Abstract
Generalist bestøvere ligesom buff-tailed humlebi, Bombus terrestris, støder både næringsstoffer og giftstoffer i blomstret nektar, de indsamler fra blomstrende planter. Kun få studier har beskrevet de smagsmæssige svarene fra bier mod toksiner i fødevarer, og disse forsøg har hovedsageligt brugt snabel forlængelse respons på fastholdte honningbier. Her er en ny adfærdsmæssige assay præsenteret til måling fodring reaktioner af frit-bevægelse, individuel arbejdstager humlebier til næringsstoffer og giftstoffer. Dette assay måler mængden af opløsning indtages af hver humlebi og identificerer, hvordan smagsstoffer i fødevarer påvirke mikrostruktur spiseadfærd.
De løsninger præsenteres i en mikrokapillær rør til individuelle humlebier, der tidligere er blevet udsultet for 2-4 timer. Adfærden er fanget på digital video. Den fine struktur af spiseadfærd analyseres ved kontinuerligt at udføre positionen af ProboLAF (munddele) fra videooptagelser bruger hændelseslogføring software. Positionen af proboscis er defineret ved tre forskellige adfærdsmæssige kategorier: (1) snabel er udvidet og i kontakt med opløsningen, er (2) snabel udvidet, men ikke i kontakt med opløsningen og (3) snabel er anbragt under hovedet. Derudover skønnes også hastigheden af snabel tilbagetrækningskraften bort fra opløsningen.
I det foreliggende assay den forbrugte mængde natriumhydroxidopløsning, antallet af fodring anfald, er varigheden af fodring anfald og hastigheden af proboscis tilbagetrækning efter den første kontakt anvendes til at evaluere phagostimulatory eller afskrækkende aktivitet af de testede forbindelser.
Denne nye smag assay vil give forskerne at måle, hvor forbindelser, der findes i nektar påvirke fodring adfærd bier og vil også være nyttigt at bestøvning biologer, toksikologer og neuroethologists studerer humlebien smag system.
Introduction
Plant-bestøver interaktioner er komplekse. Bestøvere besøge blomster at få nektar og pollen som fødevarer; til gengæld bestøvere lette seksuel reproduktion i planter. Mens dette forhold er for det meste mutualistisk, blomster nektar og pollen til tider indeholder giftstoffer eller anden plante forbindelser 1-5 som kan skade bestøvere. Den økologiske begrundelse for tilstedeværelsen af sådanne forbindelser i nektar og pollen er ikke klart i alle indstillinger. Et fremragende spørgsmål på dette område er, hvordan bestøvere, såsom bier kan opdage og undgå blomster med nektar indeholder toksiner.
Humlebien arter, Bombus terrestris (Linnaeus, 1758), er en generalist bestøver der besøger blomsterne af mange plantearter, herunder dem, der producerer nektar indeholder toksiner 6. Humlebier har vist sig at undgå forbrugende opløsninger indeholdende høje koncentrationer af toksiner i en 24 hr to choice assay 7. dette assayaf fødevareforbrug beskrevet af Tiedeken et al. 7 viste, at bier kan registrere bitre forbindelser i løsninger. Men dette assay var i stand til at skelne smag fra post-ingestive processer såsom utilpashed, der også kunne påvirke spiseadfærd i denne tidsinterval 8-10.
Bier besidder gustatory sensilla på deres antenner, munddele og tarsi at detektere forbindelser 11-13. Den snabel forlængelse refleks (PER) eksperimenter involverer fastholdende enkelte bier i en sele og derefter stimulere biens antennal sensilla at producere fodring refleks 14-17. Bier kan holdes tilbage i individuelle seler og derefter stimuleret til at producere fodring refleks som et assay af deres evne til at smage forbindelserne 18,19. Andre har ændret PER analysen at undersøge følsomheden af antenner eller munddele til toksiner 9,20. Men bier udsættes for stress under udnyttelse. Dette kan påvirke, hvordande reagerer på forbindelser 21.
Her er en ny analyse beskrevet at vurdere adfærdsmæssige smag reaktion frit omsættelige humlebier til saccharose og kinin, et alkaloid, der tidligere har været rapporteret at være afskrækkende 9 og giftigt 10 til honningbier (Apis mellifera) og humlebier (Bombus terrestris) 7, 22. Selvom kinin ikke er blevet fundet i plante nektar, er denne alkaloid ofte brugt som et afskrækningsmiddel stimulus i adfærdsmæssige og fysiologiske studier i bier 7,9,12,13,22. Metoden indebærer videooptagelse humlebier 'munddele på stor opløsning under den indledende snabel kontakt med test løsninger. Specifikt fine struktur fodring respons undersøgt ved kontinuerligt at udføre opførsel over en 2 min interval. Den forbrugte mængde natriumhydroxidopløsning måles under fodringsperioden og så mængden af indtaget føde kan korreleres med mikrostrukturen affodring adfærd. Også hastigheden af proboscis tilbagetrækning måles, som en indikator for en aktiv unddragelse, og derfor pre-ingestive detektion.
Protocol
1. Optagelse Bier fra kolonien og Sult Periode
Bemærk: Eksperimenter beskrevet her blev udført ved Newcastle University, UK med Bombus terrestris Audax. Multiple (2-3) kommercielt indkøbt kolonier blev anvendt per behandling. Kolonierne er blevet fastholdt på en bænk på laboratorieforhold (25 ± 2 ° C og 28 ± 2% RH) i konstant mørke og blev fodret med honningbi indsamlet pollen og sukkeropløsninger ad libitum.
- Saml enkelte arbejdstager humlebier ved hjælp af en plastik hætteglas (7 cm lang, 2,8 cm indvendig diameter) med en perforeret plastik prop, efter at have åbnet porten til kolonien lige længe nok til en bi for at afslutte og blive fanget.
- Forud for forsøget, individuelt sulte alle humlebier for 2-4 timer i plast hætteglas og holde ved stuetemperatur i komplet mørke.
2. Overførsel bier i Holding Rør og Habituation Phase
- Efter sult periode, overføre en humlebi direkte fra plast hætteglas i en bedrift rør. Holderøret er en modificeret 15 ml centrifugerør (længde: 119 mm; diameter 17 mm), med en 4 mm hul boret ved spidsen og et stykke stålnet (base: 8 mm; højde 30 mm) fastsat inden om af smeltning plast af røret med en opvarmet dissekere stål kanyle.
- Fastgør den bedrift røret med humlebi på en polystyren holder med dental voks. Fix to stykker karton på begge sider af holderøret. Dette er for at beskytte bien fra visuelle stimuli, der kan interferere med eksperimentet.
- Placer et digitalt mikroskopisk kamera 5 cm over spidsen af bedriften røret og tilslutte kameraet til en kompatibel bærbar computer.
- Juster holderøret således at mindst de første 18 mm af holderøret spids er inden for videobilledet. Før forsøget, påbegynde den 3 min tilvænningsperiode.
3.Pre-test Fase: Præsentere en Drop af saccharose
- Tilslut en sprøjte til en kvindelig adapter indeholdende en dråbe saccharoseopløsning (~ 3,5 pi, 500 mM saccharose opløst i deioniseret vand). Præsenter saccharose inde i holderøret tip til at motivere udvidelsen af snabel.
- Giv humlebien op til 5 min at forbruge saccharose dråbe. Hvis dråben ikke er forbrugt, fjernes humlebien fra eksperimentet.
- Begynd videooptagelse efter tilvænningsperiode. I denne undersøgelse blev den snabel aktivitet optaget ved 26,7 billeder / sek -1 med en 25X forstørrelse sats.
4. Test Phase: Præsentation af Test Solution
- Fyld en 100 pi mikrokapillær rør med prøveopløsningen. Tilslut den til et stykke silikone slange (6 cm længde, 1 mm indvendig diameter) og ordne det til en mikro manipulator.
- Tilslut slangen via en mandlig adapter til en anden silikone slange (6 cm længde, 4 mm indvendig diameter), whilm fungerer som en pipette pære.
- Placer mikrokapillær røret 5-10 mm væk fra bedriften rør spids. Tryk forsigtigt slangen at opretholde fodring opløsning ved spidsen af mikrokapillær rør.
- Efter humlebien forbruger saccharose dråbe, straks fjerne sprøjten med 500 mM sucrose løsning.
- Begynd 2 min test fase, hvor humlebien er proboscis kontakter løsning inde i mikrokapillær rør.
- For at kontrollere for mulige fordampning, fylde yderligere to mikrokapillære rør med sucrose eller vand og manipulere det nøjagtigt som under testfasen.
- Før og efter hvert forsøg scanne væskeniveauerne inde i mikrokapillær rør under anvendelse af en scanner ved 600 dpi at måle mængden af indtaget foder (figur 4A).
5. billede Analyser
- Bestem mængden af løsningen forbrug ved hjælp ImageJ (version 1.48), et billede procEssing software.
- Upload billedfilen og zoome ind i billedet (~ 400%). For at indstille henvisningen skala, skal du vælge den rette linje værktøj og trække en linje mellem de to ender af mikrokapillær rør. Vælg 'Analyser' og derefter 'Set Scale «. Input den samlede længde af røret under 'Kendt distance "og den tilsvarende enhed under' Enhed for længde '.
- Vælg lige linje værktøj igen og trække en linje mellem de to ender af væskeniveauet. Vælg 'Analyser' og derefter 'Measure «. I vinduet resultater er givet af længden af væsken i kolonnen 'Længde «.
- Beregn rumfanget af opløsningen forbrug ved hjælp af formlen:
hvor
er længden af mikrokapillær røret og 
og
er længden af mikrokapillær røret og 
og 6. Video Analyser
- Score fodring adfærd under 2 min test fase af hver video ved hjælp af en begivenhed logging software (se Materialer tabel).
- I første omgang definere fodring adfærd (dvs.. De elementer) i adfærdsmæssige klasser menu af optagelsen software. De fodring adfærd er som følger: (1) snabel ud / kontakt: den snabel udvider og er i kontakt med opløsningen inde i mikrokapillær røret (2) snabel ud / ingen kontakt: den snabel udvider og er ikke i kontakt med opløsningen inde i mikrokapillær rør, (3) snabel anbragt: den snabel er ikke forlænges, men i stedet stuvet under hovedet og (4) ud af syne: humlebien er ude af videobilledet.
- Indstil hver adfærdsom en "stat" og "gensidigt udelukkende" i menuen egenskaber og gøre kontinuerlige optagelser til en 2 min interval. Replay videoerne i slow-motion-funktion (2 gange langsommere) for mere præcision.
- Mål hastigheden på proboscis tilbagetrækning fra testopløsningen efter den første kontakt mellem to på hinanden følgende rammer (adskilt af 37,5 msek i videooptagelser vist her) med en bevægelsessporing video software (se Materialer tabel).
- Upload videofilen og springe til rammen, hvor de snabel første kontakter løsningen.
- For at indstille henvisningen skala, skal du vælge linje værktøj og trække en linje på bredden af mikrokapillær rør i videobilledet. Højreklik på linjen og vælg 'Kalibrer foranstaltning «. Input bredden af kapillarrøret og den tilsvarende enhed.
- Vælg 'Billede' og derefter 'Koordinatsystem oprindelse «. På det nye vindue klikker på spidsen af snabel og vælg9 Anvend '.
- Vælg hånd flytte værktøjet, skal du højreklikke på spidsen af snabel på videobilledet og vælg 'Track Sti'. Flyt til den næste ramme og justere sporing punkt til spidsen af snabel.
- Højreklik på tracking punkt, og vælg 'Configuration'. Vælg 'Complete Path' og vælg 'Speed' under måling. Vælg 'Tilføj ". Hastigheden Derefter vises.
Representative Results
Den hidtil ukendte assay anvendes til at teste fodring reaktioner på 1 M saccharose, 1 M sucroseopløsning plus 1 mM quinin og deioniseret vand alene. De umiddelbare fodring reaktioner på hver behandling bestemmes ved at kvantificere varigheden af proboscis kontakter med testopløsningen, hyppigheden af fodring anfald og hastigheden af snabel tilbagetrækningskraften væk fra testopløsningen efter den første kontakt i løbet af 2 min testfase. Den forbrugte mængde natriumhydroxidopløsning måles også efter testfasen. I denne undersøgelse har vi valgt et anfald kriterium interval på 5 sekunder (Figur 1, se Supplemental File) baseret på tidligere arbejde ved French et al. 25, der brugte en 5 sek tærskel at karakterisere proboscis tilbagetrækning adfærd ved Drosophila som reaktion på afskrækkende forbindelser 25. Således har vi defineret en fodring kamp som en kontakt mellem de udvidede snabel og løsningen ikket afbrudt af et fravær af kontakter af 5 sekunder eller mere.
I forhold til saccharose og demineraliseret vand alene, tilføjer kinin til saccharose løsning åbenbart afskrækker fodring af humlebier, da de hurtigt vil bevæge sig væk, hvis de registrerer en afskrækningsmiddel stof (Video Figur 1).
I dette eksperiment de behandlinger har en betydelig indvirkning på den samlede varighed af proboscis kontakter under testfasen (ANOVA på log-transformerede data, F 2,31 = 41, p <0,001). Den samlede varighed af kontakttid med sucrose indeholdende quinin reduceres væsentligt i sammenligning med saccharose alene (p <0,001), men ikke til deioniseret vand alene (p = 0,219) (figur 2). Tilsvarende de behandlinger har en betydelig indvirkning på den samlede varighed af fodring anfald (ANOVA på log-transformerede data, F
c 2 distribution: p = 0,450). Ingen effekt af behandlingerne er fundet på latensen mellem de første antennal kontakter og testopløsningen og de første kontakter snabel (median: 2,67 sek for saccharose; 1,10 sek for saccharose plus kinin; 0,80 sek for deioniseret vand, ANOVA på log-transformerede data, F 2,13 = 0.620, p = 0,550). Hertil kommer, at andelen af humlebier strækker snabel at smage testopløsningen forbliver konstant på tværs af behandlinger (saccharose: 66,7%; saccharose plus kinin: 50,0%; demineraliseret vand: 52,2%; binomial GLM, ændring i afvigelser i forhold til C 2 distribution: p = 0.840). Tilsammen tyder disse resultater på, at antennerne spiller en mindre rolle i påvisning af toksiner i dette assay.
En separat eksperiment undersøger, om det er nødvendigt at teste bier i en tidsperiode længere end 2 min. Mængden af mad forbruges af bier er testet med en M saccharose eller 1 mM kinin i 1 M saccharose løsninger i to betingelser: en 2 min testperiode og en 10 min testperiode. For begge behandlinger, er det samlede forbrug mad ikke afvige for test perioder og forekommer ingen signifikante interaktioner mellem testperioden og behandling (N = 6 - 13, ANOVA på loggen transformerede data, effekt af behandlingerne: F 1,31 = 54,8, p <0,001; virkning af testperioden: F 1,31 = 0, p = 0,979; virkning af interaktionen: F = 0,1, p = 0,457). I sammendrag, en2 min testperioden er tilstrækkelig til at vurdere effekten af løsningen på den samlede mængde fødevarer, der forbruges af humlebier og de negative virkninger af giftige eller frastødende stoffer i denne analyse. Således at måle foderforbrug og analysere spiseadfærd, er det muligt at korrelere samlede fødeindtagelse til den fine struktur fodring under assayet.
Figur 1: latensperioder mellem Proboscis Kontakter under de første 2 min af fodring Assay Density plots af den tid latensperioder adskiller hver snabel kontakt med en M saccharoseopløsning den, den 1 M saccharose + 1 mM kinin og vand.. De kumulative data fra 13, 10 og 11 bier er repræsenteret henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal. </ P>
Figur 2: Proboscis Kontakt Varigheder under Første 2 min af fodring Assay Density plots af snabel kontakt varigheder af humlebier fodring på en M sucrose, 1 M saccharose + 1 mM kinin eller vand.. Prøve størrelse som i figur 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Proboscis aktivitet af Bumblebees fodring på en M Saccharose, 1 M Saccharose + 1 mM kinin eller Vand (A) Den samlede varighed af fodring anfald under testfasen (B) hyppigheden af fodring anfald og (C) hastigheden. af snabel retrækkraft efter første kontakt. Bogstaver angiver en signifikant forskel: behandlinger med forskellige bogstaver angiver P <0,05. Box plots repræsenterer medianen (sorte søjler), den laveste og højeste datapunkter stadig inden 1.5 i interkvartile område (whiskers) og afvigende (cirkler). Prøve størrelse som i figur 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Kinin undertrykker fodring af humlebier (A) scannede billeder af mikrokapillær rør, der viser niveauet for 1 M saccharose eller 1 M sucrose plus 1 mM kinin løsning (angivet med en sort linje) før og efter testfasen henholdsvis. (B) Forbrug af 1 M saccharose, 1 M saccharose plus 1 mM quinin eller deioniseret vand alene af humlebier efter testfasen. Bogstaver angiver en signifikant forskel: behandlinger med forskellige bogstaver angiver P <0,001. Box plots repræsenterer medianen (sorte søjler), den laveste og højeste datapunkter stadig inden 1.5 i interkvartile område (whiskers) og afvigende (cirkler). Prøve størrelse som i figur 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video Figur 1: videooptagelser af Proboscis aktivitet over (A) 1 M sucrose , (B) 1 M sucrose plus 1 mM Kinin og (C)d / 54233 / Video_figure_1C_Water.m4v "target =" _ blank "> demineraliseret vand under testfasen.
Discussion
Med denne hidtil ukendte adfærdsmæssige assay kinin vist at afskrække fremføring af buff-tailed humlebien. Den reducerede snabel kontakttid og fodring Bout frekvens med vand eller saccharoseopløsningen snøret med kinin tolkes her som en afvisning af at indlede yderligere fodring på ikke-ernæringsmæssige eller potentielt giftige løsninger. Når kinin føjes til en M saccharoseopløsning, humlebier ikke kun reducere mængden af løsningen, de forbruger, de også trække snabel hurtigere, og dermed reducere kontakttiden mellem munddele og opløsning, der indeholder et giftstof. Tilsammen antyder disse resultater, at kinin opfattes af smagssansen receptor celler på munddele af humlebien, som allerede tidligere er identificeret i honningbi 9. Kinin er et giftstof for insekter, der inducerer utilpashed-lignende adfærd i honningbien 10 og knockdown i malaria myg (malariamyg) 23. Denne analyse kan meget vel føre til identification af nogle afskrækkende og potentielt giftige forbindelser, der opfattes af smag receptor celler på munddele i humlebier.
Det er afgørende for mikrokapillær røret skal fyldes med en tilstrækkelig volumen af testopløsning til at vare hele testfasen. Det anbefales, at mindst omkring tre fjerdedele af mikrokapillær rør (fx 70-80 pi) er fyldt. Imidlertid bør der drages omsorg for ikke helt at fylde mikrokapillær røret for at reducere risikoen for spild under processen med scanning og fastgørelse af mikrokapillær slangen til eksperimentelle enheder. Man skal også tages, når præsentere mM saccharose dråbe 500 til humlebien, så forsøgslederen undgår utæt dråben i bedriftens røret.
Hullet 4 mm på spidsen af bedriften røret er stort nok til en voksen arbejdstager humlebien til naturligt udvide sine snabel mod testopløsning. Det er dog muligt, athumlebier kan smage løsning med deres antenner, før udvide deres proboscises. Dette kan påvirke sandsynligheden for snabel forlængelse som PER kunne fremkaldes i humlebier ved at stimulere deres antenner med en sukkeropløsning 15. Faktisk antennerne af Hymenoptera ligesom snyltehveps hveps (Trissolcus brochymenae) 24 eller honningbien 13 er udstyret med smag sensilla, der giver dem mulighed for at smage sukker og toksiner som kinin. Derfor kunne de første antennal kontakter med opløsninger, der indeholder meget afskrækkende forbindelser som kinin også reducere motivationen af en humlebi at udvide sine snabel og derfor påvirke den eksperimentelle succesrate. Selv om det ikke kan kontrolleres antennal kontakt med prøveopløsningen, i nærværende undersøgelse vi ikke fandt nogen signifikant effekt af antennal kontakt på snabel forlængelse mod testopløsning. I denne analyse umiddelbart opsætning af mikrokapillær glasset efter præ-testfasen whøne humlebier 'antenner er stadig inden for bedriften røret kan reducere muligheden for humlebier at smage testopløsningen med deres antenner.
Den væsentligste begrænsning af denne analyse opstår, når spore snabel tilbagetrækning væk fra testopløsningen efter den første snabel kontakt ved hjælp af bevægelsessporing video software. Den video-optagelser viser kun 2D bevægelse af snabel, så den givne output af målingen hastighed kan være under eller over forventet. Men med nogle ændringer, kan dette aspekt af assayet forbedres.
Dette assay kan anvendes til at observere naturlige fodring responser mod opløsninger indeholdende forskellige forbindelser herunder naturligt forekommende plante sekundære metabolitter. Observere de umiddelbare fodring reaktioner med denne analyse giver detaljerede oplysninger om, hvordan humlebier opdage disse forbindelser. Dette er en fordel i forhold til eksisterende 'go-no go' metoder som PER 18,19 7, fordi denne metode giver flere adfærdsmæssige respons foranstaltninger, herunder fødeindtagelse under en diskret fodring Bout.
Måling flere parametre tillader samtidig en bedre evaluering af smagen af en forbindelse. For eksempel i vores analyse, undgå humlebier forbrug af vand eller saccharose løsning snøret med kinin. Tilbagetrækning af snabel kan skyldes en ændring i svarene fra de sukker receptor celler 12,13. Vores analyse viser, at humlebier trække snabel hurtigere efter at kontakte saccharose plus kinin løsning end vand alene; Dette kunne tyde på, at kinin påvirker et bestemt sæt af neuroner ud over at hæmme sukker sensing neuroner 9,12,13,25.
Vores analyse kan analysen af den tidsmæssige mønster af adfærdsmæssige reaktioner under fodringen. En lignende protokol, hvor forbruget og antallet af anfald måles har alklar blevet gennemført for at evaluere fodring respons Drosophila til næringsstoffer og ikke-nærende sukkere 26. Vi forudser, at bier vil udvise en mere pålidelig reaktion på fodring stimulanser i vores analyse end i andre metoder såsom PER fordi bierne er fri til at bevæge sig i den bedrift røret 21. Denne teknik vil tillade en udtømmende analyse af tærskelværdier smag for næringsstoffer og giftstoffer til at belyse de mekanismer af fodring i humlebier og potentielt andre biarter.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Leverhulme Trust tilskud (RPG-2012-708) og en BBSRC tilskud (BB / M00709X / 1) til GAW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bumblebee colonies | Koppert Biological Systems | NATUPOL Beehive | |
| Digital microscopic camera | Dino-lite Europe | AM4815ZT | Dino-Lite Edge |
| 100 μl microcapillary tube | Blaubrand IntraEND | 709144 | |
| 15 ml polypropylene centifuge tube | Fisher Scientific | 11849650 | |
| 1 ml disposable plastic luer slip syringe | BD | 300013 | |
| Dell Latitude 3550 laptop | Dell | Check for compatibility with video software | |
| Canon CanoScan LiDE 120 | Canon | Check for compatibility with the computer/laptop | |
| Observer software version 5.0.25 | Noldus | ||
| Kinovea software version 0.8.15 | Kinovea | ||
| silicone tubing | 6 cm length, 1 mm inside Ø & 6 cm length, 4 mm inside Ø | ||
| Male luer x1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Parmer | TW-45518-22 | |
| Female luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Palmer | TW-45508-12 | |
| Steel mesh | 0.5 mm mesh size | ||
| Sucrose (grade II) | Sigma-Aldrich | S5391 | |
| Quinine hydrochloride dihydrate | Sigma-Aldrich | Q1125 | |
| ImageJ software version 1.48 | ImageJ |
References
- Adler, L. S. The ecological significance of toxic nectar. Oikos. 91, 409-420 (2000).
- Hagler, J. R., Buchmann, S. L. Honey bee (Hymenoptera, Apidae) foraging responses to phenolic-rich nectars. J Kansas Entomol Soc. 66, 223-230 (1993).
- Irwin, R. E., Cook, D., Richardson, L. L., Manson, J. S., Gardner, D. R. Secondary compounds in floral rewards of toxic rangeland plants: Impacts on pollinators. J Agr Food Chem. 62, 7335-7344 (2014).
- Praz, C. J., Mueller, A., Dorn, S. Specialized bees fail to develop on non-host pollen: Do plants chemically protect their pollen. Ecology. 89, 795-804 (2008).
- Baker, H. G., Baker, I. Studies of nectar-constitution and pollinator-plant coevolution. Coevolution of animals and plants. Gilbert, L. E., Raven, P. H. , University of Texas Press. 100-140 (1975).
- Stout, J. C., Parnell, J. A. N., Arroyo, J., Crowe, T. P. Pollination ecology and seed production of Rhododendron ponticum in native and exotic habitats. Biodivers Conserv. 15, 755-777 (2006).
- Tiedeken, E. J., Stout, J. C., Stevenson, P. C., Wright, G. A. Bumblebees are not deterred by ecologically relevant concentrations of nectar toxins. J Exp Biol. 217, 1620-1625 (2014).
- Ayestaran, A., Giurfa, M., de Brito Sanchez, M. G. Toxic but drank: Gustatory aversive compounds induce post-ingestional malaise in harnessed honeybees. Plos One. 5, (2010).
- Wright, G. A., et al. Parallel reinforcement pathways for conditioned food aversions in the honeybee. Curr Biol. 20, 2234-2240 (2010).
- Hurst, V., Stevenson, P. C., Wright, G. A. Toxins induce 'malaise' behaviour in the honeybee (Apis mellifera). J Comp Physiol A. 200, 881-890 (2014).
- Whitehead, A. T., Larsen, J. R. Electrophysiological responses of galeal contact chemoreceptors of Apis mellifera to selected sugars and electrolytes. J Insect Physiol. 22, 1609-1616 (1976).
- de Brito Sanchez, M. G., et al. The tarsal taste of honey bees: behavioral and electrophysiological analyses. Front Behav Neurosci. 8, 25 (2014).
- de Brito Sanchez, M. G., Giurfa, M., Mota, T. R. D., Gauthier, M. Electrophysiological and behavioural characterization of gustatory responses to antennal 'bitter' taste in honeybees. European Journal of Neuroscience. 22, 3161-3170 (2005).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J Comp Psychol. 97, 107-119 (1983).
- Laloi, D., et al. Olfactory conditioning of the proboscis extension in bumble bees. Entomol Exp Appl. 90, 123-129 (1999).
- Smith, B. H., Burden, C. M. A proboscis extension response protocol for investigating behavioral plasticity in insects: Application to basic, biomedical, and agricultural Research. J Vis Exp. , (2014).
- Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural Pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J Vis Exp. , (2011).
- Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). Journal of comparative physiology. A, Neuroethology, sensory, neural, and behavioral physiology. 189, 675-684 (2003).
- Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. Sucrose responsiveness and behavioral plasticity in honey bees (Apis mellifera). Apidologie. 35, 133-142 (2004).
- Kessler, S. C., et al. Bees prefer foods containing neonicotinoid pesticides. Nature. 521, 74-76 (2015).
- Mommaerts, V., Wackers, F., Smagghe, G. Assessment of gustatory responses to different sugars in harnessed and free-moving bumblebee workers (Bombus terrestris). Chem Senses. 38, 399-407 (2013).
- Chittka, L., Dyer, A. G., Bock, F., Dornhaus, A. Psychophysics: Bees trade off foraging speed for accuracy. Nature. 424, 388 (2003).
- Kessler, S., González, J., Vlimant, M., Glauser, G., Guerin, P. M. Quinine and artesunate inhibit feeding in the African malaria mosquito Anopheles gambiae: the role of gustatory organs within the mouthparts. Physiol Entomol. 39, 172-182 (2014).
- Iacovone, A., Salerno, G., French, A. S., Conti, E., Marion-Poll, F. Antennal gustatory perception and behavioural responses in Trissolcus brochymenae females. J Insect Physiol. 78, 15-25 (2015).
- French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J. Neurosci. 35, 3990-4004 (2015).
- LeDue, E., Chen, Y. -C., Jung, A. Y., Dahanukar, A., Gordon, M. D. Pharyngeal sense organs drive robust sugar consumption in Drosophila. Nat. Commun. 6, 6667 (2015).
