Abstract
小説解剖と記録技術は、光監視染色およびマウスの耳介の皮膚に毛包を取り巻く披針形端子の脱染色のために記載されています。準備が確実に広範囲に小胞のリサイクルの研究で使用さスチリルピリジニウム色素の取り込みと放出を研究する神経終末を生きることの複数の標識された単位の大規模な領域を得、シンプルかつ比較的速いです。標識は、単一の個体から同じ耳における制御の比較対テストを可能にする前に準備を細分化。役立つヒントは、調製、標識および撮像パラメータの品質を向上させるために与えられます。この新しいシステムは、薬理学的アッセイおよび取り込み、これらの両方の野生型で披針形端子に不可欠な染料および遺伝子改変動物の解放を機械的に誘発されるのに適しています。標識強度の調節の影響の例が示されています。
Introduction
彼らは通常、皮膚または他の周囲の組織の奥深くに埋もれているように機械刺激神経終末は、 その場でのアクセスに、一般的に小さな広く分布し、困難です。それらの可視化、したがって、通常は長期の免疫標識/染色期間、またはそのような緑や黄色蛍光タンパク質（GFP / YFP）1などの蛍光ラベルの遺伝子発現とマウス系統を得るための遅延と費用が続く切片が必要です。ここでは、便利な組織や研究のための毛包の求心性神経の多数へのアクセスを獲得するために迅速かつ簡単な方法を示し、それらはすぐに端末機能2の光学的監視のために標識することができますか。練習では、切開からの撮像に全体の技術は、わずか2時間で完了することができます。
感覚軸索の披針形端子はそれぞれに、哺乳動物における毛包は、毛包の上皮の周りに柵を形成支配しますグリア/シュワン細胞の間に挟まれた端末は、2-4を処理します 。端子の目的は、それらが取り囲む毛の機械的変位を検出することです。彼らは急速に、ゆっくりと適応語尾の混合物であるが、それらは主に髪の動きに応じて活動の短いバーストを生成します。動きがあっても継続的な変位の存在下で、停止するとき、通常、焼成は非常に迅速に停止します。
光学的方法によって披針形端子を研究するためのこのマウス耳介のモデルでは、これらの終末の構造と機能を研究するための多くの有利な特徴を持っています。耳介は、主に皮膚の二層の間の軟骨組織の量が少ないと、バックツーバック並置されています。皮膚は非常に薄く、簡単に起因する身体の他の部位に比べて弱く、接着剤、結合組織の最小量に解剖です。容易に分離表皮層は、したがって、卵胞および端末への良好なアクセスを与えます。神経支配簡単にアクセス可能と識別可能です。毛包は、よりまばら卵胞の個人または小グループのイメージングを容易に、他の皮膚領域よりも分布しています。薄い下層の真皮層は、そのようにさらに処理することなく、蛍光顕微鏡による撮影に最適です、染料および薬理学的薬剤への良好なアクセスを提供します。固定し、さらに組織学的処理の後、固定可能色素アナログを使用している場合はラベルされた端末のイメージングは、生きている端末であるか、いずれかです。
我々は、膜のリサイクルは披針形の語尾で起こることを示すために、この準備を使用し取り込み（エンドサイトーシス）によって証明し、スチリルピリジニウム色素（FM1-43の放出（エキソサイトーシス）している; N - （3-triethylammoniumpropyl）-4-（4- （ジブチルアミノ）スチリル）ピリジニウムブロミド）。染料は、しかし、かなりの投資シュワン細胞プロセス2にラベルを付けていないようです。また、この色素取り込み/リリースすることを示し、したがって膜R電子機器のリサイクル、非定型（ホスホリパーゼD-結合された）代謝型グルタミン酸受容体を介してグルタミン酸変調の対象となります。単純な刺激と分析プロトコルの結果が示されており、共通電位分析上の問題も強調されています。
Protocol
これらの方法は、2匹のマウスは人道的に頸椎脱臼により安楽死させRW ら銀行に報告研究で使用しました。英国では、これは動物に記載されている1方法（科学的手続）法、1986年から欧州指令63分の2010 / EU法的に承認されたスケジュールです。この連邦法は、動物福祉およびすべての手順を承認した倫理審査委員会によって、アバディーン大学で局所的に適用されます。
ラベリング1.準備耳
- このようなLileyの（1956）5のように、標準的な生理食塩水を準備し、90％O 2/5％CO 2（カルボゲン）でそれを飽和。 （12）のNaHCO 3、KClの（4）、KH 2 PO 4（1）、塩化ナトリウム（138.8）のMgCl 2（1） の CaCl 2（2）及びグルコース（11）Lileyの生理食塩水（mm）です。注：この原稿の残りの部分で、「生理食塩水」は、完全にカルボゲンで飽和されている食塩水を参照します。 dissectio中、20分 - nが、準備ごとに15をカバーする生理食塩水をリフレッシュ。
- 人道的に頭蓋骨を損傷することなく、成体マウスを安楽死させます。注：私たちは、C57 / Bl6JとMF1マウスを使用しているが、任意のマウス系統を使用することができます。最も重要な側面は、大規模な成人（> 25 g）を使用しないことです。大きいマウスでのラベリングは、多くの場合、卵胞の小さな散乱グループに限定され、信頼性が低いです。
- （50ミリメートルは通常便利である）だけ緻密なヘアラインの上、~25センチハサミでベースの近くに外部の耳（耳介）を削除して、シリコーンゴムでライニング文化/シャーレに生理食塩水に浸します。
- 位置耳介前部（凹）側を下にし、細かい虫ピンで定期的に、シリコーンにマージンをピン（〜6から8耳あたり、〜0.2ミリメートルの直径のピン）。 20分、または絶えず灌流風呂を使用 - 生理食塩水ごとに15を更新します。
- 慎重に最初に耳介のカットベースの上からアクセスし、鈍的切開によって、前部皮膚から後方皮をはがし厚い中央軟骨および体系的に薄い、軟骨無外部余白に向けて取り組んでいます。
- これを行うには、無一対の後部皮膚のカットエッジの中心を保持します。 3鉗子。そして、顎と無の別のセットのポイントを配置、閉じました。皮膚とその下にある軟骨との間のギャップで3鉗子。
- ゆっくり層を分離するために後方皮膚をバック剥離しながら、慎重に癒着を緩め、必要最小限の力を利用して、ギャップ内左右にから、閉じた鉗子のポイントを働きます。
- 後部の皮膚を除去した、位置の前方の皮膚を残します。 （上記、1.5ごとに）前方の皮膚の横に、最大事後皮膚、真皮側をピン。
- 次に、慎重かつ完全に1.6と同様の鈍的切開法により前方皮膚から皮膚層の間に挟まれた耳介軟骨を除去します。鉗子で穿刺穴をあけないでください。
- そして、Fまたは両方の耳介皮膚の準備優しくピール、摘むと毛包の拠点をカバーする発泡ポリスチレンフォームを、似ている、結合組織の薄い層を離れてこします。注：最適なクリアリングを得ることが少し練習を取ることができます。あまりにも積極的に掻きする卵胞のベースであるニューラルネットワークを削除しながら、不十分な組織除去は、色素溶液のためおよびイメージングのための両方のアクセスを妨げます。
- 生理食塩水をリフレッシュします。
2.披針形ターミナルラベリング
注：以下のプロトコルは、スチリルピリジニウム色素のために最適化されています。その他、化学的に類似し、スチリルピリジニウム色素は、おそらく濃度およびインキュベーション時間内にいくつかの調整後、動作するはずです。染料溶液を取り扱う際は手袋と白衣を着用してください。メーカーから直接10mMストック染料溶液を購入したり、グルコースを含まない生理食塩水で染料粉末を溶解させてストックを準備するのどちらか。アリコート（10μlのは、通常は便利ですが、大きなSCAのためにこれを調整しますル実験）とストアが-80℃-20℃で6ヶ月まで、または約1年のために凍結します。粉末は、少なくとも2年間は保存されます。染料溶液を繰り返し凍結/融解を避けます。これは急速に染料を変性させます。一度、解凍し、4℃で保存し、1週間以内に使用します。
- 水面下の5ミリメートル - プラットフォーム〜3で、30℃に水浴を事前に加熱します。
- 新たに10μMスチリルピリジニウム色素溶液（10mLの生理食塩水で新鮮に解凍し、10mMのスチリルピリジニウム色素を10μl）を調製し、水浴中で平衡化します。
- 生理食塩水の2ミリメートル（典型的なボリューム、〜2ミリリットル） - ピンは、シリコーンゴムの各製剤は、1に沈め35mm培養皿を並びます。動物の使用を最小限に抑えるために、 - （15cmの長さ10）頂部から半分に切断した場合の各耳介皮膚製剤は、小さなはさみでベースに2つの調製物が得られます。
- 30°Cの水浴に沈めたプラットフォーム上で、生理食塩水で覆われた耳介の準備を含む35mm皿を置きます。確保水の深さは、適切な温暖化のために十分であるが、オープン皿に生理食塩水を汚染しません。
- ピン罰金-継続的に準備をガスに各皿のシリコーンベースにO 2 / CO 2を流しながら（0.5 1ミリメートル外径）チューブ。また、水槽に洗濯/皿のさわやか用色素フリーの生理食塩水100ミリリットルを配置します。カルボゲン飽和を維持し、水の汚染を防止するために密栓ボトルを使用してください。
- ボトルを栓100ミリリットルから耳介の製剤より生理食塩水を交換し、その後30分間30℃ですべてを平衡化します。さらに30分インキュベートします。注：この置換は、生理食塩水の蒸発やガスラインの泡立ちに起因する任意のかさ体積の損失を補償します。
- その後、迅速かつ慎重に、次の追加する染料溶液に希釈効果を最小化するためにティッシュペーパーと準備の周りに残っている任意の液体を離れてしみ、100ミリリットル廃棄物のビーカーに無染料の生理食塩水を離れて注ぎます。 （触れないように注意してください
- その後、30℃で40分間、10μMスチリルピリジニウム色素の3ミリリットル手順の残りのためのR / Tに戻る - 2に耳介の準備をインキュベートします。
- R / Tでのソリューションを使用して、3段階で非内在化色素を除去。注：これらの手順は、最高のイメージングのために目の暗適応を開始するために、最小限の環境光（ブラックアウトブラインド、赤/オレンジ低強度の照明）で行われています。
- 廃棄物のビーカーに皿から標識溶液を離れて注ぎ、すぐに立て続けに無染料の生理食塩水を3回交換ですすぎます。これは準備に付着した残留スチリルピリジニウム色素溶液と簡単にさらさ膜からdepartitions任意の色素を除去します。
- 表面膜から最も残りの染料をDEPARTITIONするさらに30分間、無染料の生理食塩水、 すなわち最終的な変化でインキュベートし、端末によって内在化されない染料。
- 永続的な色素を除去トンを立ち往生スルホン化β-シクロデキストリン誘導体とキレート化することによって露出した膜の外部リーフレットO（Advasep-7、1 mMのは、5分- 表1を参照します）。このように、残りのすべての染料は、組織内であろう。
- イメージングのための新鮮な無染料の生理食塩水に入れて、徹底的にティッシュペーパーで皿の外側を乾燥させます。
注：端末は今イメージングのための準備が整いました。披針形の語尾がゆっくりと再びエンドサイトーシススチリルピリジニウム色素を放出するので、生きているとことを認識することが重要です。これは、R / Tで遅くなりますが、撮像中/前に遅延を最小限に抑えることが重要です。実験は、複数の製剤のラベリングを必要とする場合は、最初に30℃で、それらすべてが標識されていない維持します。彼らは、数時間生存可能であろう。最初に画像化しながら、 - その後、第2の調製（2.8.3 2.7ステップ）を標識することにより、間隔で順次ラベルを付けます。
披針形エンディング標識3.イメージング。
注：オブザーバー次の画像形成工程のために暗順応でなければなりません。これがもたらす増加した視力が低い励起光レベルはイメージングのための卵胞を見つけるために必要とされていることを意味します。これは、光毒性を最小限に抑えるのではなく、光退色の不便を軽減するために最も重要です。完全な強度の光照射によって生成されたフリーラジカルは速やかに（60秒以内）に住ん神経終末（GSビューイック、S. FadulとWJベッツ、未発表の観察）を死滅させることができます。
- 撮影前に、解剖実体顕微鏡下準備を確認し、慎重に任意の表面の破片を除去します。これは、画像を汚染する自家蛍光を防ぐことができます。
- 標準フルオレセインフィルターセットを持つ直立落射蛍光顕微鏡のステージ上に皿をマウント（480から488 nm励起、500 - スチリルピリジニウム色素のための520 nmの発光）。
- 快適に、端末を特定するためにちょうど十分なまでNDフィルターで励起光強度を減衰させます秒。
- 低で観察することにより標識した卵胞を見つけて - その後、次第に高い（10倍と20倍の水浸対物レンズ）倍率の目標を（3.5倍乾燥対物レンズ4倍）。
- 低消費電力と高倍率用の20倍の水浸対物レンズ用の10倍のドライ対物レンズを通してラベルされた披針形端子の画像をキャプチャします。光強度と露光時間を最小限（0.5のカメラ積分時間 - 1秒が提案されています）。
- 標準的なデジタルカメラの画像をキャプチャし、独自のソフトウェアを使用して、コンピュータのハードドライブに画像を保存します。注：典型的な例は、図1に示されています。
- 各調製物からの画像〜20披針形の語尾。このマージンイメージング順番にそれぞれの卵胞に沿っ耳介皮膚や仕事のベースにカットエッジからマージン遠いで起動します。ない画像に明らかに破損している同じ卵胞二回といずれかを注意しながら、カットエッジに平行に若干の重複分野にまたがって動作。注記：再は、典型的には、それらをすべての重要な自発的な脱色が起こる前の画像にあまりにも多くの披針形端子です。したがって、我々は体系的に以下のプロトコルを使用して人口をサンプリングすることをお勧めします。
- マージナルストリップを完了した後、耳介の付け根に向かって一つのフィールド幅を移動し、逆方向に処理を繰り返します。
- 画像すべての端末が明らかに非常にはるか斜め光学面に標準環状分析ROI内に完全にフィットしにくい指向時折ものを除いて、遭遇する（セクション4を参照）。彼らは明らかに破損しているか、バックグラウンド強度は、ローカライズされた組織の損傷を示し、特に高くない限り、周囲の端末に比べて異常に明るくしたり、調光器lanceolatesを除外しないでください。
- 皮膚領域の10％以上が/端子が/使用不能に破損している場合の準備を捨てます。注：時間とともに脱色lanceolatesとして、完全なイメージング洗浄の最後の20分以内に各製剤。
- 私F複数の調製物を用いて、強度の比較は、時間整合調製物による有効であることを確認します。これを行うには、脱染色時間の比較可能性を確保するために、30分〜により各製剤を染色のタイミングオフセット。
- 5または10分間隔で脱染色（エキソサイトーシス）、画像同じ端末を監視します。実践では、いずれか1つの製剤中の各時点での3つの別々の端子まで画像化することが可能です。
披針形エンディング標識4.分析。
注：次の手順では、端末の強度を分析するための迅速な方法です。
- 関心領域（ROI）の環状領域を作る毛包の基部（ 図2）で毛シャフトの先端を中心に。分析されるべき任意の卵胞に毛幹の自家蛍光を回避するのに十分な大きさの環状のROIの内周を設定するが、それでも全ての端末蛍光を包含する。外周最大terminを同封するのに十分な大きさであることを確認してください主光/卵胞軸に近い向く遭遇するアル可能性が高いです。
- 分析中のターミナルの近くに地元の染色強度を決定するために、ターゲット環形（正方形または円形、通常、〜400ミクロン2）の領域でほぼ等しい背景ROIを行います。
注：これらの2つのROIの大きさは、分析の開始時に設定され、いずれかの実験ですべての製剤全体のすべての後続の卵胞/披針形端子を分析するために使用されます。だから、初めに注意してそのパラメータを設定することが重要です。 - 端子、毛包間のない低強度の皮膚の基礎となる皮脂腺内のローカルバックグラウンドを表すために卵胞に十分近い背景ROIを配置したが、いずれかの末端領域を含めるしないように注意してください。
- 「メジャー」またはスプレッドシートへのソフトウェアおよび転送データの「分析ROI」機能を使用して2つのROIの平均強度を記録します。
- スプレッドシートでは、各個々の卵胞のネット強度を与えるために線維輪のものから平均局所バックグラウンド強度を差し引きます。ローカライズされた背景のこの調整は、大幅間、卵胞のばらつきを低減します。
Representative Results
この耳介準備中の毛包は、簡単に準備して、これらの機械刺激の端子に与えるアクセシビリティの相対的な容易さの非常に薄い性質を示す、蛍光（ 図1A）なし透照の下で見られています。それぞれが皮脂腺の暗い三日月を貫通する著名な毛幹ベースに代表されます。エピ蛍光下では、各毛包を囲むラベル付き披針形端子が明らかと一般的に堅牢な自発的なスチリル色素の取り込み（ 図1B）を示しています。これは、課せられた移動なしに発生します。包囲の程度が可変6であるが、披針形端子は、毛幹を囲むように見られています。標識化の多くは、点状（スポット）よりもむしろ予想される線形配置です。斑点状のパターンは、端末の長さに沿った光学面で観察されている端末を反映しています。ティ調製物は、標識後の可視化のための更なる処理を受けていない、それは、もう一度この製剤の単純さを示しており、顕微鏡ステージに移し、 その場で画像化しました。
この新規の製剤が適している実施例の実験は、 図3に示されている。エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスのリビング末端で、ならびにそれらの変調の両方を研究するために使用することができます。例えば、Mg 2+とNi 2+またはCDなどのリガンドまたはカチオンとのCa 2+チャネルを遮断する2+それ2を減少しつつ、エンドサイトーシスのために、グルタミン酸受容体アゴニストは、標識強度を増加させることができます。あるいは、この製剤はまた、図3（c）に示すように 、エキソサイトーシスの動態を研究するために使用することができます。まず、標識された端末は自発的に脱染色を見られています。しかしながら、この脱色はラトロトキシン、エキソサイトーシスの刺激によって促進されます。詳細デ実験結果の尾部は、RW ら 2バンクに見ることができます。
図1.マウスの耳介に記録された堅牢なスチリル色素標識化 。 （A）毛包が乳輪/脂肪組織の上にあるのクリアエリアに表示される方法を明確に示す明視野照明で標識されていない耳介の準備、の一部。暗い、通常bilobed、三日月形状は、中央毛幹を囲む皮脂腺です。わずかに高い倍率で（B）同様の面積、およびスチリル色素で標識された披針形の語尾を示す、落射蛍光で画像化。スケールバー- 。40ミクロン、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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スチリル色素標識強度の図2.分析 。 （A）（この画像では見えない）毛幹を中心スチリル色素と毛包の標識の典型的な円形パターン、。 （B）の主な分析」、関心領域」（ROI）は、卵胞を囲む披針形の神経終末の柵の位置に重畳標準弁輪によって定義されます。このROIは、標識強度はかなり準備の間、すべての処置間で比較することができることを確認するために、任意の単一の実験のための形状と面積で一定に保たれます。各ROIの正味強度は、隣接する正方形または円形の背景領域（〜400ミクロン2）の強度を差し引くことによって計算されます。再び、この正方形の背景領域は、任意の所与の実験を通して形状および面積で一定に保たれます。ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
毛包求心性Lanceloateエンディングの図3.標識強度は通常、分散されず、エンド-およびエキソサイトーシスの両方を検査するために使用することができます。スチリル色素の強度測定値から代表的なデータを、上記の分析方法を用いて、自然にラベル付け披針形端子に。制御条件の下で（A）ラベリング強度（54包、4耳）および1mMグルタミン酸（42包、4耳）。個々の末端の強度値は、クラスタドットプロットとして表示されます。各点は、毛包の周囲の一方の端子柵の強度を表します。ほとんどが低い強度でクラスタ化されている間であっても制御条件の下で、いくつかのデータポイント（卵胞）は、非常に強いであることに注意してください。特定のINTENSで最初のドット性は、中央にプロットされ、同じ強度の後続のデータ点は、両側に次第に横方向にプロットされています。したがって、横方向の広がりは、任意の特定の標識強度の卵胞の周波数を表します。水平線は中央値±25％の四分位範囲を表します。 1 mMのグルタミン酸とのインキュベーションは、〜50％（*** P <0.001、マン・ホイットニー）により中央値強度を向上させるが、標識は200によって向上させることができます - 一部の端末では300％。 （B）画像は、グルタミン酸が媒介する強化された色素取り込み（エンドサイトーシス）を実証します。増加ラベリング強度によって示されるように、グルタミン酸（1 mM）の中の毛包製剤のインキュベーションは著しく、スチリル色素の取り込みを増加させます。スケールバーは20μm。 （C）強化色素放出（エキソサイトーシス）。 0分での標識化は、光退色のために制御することがあってもバックグラウンドを差し引いた後、明らかに60分でより明るいよう標識後、スチリル色素が自発的に、再び解放されます。このリリースは大幅に経口であります制御されていない小胞のエキソサイトーシスをトリガーラトロトキシン、クロゴケグモ毒成分によってtentiated。毒素で60分後、末端標識はほとんど検出不可能です。スチリル色素標識のこの可逆性は、端末蛍光がシナプスのような小胞の地域循環中に内在化によるものであるという仮説をサポートしています。スケールバーは20μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
ビューイックとベッツは、もともとシナプス小胞の膜の地域循環を監視するために、ピリジニウムジブロマイド関連スチリルピリジニウム色素7-10を N-（3-triethylammoniumpropyl）-4-（4-（ジブチルアミノ）スチリル）を開発しました。色素取り込み、ひいては蛍光の増加、したがって、シナプス小胞の膜内在（エンドサイトーシス）を反映しています。続いて、この内在化色素は、さらに電気的活動によって再リリースすることができ、染料の損失を示すことは小胞膜の外部化（エキソサイトーシス）を監視します。シナプスでは、これは、神経伝達物質の分泌のためのプロキシです。同時に、我々はまた、これらの染料は、一次機械刺激神経終末7にラベルを発見しました。さらに最近では11、ビューイック、銀行や同僚は、これは成熟した、差別機械刺激端末のex vivoでの同様のプロセスを反映していることが示されました。グルタミン酸を放出するように構成的にリサイクルここで再び、染料ラベル50nmの直径「シナプス様」小胞（SLVS）。機械刺激の端末では、そのシナプスの対応とは異なり、このリサイクルは主に自発的です。また、機械的ではなく、単に電気刺激によって調節されます。
文化および蝸牛の有毛細胞における感覚ニューロンのために、一般、特にスチリルピリジニウム色素でスチリル色素は、機械刺激チャネルを遮断し、不可逆的に内部の膜12を標識し 、機械刺激チャネルを通過することが示されています。しかし、筋紡錘11で2、またはIaの終末で披針形語尾のように、ここでその場で差別機械刺激端末、で同等のスチリル色素の濃度でかつ機械的に13、14を刺激されていない有毛細胞では、標識は、膜のエンドサイトーシスによるものです。機械刺激神経終末では、例えば、標識が可逆的であり、2、11、1、ここで使用される濃度では機械刺激応答をブロックしません。これらの終末におけるチャネル透過による一部の染料内在化を完全に排除できないものの5。、ラトロトキシンとほぼ完全脱色は、成熟した端末で、標識の大部分はリサイクル小胞の膜と内在化することによってであることを示します。我々は、したがって、色素の取り込みと放出に対する薬物効果を調べることによって、最も最近では、機械刺激求心性端末でSLVリサイクルの薬理2を活性依存性11を研究するためにこの技術を使用するとしています。
最も実用的な技術と同様に、再現性が反復と練習が必要です。信頼性を確保するための重要な点のいくつかを説明します。若い動物での披針形の標識は、より信頼性がある - 私たちが使用している最小の動物は、15グラムの体重でした。これが事実である理由は、必ずしも明らかではないが、若い結合組織の切開が少なく、機械的外傷およびルを必要とするので、それであってもよいです神経支配層を覆う組織を除去する際に鳥類少ない残基を残り。
全体的に、組織標本は、皮膚層が離れて最も技術的に困難な実用的な側面であること剥離した後にのみ、古いマウスではと、非常に簡単です。これらには、皮膚層は解剖が起動しますが、ここでも層の分離は、余白に向かってはるかに容易になるベースで一緒に強く接着します。一般的に前方皮膚がそうであるようにありがたいことに、またはおそらくその結果、これらの薄い限界皮膚領域は、通常、最も満足の標識を与えます。そのため、特にマージンで非常に薄い皮膚を把握することは避けてください。損傷のリスクを最小限に抑えるために、閉じた鉗子で押すのではなく、直接把握することで、または本質的な把握が唯一の厳しい組織ラベル付けされる可能性が低い場合には、間接的に準備を操作します。これは主に私のようにすぐに、毛包の上にある「シートポリスチレン」層を除去するのに十分なことイメージングおよび薬物のアクセスにchanical閉塞。しかし、それだけで以下の根底にあるこの損害賠償などの構造（ すなわち、剥ぎ）ニューラルネットワークと端末との物理的接触を最小限にすることが不可欠です。支配的な蛍光は皮脂腺、毛拠点と黄色/オレンジ披針形の語尾の数三日月の著名な自家蛍光の白/黄色の場合、これは神経叢層を示し、関連する披針形端子は、クリアランスの間に除去されています。これは、古い（> 30グラム）マウスを用いた主な問題であるように思われます。染色手順を通して、すべてが30℃であり、十分に酸素を確認してください。ラベルされた端末がまだ生きていることに注意してください。その結果、色素は、継続的な自発的（構成）エキソサイトーシスリリースにより分泌されます。これは、R / Tで遅くなりますが、染料の損失を最小限にするために、キレート剤溶液およびイメージングの除去の間の遅延を最小限にすることをお勧めします。また、群間の比較のために強度のtudies、それはすべてのグループの画像化を確実にするために不可欠なことは、時間的に整合します。イメージングの前に染料キレート剤の使用は、非常に画像のコントラストを向上させることができます。そこで、比較的高価ながら、キレート化ステップは、良好な画像品質を確保するために非常に重要です。使用の間、4℃で保存した場合、3日連続 - キレート剤の使用は、溶液を複数回再利用することにより、最小化、さらには2にすることができます。それは、その染料の隔離が飽和に近づいている示し、顕著にピンクの行く一度キレート剤液を捨てます。
撮影時には、強度と励起光の露光時間の両方の累積結果であるこれらの生活の端末に光毒性損傷の可能性、に注意してください。この考慮事項は、画質が主要な関心事である単一の時点の画像、のためにそれほど重要ではありません。しかし、最小の励起光曝露を低減するために動力学研究における繰り返し撮像中に重要です。これらの染料を開発している間ラベルのシナプスは、我々は神経末端への劇的な回復不能な損傷を与える可能性がありますフルパワーの励起照明で> 1分間の励起を見つけました。彼らはまず、その後、絶大な展開後、〜15分間かけて完全に崩壊します。我々は体系的に露光時間と強度の相対的な寄与をテストしていないが、これらの観察は、基本理念は、両方を最小化することであるべき示唆しています。だから、励起光の強度および持続時間は、良好な画像を得るに見合っ最小であり、かつ適切な制御画像は経時研究で取られることをお勧めします。データが繰り返し撮影条件の下で光毒性によって影響されないことをテストするために、各時点で、以前に未視聴端末の追加の画像を取ります。これはナイーブ端末内の標識の挙動は卵胞で繰り返し撮像されていることに似ているようにすることです。
多くの要因は、正味の強度Dの群内変動性を低減することができますATA。不適切な染色の小さな領域が大きく間、卵胞のデータの変動に影響を与えることができるようROIの正確な配置、特に背景ROIは、重要です。ネット強度の変動は、各毛包が語尾の柵で囲まれている方法を完全に影響されます。例えば、 図2に見られるほぼ完全に円形パターンを有する図1Bの三日月形の標識分布を比較してください。より複雑な分析、おそらくソフトウェアの自動検出としきい値を使用して、包囲の程度は、関連するパラメータである場合に必要です。最も正確に分析した卵胞のグループのための強度分布は、通常、人口の中央値ではなく、手段の間の処理の比較のためのノンパラメトリック統計の使用を必要とする、（ 図3参照）は配信されませんのでご了承ください。このようなパーセンテージOなどの強度を表現するよう正規化技術、F対コントロール、またはいくつかの調製物からなる対照群、さらにばらつきを低減するために適用することができます。考慮すべき最後の技術的な項目は、薬理学的試験のための実験的なデザインです。薬理学的調査の間に、染料を適用する前の30分間の薬液で準備を事前にインキュベートします。その後、染料溶液中の薬物濃度を維持します。薬物は車両、生理食塩水を加えた車両に溶解された場合のコントロールでは、生理食塩水または、いずれかを使用します。
本資料では、この新しい耳介製剤は最小限の準備で皮膚に機械刺激終末の高品質の画像を提供しています方法を示しています。我々はまた、小胞のリサイクルの2つの重要な側面の薬理学を調べるために使用できることを示します。私たちは、グルタミン酸受容体アゴニストは色素の内在（エンドサイトーシスのマーカー）を増加させることができ、そして第二に、その色素はラトロトキシン（エキソサイトーシスの刺激剤）で再度失われていることを最初に示しています。このpreparatの意義イオンおよび技術は、端末の機能、構造およびそれらの相互関係の光学的監視のためのユニークな機会を与える、イメージング実験のためにその場で皮膚mechanosenory端子を生きへの優れたアクセスを提供することです。この後者の目的のために、我々はまた、結合された光/電気生理学的研究（詳細については、姉妹Joveの記事を参照してください）で使用するためにさらにそれを開発しました。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
作業は、英国医学研究審議会のプロジェクト助成GSBにG0601253とRWBとGSBへSULSA Bioskapeの助成金によって賄われていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS - Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera - basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Andres, K. H. On the microstructure of receptors on sinus hair. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).
- Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat. PLoS One. 9, e107073 (2014).
- Liley, A. W. An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat. J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).
- Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation. Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Drew, L., Wood, J. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).
