmektir. Bunlar hızlı ve yavaş uyum uçları bir karışımıdır, ancak ağırlıklı olarak saç hareketine yanıt olarak faaliyet öbekler üretir. Tipik haliyle, ateş hatta sürekli yer değiştirme varlığında, çok hızlı bir şekilde hareket sona erer durur.
Optik yöntemlerle mızrak şeklinde terminalleri çalışmak için bu fare kulak kepçesi modeli bu uçlarının yapısını ve fonksiyonunu çalışmak için birçok avantajlı özelliğe sahiptir. kulak kepçesi cilt baskın olarak iki tabakası arasında, kıkırdak dokusunun sadece küçük bir miktarı ile, arka arkaya yapıştırılır. Cilt nedeniyle vücudun diğer bölgelerine zayıf yapıştırıcı bağ dokusu nazaran az miktarda çok ince ve kolay disseke. Kolayca ayrılan deri katmanları, bu nedenle, köklerinin ve terminallere iyi erişim sağlar. innervasyonkolay erişilebilir ve tanımlanabilir. saç folikülleri daha seyrek köklerinin tek tek veya küçük gruplar görüntüleme kolaylaştırılması, diğer cilt bölgelerinde daha dağıtılır. İnce yatan dermal tabaka o kadar başka bir işleme tabi floresan mikroskobu ile görüntüleme için idealdir, boyalar ve farmakolojik ilaçlara iyi erişilebilirlik verir. fiksasyon ve daha fazla histolojik işlem sonrasında, bir sabitlenebilir boya analog kullanıyorsanız etiketli terminalleri görüntüleme, canlı terminalleri olabilir ya da ya.
Bu emme (endositoz) ve stiril piridinyum boya (FM1-43 serbest bırakılması (ekzositozu) ile kanıtlandığı geri kazanım mızrak şeklinde uçları meydana gelir, zarı, göstermek için bu hazırlık kullandık; A ^ - (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) stiril) piridinyum dibromür). Boya değil, ancak önemli ölçüde yatırım Schwann hücresi 2 süreçleri etiket yok gibi görünüyor. Ayrıca bu boya alımı / serbest olduğunu göstermiştir ve dolayısıyla r zareCycling, bir atipik (fosfolipaz D-bağlı) metabotropik glutamat reseptörü aracılığıyla glutamaterjik modülasyon bağlıdır. Basit uyarıcı ve analiz protokollerinin sonuçları gösterilmektedir ve ortak potansiyel analiz sorunlar da vurgulanır.
Protocol
Bu yöntemler, 2 Fare insanca servikal dislokasyon ile ötenazi uygulandı RW ve diğ. Banks rapor araştırma, kullanılmıştır. İngiltere'de, bu bir Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) listelenen yasal onaylı Program 1 yöntemi Yasası, 1986 ve Avrupa Direktifi 2010/63 / EU. Bu, federal yasalar tüm prosedürleri onayladı Hayvan Refahı tarafından Aberdeen Üniversitesi ve Etik Değerlendirme Kurulu lokal olarak uygulanır.
Etiketleme 1. hazırlanması Kulaklar
- Böyle Liley (1956) 5 olarak, standart bir serum fizyolojik hazırlayın ve% 90 O 2 /% 5 CO 2 (carbogen) ile doyurabilecek. (12) NaHCO 3, KCI (4), KH 2 PO 4 (1), NaCI (138.8), MgCI2 (1), CaCl2 (2) ve glukoz (11): Liley en tuz (mm). NOT: Bu yazının geri kalanı boyunca, 'tuzlu' tam karbojen ile doymuş tuzlu sevk edecektir. dissectio sırasında20 dk - n, hazırlık her 15 kapsayan tuzlu su yenileyin.
- Insanca kafatası zarar vermeden bir yetişkin fare euthanize. NOT: C57 / Bl6J ve MF1 fareleri kullanmış ancak herhangi bir fare suşu kullanılabilir. en önemli yönü, büyük yetişkin (> 25 g) kullanmak değildir. Büyük farelerde Etiketleme, daha az güvenilir sık sık köklerinin küçük ve dağınık gruplar sınırlı ediliyor.
- (50 mm genellikle uygundur) sadece yoğun saç çizgisinin üzerinde, ~ 25 cm makas ile tabanına yakın dış kulakları (pinnae) çıkartın ve bir silikon kauçuk kaplı kültür / petri tuzlu su içinde daldırın.
- aşağı pinna anterior (içbükey) tarafını yerleştirin ve ince böcek iğneli düzenli aralıklarla silikon marjlarını pin (~ 6 - kulağın başına 8, ~ 0.2 mm çaplı pim). 20 dakika, ya da sürekli perfüze banyo kullanmak - saline her 15 yenileyin.
- Dikkatle başlangıçta kepçesi kesim tabanından her yerinden erişen, künt diseksiyon ile ön deriden arka cildi soyarakKalın merkezi kıkırdak ve sistematik ince, kıkırdak serbest dış marjları yönelik çalışma.
- Bunu yapmak için, hiçbir bir çift arka deri kesim kenarının merkezini tutun. 3 forseps. çeneleri kapalı Sonra, hiçbir başka bir dizi noktaları yerleştirin. Deri ve altta yatan kıkırdak arasındaki boşlukta 3 forseps.
- Yavaşça arka cildi geri soyma katmanları ayırmak için ise dikkatle yapışıklıklar gevşetin, gerekli minimum güç kullanarak, yan-yan boşluğu içinde kapalı forseps noktaları çalışır.
- Posterior cilt kaldırıldı ile, bir pozisyonda ön cildi. (Yukarıda, 1.5) başı olarak ön derinin yanında, yukarı arka cilt, cilt tarafı sabitleyin.
- Sonra, dikkatle ve tamamen 1.6 ile aynı künt diseksiyon tekniği ile ön deri cilt katmanları arasında sıkışmış olan kulak kepçesi kıkırdağı kaldırın. forseps ile delinme delik yapmaktan kaçının.
- Daha sonra, fya da her ikisi kulak kepçesi cilt preparatları nazikçe kabuğu, koparmak ve saç folikülü üsleri kapsar polistiren köpük, benzeyen, bağ dokusunun ince bir tabaka uzak ovalayın. NOT: En iyi takas Alınması biraz pratik alabilir; çok güçlü bir şekilde kazıma köklerinin dibinde olan yapay sinir ağları kaldırır ise yetersiz doku alınması, boya çözümü için ve görüntüleme için hem de erişim engeller.
- tuzlu su yenileyin.
2. mızrak şeklinde Terminali Etiketleme
NOT: Aşağıdaki protokol stiril piridinyum boya için optimize edilmiştir. Diğer kimyasal olarak benzer, stiril piridinyum boyalar, belki de konsantrasyon ve kuluçkalama süresi bazı ayarlamadan sonra, çalışmalıdır. boya çözümleri tutarken eldiven ve bir laboratuvar ceket giyin. Ya doğrudan üreticiden 10 mM stok boya çözeltisi satın almak ya da glikoz olmadan tuzlu su içinde boya tozunun çözülmesiyle stok hazırlamak. Kısım (10 ul genellikle uygundur, ama büyük SCA için bu ayarlamaLe deneyler) ve mağaza -80 ° C, -20 ° C'de 6 aya kadar ya da yaklaşık 1 yıl boyunca dondurulmuştur. Toz, en az 2 yıl süreyle saklar. Tekrarlanan dondurma / boya çözümleri çözülme döngüleri önlemek; Bu hızla boya denatüre. Bir kez 4 ° C'de mağaza, çözüldü ve 1 hafta içinde kullanın.
- su yüzeyinin altında - 5 mm bir platform ~ 3, 30 ° C bir su banyosu önceden ısıtın.
- Taze 10 uM stiril piridinyum boya çözeltisi (10 mi tuzlu su taze çözüldü, 10 mM stiril piridinyum boya 10 ul) hazırlanması ve su banyosu içinde dengeye.
- (Tipik hacmi ~ 2 ml) serum fizyolojik 2 mm - Pin silikon kauçuk her hazırlık 1 batık 35 mm kültür yemekleri kaplı. hayvan kullanımını en aza indirmek için, - (15 cm uzunluğunda 10) küçük bir makas ile temel için tepe noktasından yarıya ise her kulak kepçesi cilt hazırlığı iki hazırlıklarını verecektir.
- 30 ° C su banyosu içine daldırılmış bir platform üzerinde tuz kaplı kepçesi preparatları içeren 35 mm'lik kaplara yerleştirin. sağlamaksu derinliği yeterli ısınma için yeterli ama açık çanak tuzlu bulaşmaz.
- Pim ince (0,5-1 mm dış çapı) sürekli hazırlıkları gaza her yemeğin silikon üssü haline O 2 / CO 2 akan boru. Ayrıca su banyosu içine çamaşır / bulaşık tazelemesi için boya içermeyen tuzlu 100 ml yerleştirin. carbogen doygunluğu korumak ve su kirlenmesini önlemek için sıkıca tıpalı-şişesi kullanın.
- daha sonra şişe tıpalı 100 ml kepçesi hazırlıkları üzerinde tuz yerine, 30 dakika boyunca 30 ° C 'de her dengelenmesi. 30 dakika daha inkübe edilir. NOT: Bu yedek tuzlu buharlaşma ve gaz hattı köpüren kaynaklanan herhangi bir toplu hacim kayıpları telafi eder.
- Daha sonra, hızlı ve dikkatli bir şekilde bir boya çözeltisi ile seyreltme etkisi aşağıdaki eklenecek en aza indirmek için kağıt mendil ile hazırlanması üzerine, kalan herhangi bir sıvı kaldı leke, 100 ml'lik bir atık behere boya salin boşalt. (Dokunmamaya özen gösterin
- daha sonra 30 ° C'de 40 dakika süre ile 10 uM stiril piridinyum boya 3 ml prosedürün geri kalan kısmında R / t geri - 2 kulak kepçesi preparatları inkübe edin.
- R / T çözümlerini kullanarak, üç aşamada olmayan içselleştirilmiş boya çıkarın. Not: Bu adımlarda en iyi görüntüleme için göz koyu adaptasyonu başlamak için en az ortam ışığı (karartma perde, kırmızı / turuncu düşük yoğunluklu aydınlatma) yapılmaktadır.
- Bir atık behere yemeklerinden etiketleme çözümü uzak dökün ve hızlı bir şekilde peş peşe boya içermeyen tuzlu üç değişiklikleri durulayın. Bu preparatlar ve açıkta kalan zarlardan departitions bir boya bakiye stiril piridinyum boyası çözeltisi yapışmasını kaldırır.
- Yüzey membranları, yani en kalan boya departition bir 30 dakika daha boya salin nihai değişim inkübe terminaller tarafından içselleştirilir olmayan boya.
- Kalıcı boya sıkışmış t kaldırsülfonatlı B-siklodekstrin türevi ile kenetleme maruz membran dış sayfada o (Advasep-7, 1 mM, 5 dakika - Tablo 1 e bakınız). Böylece, geri kalan tüm boya dokular içinde olacaktır.
- görüntüleme için, taze boya salin yerleştirin ve iyice kağıt mendil ile çanak dışında kurutun.
NOT: terminaller artık görüntüleme için hazır. Mızrak şeklinde sonlar yavaşça tekrar endocytosed stiril piridinyum boya bırakmadan, bu nedenle, canlı ve farkında olmak önemlidir. Bu R / T, daha yavaş olacak olsa da, görüntüleme sırasında / 'önce gecikmeleri en aza indirmek için önemlidir. Deney birden düzenlemelerine göre hazırlanmıştır gerektiriyorsa, ilk bunları 30 ° C 'de etiketlenmemiş korumak. Onlar birkaç saat boyunca canlı olacaktır. İlk görüntüleme sırasında - Sonra aralıklarla sırayla etiket, ikinci hazırlık etiketleme ile (2.8.3 2.7 adımlar).
Lanceolate Endings Etiketli 3. Görüntüleme.
NOT: Gözlemciolmalıdır Aşağıdaki görüntüleme aşamaları için koyu adapte. Bu tanıyor artan görme keskinliği düşük uyarım ışık seviyesi görüntüleme için folikülleri bulmak için gerektiği anlamına gelir. Bu fototoksisite en aza indirilmesi yerine photobleaching rahatsızlık azaltmak için çok önemlidir. Tam yoğunluk aydınlatma tarafından oluşturulan serbest radikaller hızla (60 saniye içinde) sinir terminalleri (GS Bewick, S. Fadul ve WJ Betz, yayınlanmamış gözlemler) yaşayan öldürebilir.
- görüntüleme önce, bir diseksiyon stereomicroscope altında hazırlanmasını kontrol etmek ve dikkatli bir yüzey pislikleri temizleyin. Bu görüntülerin kirlenmesine neden olan oto-floresan engeller.
- Standart bir floresein filtre seti ile dik bir Epifloresans mikroskop sahnede çanak monte edin (480 - 488 nm uyarma, 500 - stiril piridinyum boya için 520 nm emisyon).
- rahatça terminali bulmak için sadece yeterli kadar nötral yoğunluk filtreleri ile uyarma ışık yoğunluğunu azaltmaks.
- düşük gözlemleyerek etiketli folikülleri bulun - sonra, giderek daha yüksek (10x ve 20x suya daldırma objektif) büyütme hedefleri (3.5x kuru hedefi 4x).
- düşük güç ve yüksek büyütme için 20x suya daldırma hedefleri için 10x kuru hedefi ile etiketlenmiş hançer terminallerinin görüntüleri yakalayabilir. ışık şiddeti ve maruz kalma süresini en aza indirmek (0.5 bir kamera entegrasyonu süresi - 1 sn önerilir).
- Standart bir dijital kamera görüntü yakalama ve özel yazılım kullanarak bilgisayarın sabit diskinde görüntüleri kaydetmek. Not: Tipik bir örnek, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
- Resim ~ her hazırlık 20 hançer sonlar. Bu marj görüntüleme sırayla her folikül boyunca kulak kepçesi deri ve işin dibinde kesim kenarından marjı sağdaki başlayın. Biraz aynı folikül iki kez görüntü vermemeye dikkat ederek, alanlar kesme kenarına paralel örtüşen arasında çalışmak ve tabii ki zarar görmüş herhangi. NOT:Yeniden genelde hepsini önemli spontan de boyama oluşmadan önce görüntüye çok hançer terminalleri bulunmaktadır. Böylece, sistematik aşağıdaki protokol kullanılarak nüfus örnekleme öneririz.
- marjinal şeridi tamamladıktan sonra, kulak kepçesi tabanına doğru bir alan genişliği taşımak ve ters yönde işlemi tekrarlayın.
- Görüntü tüm terminaller açıkça çok daha eğik optik düzleme ve standart halka şeklindeki analizi ROI içinde tamamen uyacak şekilde olası yönelik zaman zaman olanlar hariç, karşılaşılan (Bölüm 4'e bakınız). onlar besbelli hasarlı veya arka plan yoğunluğu lokalize doku hasarını gösteren, özellikle yüksek olmadıkça, çevredeki terminallere göre alışılmadık parlak veya karanlık lanceolates dışlamayın.
- cilt alanının% 10'dan fazla / terminaller / kullanılamaz bozuksa hazırlık atın. Not: lanceolates kez destain gibi, tam bir görüntüleme yıkama sonunda 20 dakika içinde her bir preparat.
- benf yoğunluk karşılaştırmaları zaman eşleşen hazırlıklar tarafından geçerli olmasını sağlamak, birden fazla hazırlık kullanarak. Bunu yapmak için, de-leke kez karşılaştırılabilir sağlamak için, 30 dakika ~ her hazırlık boyama zamanlamaları ofset.
- 5 ya da 10 dakika aralıklarla de-leke (ekzositoz), görüntü aynı terminal izlemek için. uygulama ile, herhangi bir hazırlık her bir zaman noktasında 3 ayrı terminallerine kadar görüntü mümkündür.
Lanceolate Endings Etiketli 4. Analiz.
Not: Aşağıdaki prosedür, terminal yoğunluğu analiz etmek için hızlı bir yöntemdir.
- Faiz (ROI) dairesel bir bölge yapmak folikülün tabanına (Şekil 2) saç şaftının ucuna merkezli. analiz edilecek herhangi bir folikül saç şaft otomatik floresan önlemek için yeterince büyük halka şeklindeki ROI iç çevresi Set ama yine de tüm terminal floresan kapsamaktadır. dış çevresinin en büyük termin içine kadar büyük olduğundan emin olunal olasılıkla o ana optik / folikül eksenine yakın odaklı karşılaşılması.
- Hedef anülüse alanında bir arka plan ROI yaklaşık olarak eşit olun (kare veya daire, genelde ~ 400 mikron 2) analiz edilen terminalin çevresinde yerel boyama yoğunluğunu belirlemek için.
Not: Bu iki ROI boyutları analizi başında belirlenen herhangi bir deney içinde tüm preparasyonlar arasında sonraki tüm foliküller / mızrak şeklinde terminalleri analiz etmek için kullanılır. Yani, başlangıçta özenle kendi parametrelerini ayarlamak önemlidir. - terminalleri, folikül arasında değil düşük yoğunlukta cilt altında yatan yağ bezleri yerel arka plan temsil etmek folikül yakın plan ROI yerleştirin, ancak herhangi bir terminal bölgeleri dahil değil dikkatli olun.
- 'Ölçü' ya da bir elektronik tabloya yazılım ve veri aktarımı 'analiz ROI' fonksiyonunu kullanarak iki ROI ortalama yoğunluğunu kaydedin.
- E-tabloda, her folikülü için net bir yoğunluk vermek için halkasında olandan ortalama yerel arka plan yoğunluğu çıkarın. lokalize arka plan için bu ayar ölçüde arası folikül değişkenliği azaltır.
Representative Results
Bu kulak kepçesi hazırlanmasında saç köklerinin kolayca hazırlık incecik doğasını ve bu mechanosensory terminallerine tanıyor erişilebilirlik göreli kolaylığı gösteren, floresan (Şekil 1A) olmadan transillüminasyon altında görülür. Her yağ bezinin karanlık hilalini delici belirgin saç şaft tabanı verebiliriz. Epifloresans altında, her saç folikülü çevreleyen etiketli hançer terminalleri açıkça görülmektedir ve genellikle sağlam spontan stiril boya alımını (Şekil 1B) göstermektedirler. Bu dayatılan hareketi olmadan oluşur. Kuşatma ölçüde değişken 6 olmasına rağmen hançer terminalleri, saç gövdesine kuşatmak görülmektedir. etiketleme Çok noktalı (lekeler) yerine beklenebilir doğrusal düzenlemedir. noktalı desen terminalleri terminalinin uzunluğu boyunca bir optik düzleme gözlenmektedir yansıtır. Thitarafından hazırlanan sadece bir mikroskop kademesine ve yine bu preparatın basitlik görüntülemektedir situ görüntülenmiştir, etiketleme sonra görünüm için başka bir işlem gördü.
Bu yeni hazırlama Şekil 3'te gösterilmektedir uygundur Örnek deneyleri. Endositoz ve eksositoz oturma terminalleri, hem de hafifletilmesinin iki çalışma için kullanılabilir. Böyle 2+ Mg olarak ligandlar veya katyonlarla Ca 2 + kanalları bloke ederken Böylece, endositoz için, glutamat reseptör agonistleri, etiketleme yoğunluğunu artırabilir, Ni 2+ veya Cd 2+ da 2 azaltır. Seçenek olarak ise, bu preparat, aynı zamanda Şekil 3C'de gösterildiği gibi, Ekzositoz kinetiğini incelemek için kullanılabilir. İlk olarak, etiketlenmiş bir terminali kendiliğinden de leke görülmüştür. Bununla birlikte, bu destain latrotoxin, ekzositozu uyarıcı hızlandırılır. Daha deDeney sonuçları kuyrukları, RW ve diğ. 2 banka görülebilir.
Şekil 1. Sağlam Stiril Boya Etiketleme Fare Pinna kaydedildi. Saç folikülleri areolar / yağ dokuları örten temizlenir alanlarda nasıl göründüğünü açıkça gösteren parlak bir alan aydınlatma bir etiketsiz pinna hazırlık (A) kısmı. karanlık, genellikle bilobe, hilal şekilleri merkezi saç gövdesine çevreleyen yağ bezleri vardır. Biraz daha yüksek bir büyütmede (B) Benzer bir alanı ve stiril boya ile işaretlenmiş mızrak şeklinde uçlarını gösteren epifluoresan ile görüntülenmiştir. Ölçek çubuklar -. 40 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
"1"> 
Stiril Boya Etiketleme Şiddeti Şekil 2. analizi. Saç şaft (bu görüntüde görünmez) merkezli (A) stiril boya ile saç folikülü etiketleme tipik dairesel desen. (B) ana analiz 'ilgi bölgesi' (YG) folikülü çevreleyen lanceolate sinir uçlarının palisade pozisyonu üzerine bindirilmiş bir standart anulus ile tanımlanır. Bu ROI etiketleme yoğunluğu oldukça hazırlıkları arasında ve tüm tedaviler arasında mukayese edilebilir sağlamak için tek bir deney için şekil ve bölgede sabit tutulur. Her ROI net yoğunluğu bitişik kare veya yuvarlak arka plan bölge (~ 400 mikron 2) yoğunluğunu çıkarılarak hesaplanır. Yine, bu köşeli arka bölgesi, herhangi bir deney boyunca şekil ve alanı sabit tutulur.target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Saç Folikül Afferent Lanceloate Endings Şekil 3. Etiketleme Yoğunluğu Normalde Dağıtılmış değildir ve endo ve ekzositoz Hem incelemek için kullanılır olabilir. Stiril boya yoğunluğu ölçümleri tipik verileri yukarıda tarif edilen analiz yöntemi kullanarak kendiliğinden etiketli hançer terminallerinde. Kontrol koşulları altında (A) Etiketleme yoğunluğu (54 folikülleri, 4 kulaklar) ve 1 mM glutamat (42 folikülleri, 4 kulak). Bireysel uçlarının yoğunluk değerleri küme nokta araziler olarak görüntülenir. Her nokta bir folikülün etrafında bir terminal palisade yoğunluğunu temsil eder. En düşük yoğunluklarda kümelenmiş ise bile kontrol koşulları altında birkaç veri noktaları (folikül), son derece yoğun olduğunu unutmayın. Belirli INTENS ilk noktaSığ merkezinde çizilir ve aynı yoğunlukta sonraki veri noktaları iki tarafında giderek daha yanal çizilir. Böylece lateral yayılma herhangi bir etiketleme yoğunluğu folikül frekansını temsil eder. yatay çizgiler ortalama ±% 25 çeyrekler aralığı temsil etmektedir. 1 mM glutamat ile Kuluçka% 50 (*** p <0.001, Mann-Whitney) ~ tarafından medyan yoğunluğunu artırır, ancak etiketleme 200 tarafından geliştirilmiş olabilir - bazı terminallerde% 300. (B) glutamat aracılı geliştirilmiş boya alımı (endositoz) gösteren görüntüler. artan markalama yoğunluğu ile gösterildiği gibi glutamat (1 mM) saç folikülü hazırlama inkübasyon belirgin, stiril, boya alımını arttırır. Ölçek çubuğu 20 mikron. (C) Artırılması boya bırakma (ekzositoz). 0 dk etiketleme 60 dk daha açıkça parlak olarak işaretlendikten sonra, stiril boya kendiliğinden photobleaching kontrol etmek için hatta arka plan çıkarma sonra, tekrar serbest bırakılır. Bu sürüm büyük po olduğunulatrotoxin tarafından tentiated, kontrolsüz vezikül ekzositoz tetikleyen bir kara dul örümceği zehri kurucu. toksin 60 dakika sonra, terminal etiketleme neredeyse mümkün değildir. stiril boya etiketleme Bu reversibilite terminali floresan sinaptik benzeri veziküllerin yerel geri dönüşüm sırasında içselleştirilmesi nedeniyle hipotezini desteklemektedir. Ölçek çubuğu 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Bewick ve Betz ilk N- piridinyum sinaptik vezikül membran yerel geri dönüşüm izlemek için stiril piridinyum boyalar 7-10 dibromür ilgili (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) stiril) geliştirdi. Boya alımı ve bu nedenle artan flüoresans nedenle sinaptik vezikül membran içselleştirme (endositoz) yansıtır. Daha sonra, bu içselleştirilmiş boya ileri elektriksel aktivite ile yeniden serbest bırakılabilir, boya kaybını gösteren kese zarı dışsallaştırılmasını (ekzositoz) izler. sinaps, bu nörotransmitter salgılanması için bir proxy. Aynı zamanda, biz de bu boyalar birincil mechanosensory sinir uçlarını 7 etiket bulundu. Daha yakın zamanlarda 11, Bewick, Bankalar ve arkadaşları daha sonra bu olgun, farklılaşmış mechanosensory terminalleri ex vivo benzer bir süreç yansıttığını gösterdi. Burada yine, boyalar glutamat serbest bırakmak için yapısal geri dönüşüm 50 nm çapında 'sinaptik benzeri' veziküller (SLV) etiket.mechanosensory terminallerde, onların sinaptik meslektaşları aksine, bu geri dönüşüm öncelikle kendiliğinden gerçekleşir. Ayrıca, mekanik, yerine sadece elektriksel stimülasyon tarafından modüle edilir.
Kültüründe ve koklea saç hücreleri, özellikle de genel stiril piridinyum boyada stiril boyalar duyusal nöronlar için mechanosensory kanal bloke edilmesi ve geri dönüşü olmayan iç membranlar 12 etiketleme mechanosensory kanalları boyunca geçmeye gösterilmiştir. Ancak, kas iğ 11 2, veya la sonlara hançer sonlara burada yerinde farklılaşmış mechanosensory terminalleri, karşılaştırılabilir stiril boya konsantrasyonlarında ve mekanik 13, 14 uyarılmış değil saç hücreleri, etiketleme membran endositoz gereğidir. Mechanosensory sinir terminalleri, örneğin, etiketleme döner ve 2, 11, 1 Burada kullanılan konsantrasyonlarda mechanosensory yanıtları bloke etmezBu sonlar kanal nüfuz bazı boya içselleştirilmesi tamamen göz ardı edilemez iken 5., Latrotoxin ile yakın toplam destain olgun terminalleri etiketleme büyük çoğunluğu geri dönüşüm vezikül membranı ile içselleştirme yoluyla olduğunu gösterir. Dolayısıyla biz, boyaların alımı ve salınımı üzerindeki ilaç etkilerini inceleyerek, en son, mechanosensory afferent terminallerde SLV geri dönüşüm farmakoloji 2 aktivitesi bağımlılığını 11 incelemek için bu tekniği kullanılır ve var.
En pratik tekniklerle olduğu gibi, tekrarlanabilirlik tekrarı ve pratik gerektirir. güvenilirliğini sağlamak için bazı temel noktaları şimdi ele alınacaktır. genç hayvanlarda mızrak şeklinde etiketleme daha güvenilir - biz kullanılan en küçük hayvan 15 g vücut ağırlığı oldu. Bu durumda neden tam olarak belli değil, ama genç bağ dokusu diseksiyon daha az mekanik travma ve le gerektirir çünkü olabilirinnervasyon tabaka üzerinde uzanan doku çıkarırken aves az bir tortu kalmıştır.
Genel olarak, doku hazırlanması sadece yaşlı farelerde daha sonra ayrı cilt katmanları soyulma olmanın teknik açıdan en zorlu pratik yönü ile oldukça basittir. Bunlarda, diseksiyon başladığı yerde deri katmanları üssünde güçlü bir arada yapışır, ama burada bile katmanları ayırma marjları karşı çok daha kolay olur. genellikle ön cildi olduğu gibi Neyse ki, ya da belki de bu nedenle, bu ince marjinal deri bölgeleri genellikle, en tatmin edici etiketleme verir. Bu nedenle, özellikle kenarlarında çok ince cilt açgözlü kaçının. Hasar riskini en aza indirmek, doğrudan kapalı forseps ile iterek yerine tutarak dolaylı hazırlıkları işlemek veya olası temel kavramak sadece sert dokuların etiketlenmesine eğer. Bu ana beni olduğu gibi hemen folikülleri örten 'levha polistiren' katmanı kaldırarak eksiksiz olmasıgörüntüleme ve ilaç erişimine chanical tıkanıklığı. Ancak, hemen altında yatan bu zararlar gibi yapılar (yani uzak şeritler) sinir ağları ve terminalleri ile fiziksel temas en aza indirmek için esastır. baskın floresan yağ bezlerinde sarı / beyaz ise, saç şaft üsleri ve sarı / turuncu hançer uçlarının birkaç hilal belirgin otomatik floresan, bu sinir pleksus tabakası ve ilgili hançer terminalleri açıklığı sırasında kaldırılmıştır gösterir. Bu eski (> 30 g) fareler ile ana sorun olarak karşımıza çıkmaktadır. boyama işlemleri boyunca, her 30 ° C 'de ve de oksijenli sağlar. etiketli terminaller hala hayatta olduğunu unutmayın. Sonuç olarak, boya devam eden spontan (kurucu) ekzositik sürümü tarafından salgılanan edilecektir. Bu R / T'de daha yavaş olacaktır, ancak boya kaybını en aza indirmek için, şelasyon çözüm ve görüntüleme kaldırılması arasındaki gecikmeyi en aza indirmek için iyi bir uygulamadır. Ayrıca için gruplar arası karşılaştırma amaçlı Syoğunluk tudies, tüm grupların görüntüleme sağlamak esastır zaman uyumlu olduğunu. görüntüleme önce bir boya kenetleme maddesinin kullanılması, büyük ölçüde görüntü kontrastını geliştirir. Yani, nispeten pahalı iken, şelasyon adım iyi görüntü kalitesini sağlamaktan oldukça önemlidir. kullanımlar arasında 4 ° C'de depolandığında, 3 gün üst üste - şelasyon kullanımı bile 2 çözüme birden çok kez yeniden kullanarak minimize edilebilir ve. onun boya haciz doygunluğunu yaklaşıyor gösteren belirgin pembe gider kez şelasyon çözüm atın.
görüntüleme sırasında, yoğunluk ve uyarma ışık pozlama süresi hem de kümülatif sonucudur bu canlı terminallere fototoksik hasar potansiyelinin farkında olmak. Bu husus görüntü kalitesi birincil endişe tek timepoint görüntüler için daha az önemlidir. Bununla birlikte, en az uyarım ışık maruz kalmasını azaltmak için kinetik çalışmalarda tekrar görüntüleme sırasında çok önemlidir. Bu boyalar geliştirirkenEtiket sinaps, biz sinir terminallerine dramatik ve onarılamaz hasara neden olur tam güç uyarma aydınlatmada> 1 dakika uyarma bulundu. İlk akabinde, büyük ölçüde genişletebilir 15 dakika aralığında bir süre boyunca tam olarak daraltmak. Biz sistematik maruz kalma süresi ve yoğunluğu göreceli katkıları test etmedi, ama bu gözlemler temel ilke, hem en aza indirmek olmalıdır düşündürmektedir. Yani, uyarma ışık şiddeti ve süresi iyi görüntü alma ile orantılı minimum ve uygun kontrol görüntüleri zaman ders çalışmalarında alınması tavsiye edilir. Her zaman noktasında, veri tekrarlanan görüntüleme koşulları altında fototoksisite etkilenmez olmadığını test etmek için önceden görüntülenmemiş terminalin ek görüntü almak. Bu naif terminallerde etiketleme davranış köklerinin defalarca görüntülü benzerlik sağlamaktır.
Bir dizi faktör net yoğunluk d grup içi değişkenliği azaltabilirata. uygunsuz boyama hatta küçük alanlarda büyük ölçüde arası folikül veri değişkenliği etkileyebilir olarak ROI doğru yerleştirilmesi, özellikle arka plan ROI, önemlidir. Net yoğunluğu değişkenliği de her saç folikülü uçlarının palisade çevrilidir nasıl tamamen etkilenir. Kuşatma derecesi ilgili bir parametre, örneğin karşılaştır Şekil 2'de görülen hemen hemen tamamen dairesel bir şekil Şekil 1B hilal şeklinde markalama dağılımı. Daha karmaşık analizi, belki de otomatik yazılım algılama ve eşikleme kullanılarak gereklidir. Hatta en doğru şekilde analiz folikül grupları için yoğunluk dağılımları normal nüfus medyan ziyade araçlarının arasında tedavi karşılaştırmalar için parametrik olmayan istatistik kullanımını gerektiren, (bakınız Şekil 3) dağıtılan olmadığını unutmayınız. Böyle bir yüzdesi o kadar yoğunlukları ifade olarak Normalleştirme teknikleri,Ya da bir kontrol grubuna f karşı kontrol birçok preparatlar kadar daha değişkenliği azaltmak için uygulanabilir yaptı. dikkate alınması gereken nihai teknik öğe farmakolojik test için deneysel tasarım. Farmakolojik araştırmalar sırasında, boya uygulama öncesi 30 dakika boyunca ilaç çözeltisi içinde hazırlanmasını önceden inkübe edin. Daha sonra, boya çözeltisi içinde ilaç konsantrasyonunu korumak. ilaç, bir araç, tuzlu su ve aracın içinde eritildi, eğer kontrol olarak, ya tuzlu su kullanın veya.
Bu makale, bu yeni kulak kepçesi hazırlık küçük bir hazırlık ile deride mechanosensory sonlar yüksek kaliteli görüntüler sunar gösterilmiştir. Biz de vezikül geri dönüşüm iki kritik yönlerini farmakoloji incelemek için kullanılabilir göstermektedir. Biz bir glutamat reseptör agonisti boya içselleştirilmesi (endositoz bir belirteci) artırabilir ve ikinci, bu boya latrotoxin (ekzositoz bir uyarıcı) ile tekrar kayıp olduğunu ilk gösteriyor. Bu preparat önemiiyon ve teknik terminal fonksiyonu, yapısı ve onların arası ilişkileri optik izlenmesi için eşsiz fırsatlar verecek, görüntüleme deneyleri için yerinde cilt mechanosenory terminalleri yaşayan mükemmel erişim sunuyor olmasıdır. Bu ikinci amaçla, biz de birleşik optik / elektrofizyolojik çalışmalar (detaylar için kardeş vallahi makalesine bakın) kullanılmak üzere daha da geliştirdik.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
iş Britanya Tıp Araştırma Konseyi projesi hibe GSB için G0601253 ve SG 've GSB bir SULSA Bioskape hibe ile finanse edildi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS - Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera - basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Andres, K. H. On the microstructure of receptors on sinus hair. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).
- Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat. PLoS One. 9, e107073 (2014).
- Liley, A. W. An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat. J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).
- Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation. Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Drew, L., Wood, J. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).
