Abstract
Универсалом опылители , как бафф хвостами шмель, шмель земляной, сталкиваются как питательные вещества и токсины в цветочном нектаре , которую они собирают из цветущих растений. Лишь в нескольких исследованиях были описаны вкусовыми реакции пчел в сторону токсинов в продуктах питания, и эти эксперименты в основном использовали реакцию расширения хоботка на сдержанных медоносных пчел. Вот, новый поведенческий анализ представлен для измерения ответов кормления свободно двигаться, отдельный работник шмелей питательных веществ и токсинов. Этот анализ измеряет количество раствора съеденной каждым шмелей и идентифицирует, как Tastants в продуктах питания влияют на микроструктуру пищевом поведении.
Растворы представлены в микрокапиллярной линии на отдельные шмелей, которые были ранее голодали в течение 2-4 ч. Поведение фиксируется на цифровом видео. Тонкая структура пищевого поведения анализируется непрерывно забив положение ПробоSCIS (ротовые) из видеозаписей с использованием программного обеспечения ведения журнала событий. Положение хобота определяется тремя разными поведенческими категории: (1) хобот продлевается и в контакте с раствором, (2) хобот продлевается, но не в контакте с раствором и (3) хобота уложен под головкой. Кроме того, скорость втягивания хоботка от раствора также оценивается.
В данном тесте объем раствора, потребленный, количество питающих приступами, длительность схваток кормления и скорость хоботной реверс после первого контакта используется для оценки phagostimulatory или сдерживающий активность тестируемых соединений.
Этот новый тест тест позволит исследователям определить, как соединения, найденные в нектаре влияют на пищевое поведение пчел, а также будет полезен для опыления биологов, токсикологов и neuroethologists изучают систему вкуса шмель в.
Introduction
Завод-опылителей взаимодействия являются сложными. Опылители посетить цветы, чтобы получить нектар и пыльцу в пищу; в свою очередь, опылители облегчают половое размножение у растений. В то время как эти отношения в основном мутуалистических, цветочный нектар и пыльца иногда содержат токсины или другие растительные соединения 1-5 которые могут нанести вред опылителей. Экологическое обоснование присутствия таких соединений в нектара и пыльцы не ясно, во всех условиях. Один выдающийся вопрос в этой области, как опылители, такие как пчелы могут обнаружить и избежать цветки нектара, содержащих токсины.
В шмели видов пчел, шмель земляной (Linnaeus, 1758), является универсалом опылителей , который посещает цветы многих видов растений , включая тех , кто производит нектара , содержащего токсины 6. Шмелей было показано , что во избежание потребления растворов , содержащих высокие концентрации токсинов в 24 ч два выбора анализа 7. Этот анализпотребления продуктов питания , описанной Tiedeken и др. 7 показали , что пчелы могут обнаружить горькие соединения в растворах. Тем не менее, этот анализ не смог отличить вкус от пост-ingestive процессов , таких как общее недомогание , которые также могут влиять на пищевое поведение в течение этого интервала времени 8-10.
Пчелы обладают вкусовыми сенсиллы на их усиков, ротовые и лапок для обнаружения соединений 11-13. Расширение хоботок рефлекс (PER) эксперименты включают сдерживая отдельных пчел в жгуте , а затем стимулируя усиков сенсиллы пчелы производить кормление рефлекс 14-17. Пчелы могут быть ограничены в отдельных жгутов и затем стимулировали производить рефлекс кормления как тест их способности вкус соединения 18,19. Другие изменили анализ PER для изучения чувствительности антенны или ротовых токсинов 9,20. Тем не менее, пчелы подвергаются стрессу во время обуздывать. Это может повлиять какони реагируют на соединения 21.
Здесь новый анализ описан для оценки поведенческой реакции вкуса свободно движущихся шмелей сахарозы и хинин, алкалоид , который ранее сообщалось, что сдерживающим фактором 9 и токсичным 10 для медоносных пчел (Apis MELLIFERA) и шмели (Bombus стелющиеся) 7, 22. Хотя хинин не был найден в растительном нектара, этот алкалоид часто используется в качестве аверсивного стимула в поведенческих и физиологических исследований у пчел 7,9,12,13,22. Способ включает видеозапись ротовые шмелей "на большой размер во время первоначального хобота контакта с испытуемыми растворами. В частности, тонкая структура ответа подачи проверяется непрерывно забив поведение над интервалом в 2 мин. Объем раствора потребляются измеряется в течение периода кормления и поэтому количество съеденной пищи может быть соотнесена с микроструктуройПищевое поведение. Кроме того скорость хоботной втягивания измеряется, как показатель активного избегания, и поэтому заранее ingestive обнаружения.
Protocol
1. Захват Пчелы из колонии и голоданием период
Примечание: Эксперименты , описанные здесь , были проведены в Университете Ньюкасла, Великобритания с шмель земляной Audax. Несколько (2-3) коммерчески приобретены колонии были использованы на курс лечения. Колонии были сохранены на скамейке в лабораторных условиях (25 ± 2 ° С и 28 ± 2% RH) в постоянной темноте и кормили мед пчелы собирают пыльцу и растворы сахара вволю.
- Сбор отдельных рабочих шмелей с помощью пластикового флакона (7 см длиной, 2,8 см внутренний диаметр) с перфорированной пластиковой пробкой, после того, как открыли ворота в колонию только достаточно долго для одной пчелы, чтобы выйти и оказаться в ловушке.
- До начала эксперимента, по отдельности голодать все шмелей в течение 2-4 ч в пластиковых флаконах и хранить при комнатной температуре в полной темноте.
2. Перенос Пчелы в холдинг трубы и Habituation Фаза
- После периода голодания, передачи шмель непосредственно из пластикового флакона в накопительную трубку. Удерживающая трубка представляет собой модифицированный 15 мл центрифужные пробирки (длина: 119 мм; диаметр 17 мм), с 4-мм отверстие, просверленное на наконечнике и кусок стальной сетки (основание: 8 мм, высота 30 мм), закрепленный внутри плавлением пластик трубки с рассечения стальной иглой с подогревом.
- Закрепите крепежную трубу, содержащую шмель на держателе полистирола с зубной воск. Закрепить два куска картона с обеих сторон удерживающей трубы. Это, чтобы защитить пчел от зрительных стимулов, которые могли бы помешать с экспериментом.
- Установите цифровой микроскопическую камеру на 5 см выше кончика трубки и удерживающей подключить камеру к совместимому ноутбук.
- Отрегулировать удерживающее трубу таким образом, чтобы по крайней мере, первые 18 мм жала поддерживающа труба находится в пределах видеокадра. До начала эксперимента, начать 3 мин периода привыкания.
3.Предварительное испытание фазы: Представление капля Сахароза
- Подключение шприц к охватывающему адаптер, содержащий капельку раствора сахарозы (~ 3,5 мкл, 500 мМ сахарозы, растворенного в деионизированной воде). Представить сахарозу внутри наконечника трубки холдинг, чтобы мотивировать расширение хоботка.
- Дайте шмель до 5 мин, чтобы потреблять капельку сахарозы. Если капелька не потребляется, удалите шмель из эксперимента.
- Начните запись видео после периода привыкания. В этом исследовании, активность хоботок был записан в 26,7 кадров / сек -1 с увеличением скорости 25X.
4. Тестовая фаза: Представление испытуемый раствор
- Заполните 100 мкл микрокапиллярной трубку с испытуемым раствором. Подключите его к куску силиконовой трубки (длиной 6 см, 1 мм внутренний диаметр) и закрепить его на микро-манипулятором.
- Подключите трубку к другой силиконовой трубки через штырем (6 см длиной, 4 мм внутренний диаметр), бееч действует как пипетка лампочки.
- Поместите микрокапиллярных трубки 5-10 мм от кончика трубки холдинга. Слегка сожмите трубки для поддержания питательного раствора на кончик микрокапиллярной трубки.
- После того, как шмель потребляет капельку сахарозы, немедленно удалите шприц, содержащий раствор 500 мМ сахарозы.
- Начало фазы тест 2 мин, когда шмель в Хоботковых контакты раствора внутри микрокапиллярной трубки.
- Для контроля возможного испарения, заполнить два дополнительных микрокапиллярной трубы с сахарозой или водой и манипулировать ею точно так, как во время фазы тестирования.
- До и после каждого испытания сканирования уровни жидкости внутри микрокапиллярной трубки с помощью сканера на 600 точек на дюйм для измерения количества потребляемой пищи (фиг.4А).
5. Анализ изображений
- Определить объем потребления раствора с использованием ImageJ (версия 1.48), изображение Procэссинга программного обеспечения.
- Загрузить файл изображения и увеличивать или уменьшать масштаб изображения (~ 400%). Для того, чтобы установить базовый масштаб, выберите инструмент прямой линии и провести линию между двумя концами микрокапиллярной трубки. Выберите 'Анализ', затем 'Set Scale'. Ввод общая длина трубы под «Известное расстояние» и соответствующего блока в разделе "Единицы длины".
- Выберите инструмент прямой линии снова и проведите линию между двумя концами уровня жидкости. Выберите "Анализ", затем "Мера". В окне результатов длина жидкости дается в столбце "Длина".
- Рассчитать объем потребления раствора, используя формулу:
где
это длина микрокапиллярной трубки и 
а также
это длина микрокапиллярной трубки и 
а также 6. Видео Анализы
- Оценка поведения кормления во время фазы тестирования 2 мин каждого видео с использованием программного обеспечения ведения журнала событий (см Материалы таблицу).
- Во - первых, определять поведение кормления (т.е. элементов.) В меню поведенческих классов программного обеспечения для записи. Поведение кормления, как следует: (1) хоботок из / контакт: хоботок продолжается и находится в контакте с раствором внутри микрокапиллярной трубки (2) не хоботка из / нет контакта: хоботок расширяется и не находится в контакте с раствором внутри микрокапиллярной трубки, (3) хоботок уложен: хоботок не продлен, но вместо того, чтобы укладываться под головкой и (4) из виду: шмель находится вне видеокадра.
- Установите для каждого поведениякак «государство» и «взаимоисключающие» в меню свойств и сделать непрерывные записи для интервала 2 мин. Повторное воспроизведение видео в режиме замедленного воспроизведения (2 раза медленнее) для большей точности.
- Измерьте скорость хобота отводом от исследуемого раствора после первого контакта между двумя последовательными кадрами (разделенных 37.5 мс в видеозаписях , показанных здесь) с использованием программного обеспечения отслеживания видео движения (См Материалы таблицу).
- Загрузить видео файл и перейдите к кадру, где хобот первые контакты решения.
- Для того, чтобы установить базовый масштаб, выберите инструмент линии и нарисуйте линию по ширине микрокапиллярной трубки в видеокадра. Щелкните правой кнопкой мыши на строке и выберите "Калибруйте меру". Ввод ширины капиллярной трубки и соответствующий блок.
- Выберите 'Image', а затем 'системы координат'. В новом окне нажмите на кончик хоботка и выберите9 Применить ".
- Выберите ручной инструмент перемещения, кликните правой кнопкой мыши на кончик хобота на видеокадра и выберите "Дорожки". Переход к следующему кадру и скорректировать точку отслеживания до кончика хобота.
- Щелкните правой кнопкой мыши на точке отслеживания и выберите "Конфигурация". Выбрать 'Полный путь' и выберите 'Скорость' при измерении. Выберите "Применить". Затем отображается скорость.
Representative Results
Новый анализ используется для проверки ответов скармливания 1 М сахарозы, 1 М раствора сахарозы, плюс 1 мМ хинина и только деионизированной водой. Непосредственные реакции кормления каждой обработки определяются путем количественного определения длительности хоботка контактов с испытуемым раствором, частота схваток подачи и скорости хоботка втягивания от исследуемого раствора после первого контакта во время тестовой фазы 2 мин. Объем раствора, потребленный также измеряется после того, как на стадии испытаний. В данном исследовании мы выбрали критерий бой интервал 5 сек (Рисунок 1 см Дополнительный файл) на основе предыдущей работы французского и др. 25 , которые использовали порог в 5 сек , чтобы охарактеризовать поведение хоботок втягивания путем дрозофилы в ответ на сдерживающий фактор соединения 25. Таким образом, мы определили подающее бой как контакт между выдвинутым хоботком и решения нетт прерванный отсутствие контактов 5 сек или более.
По сравнению с сахарозой и только деионизованной воды, добавляя хинин в раствор сахарозы , очевидно , отпугивает кормление шмелей , как они будут быстро отодвигаться , если они обнаруживают отталкивающее вещество (Видео Рисунок 1).
В этом эксперименте лечение оказывают значительное влияние на совокупной длительности хоботка контактов во время тестовой фазы (ANOVA по данным журнала-трансформированных, F 2,31 = 41, р <0,001). Совокупная продолжительность времени контакта с сахарозой , содержащей хинина значительно снижается по сравнению с сахарозой в покое (р <0,001) , но не к деионизированной воде в одиночку (р = 0,219) (рисунок 2). Кроме того, лечение оказывают значительное влияние на кумулятивной продолжительности кормления приступами (ANOVA на бревне трансформированных данных, F
C 2: р = 0,450). Отсутствие эффекта от лечения не обнаружено на латентности между первым усиков контактами и испытуемый раствор и первых контактов хобота (медиана: 2,67 сек для сахарозы, 1,10 сек сахарозы плюс хинин; 0,80 сек для деионизованной воды, дисперсионный анализ на логарифмирована данные, F 2,13 = 0,620, р = 0,550). Кроме того, процент шмелями, простирающихся хобот по вкусу испытуемый раствор остается постоянным во обработок (сахарозы: 66,7%, сахарозы плюс хинин: 50.0%; деионизованной воды: 52,2%; биномиальное GLM, изменение в девиации по сравнению с распределением C 2: р = 0,840). Вместе эти результаты свидетельствуют о том, что усики играют незначительную роль в обнаружении токсинов в этом анализе.
Отдельный эксперимент проверяет, является ли это необходимо испытать пчел в течение периода времени, большего, чем за 2 мин. Количество пищи, потребляемой пчелами тестируется с 1 М сахарозы или 1 мМ хинина в 1 М растворах сахарозы в двух состояниях: в течение испытательного 2 мин и испытательного периода 10 мин. Для обоих методов лечения, общее потребление пищи не отличается для тестовых периодов , и каких - либо существенных взаимодействий не происходят между периода испытаний и обработки (N = 6 - 13, дисперсионный анализ на бревне преобразованных данных; Влияние лечения: F = 1,31 54,8, р <0,001; влияние испытательного периода: F 1,31 = 0, р = 0,979; эффект взаимодействия: F = 0,1, р = 0,457). В резюме,2 мин испытательный период достаточен, чтобы оценить влияние раствора на общую сумму потребляемой пищи шмелями и сдерживающего воздействия токсичных веществ, отпугивающих или в этом анализе. Таким образом, путем измерения потребления пищи и опробование пищевого поведения, можно соотнести общее потребление пищи в тонкой структуре кормления во время теста.
Рисунок 1: Задержка периоды между хоботком Контакты в течение первых 2 мин после кормления Пробирной плотности участков периодов времени ожидания , отделяющими каждый хоботка контакт с раствором сахарозы в 1 М раствор хинина 1 М сахарозы + 1 мМ и вода.. Совокупные данные из 13, 10 и 11 пчел представлены соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этого рисунка. </ Р>
Рисунок 2: хоботком Контакт Durations в течение первых 2 мин после кормления Пробирной плотности участков хобота контактных длительностей шмелями , питающихся 1 М сахарозы, 1 М сахарозы + 1 мМ хинина или воды.. Размер выборки как показано на рисунке 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Хобот активность шмелей Кормление 1 М сахарозу, 1 М сахарозе + 1 мМ хинин или воды (A) кумулятивная продолжительность кормления приступами во время тестовой фазы (В) частотой кормления приступами и (С) скорости. хобота ретяги после первого контакта. Маркировочного указывает на существенное различие: лечение с различными буквами указывают на р <0,05. Box участки представляют собой медиану (черные полосы), самый низкий и самый высокий точек данных по-прежнему в пределах 1,5 диапазона межквартильного (пунктир) и останцы (кружки). Размер выборки как показано на рисунке 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 4: Хинин подавляет кормления шмелей (А) Отсканированные образы микрокапиллярных трубок , показывающих уровень 1 М сахарозы или 1 М сахарозы плюс 1 мМ раствор хинина (обозначенный черной линией) до и после фазы тестирования соответственно. (В) Потребление 1 М сахарозы, 1 М сахарозы плюс 1 мМ хинин или деионизированная вода в одиночку с помощью шмелей после фазы тестирования. Маркировочного указывает на существенное различие: лечение с различными буквами указывают на р <0,001. Box участки представляют собой медиану (черные полосы), самый низкий и самый высокий точек данных по-прежнему в пределах 1,5 диапазона межквартильного (пунктир) и останцы (кружки). Размер выборки как показано на рисунке 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Видео Рисунок 1: Видео Записи хобота по направлению деятельности (А) 1 М сахарозе , (B) 1 М сахарозу плюс 1 мМ хинин и (С)d / 54233 / Video_figure_1C_Water.m4v "целевых =" _blank "> Деионизированная вода во время фазы испытаний.
Discussion
С помощью этого нового поведенческого анализа, хинин показан для предотвращения подачи положительного эффекта хвостами шмель. Сокращение времени контакта хоботок и частота кормления бой с водой или раствором сахарозы с добавкой хинина интерпретируется здесь как отказ в возбуждении дополнительно питаясь некалорийных или потенциально токсичных растворов. Когда хинин добавляют к 1 М раствора сахарозы, шмели не только уменьшить объем раствора они потребляют, они также втягивания хобот быстрее, тем самым уменьшая время контакта между ротовым и раствором, содержащим токсин. Вместе эти результаты свидетельствуют о том, что хинин воспринимается вкусовыми клетками рецепторов на ротовых шмеля, как уже ранее были определены в медоносной пчелы 9. Хинин является токсин для насекомых , который вызывает недомогание, как поведение в медоносной пчелы 10 и нокдаун в малярийного комара (Anopheles gambiae) 23. Этот анализ также может привести к identificatионов некоторых сдерживающих и потенциально токсичных соединений, которые воспринимаются клетками вкусовых рецепторов на ротовых в шмелей.
Это имеет решающее значение для микрокапиллярных трубки должны быть заполнены с достаточным объемом исследуемого раствора, чтобы продолжаться в течение фазы тестирования. Рекомендуется , чтобы по крайней мере , около трех четвертей микрокапиллярной трубки (например , 70-80 мкл) заполняется. Тем не менее, следует соблюдать осторожность, чтобы не полностью заполнять микрокапиллярной трубку, чтобы уменьшить риск утечки во время процесса сканирования и прикрепления микрокапиллярной трубки к экспериментальной установки. Необходимо также соблюдать осторожность при представлении мМ капельку 500 сахарозы в шмель, так что экспериментатор избегает утечки капельку в удерживающую трубку.
4 мм отверстие на конце удерживающего трубки является достаточно большим для взрослого работника шмель, чтобы естественным образом расширить свой хоботок к испытуемым раствором. Тем не менее, возможно, чтошмели могут попробовать решение с их усиков, прежде чем расширяя их хоботки. Это может повлиять на вероятность расширения хоботка , как PER может быть вызван в шмелей, стимулируя их усики с раствором сахара 15. На самом деле усики перепончатокрылых как паразитоид осы (Trissolcus brochymenae) 24 или медоносной пчелы 13 оборудованы со вкусом сенсиллах, что позволяет им вкус сахара и токсины , как хинин. Следовательно, первоначальные усиковые контакты с растворами, содержащими весьма сдерживающие соединения, как хинин может также уменьшить мотивацию шмеля расширить свой хоботок и, следовательно, влияет на экспериментальную вероятность успеха. Хотя усиков контакт с испытуемым раствором не может контролироваться, в настоящем исследовании мы не обнаружили какого-либо существенного влияния усиков контакта на расширение хобота по направлению к исследуемого раствора. В этом анализе, немедленно настройке микрокапиллярной трубку после предварительного тестирования фазы шкурица усики шмелей "все еще находятся в трубе выдержки может уменьшить возможность для шмелей по вкусу испытуемый раствор с их усиков.
Основным ограничением этого анализа возникает при отслеживании хобота втягивание от исследуемого раствора после первого хобота контакта с помощью отслеживания движения видео программного обеспечения. Видеоматериал отображается только 2D движение хоботка, поэтому данный вывод измерения скорости может быть под или над оценочными. Тем не менее, с некоторыми изменениями, этот аспект анализа может быть улучшено.
Этот анализ может быть использован для наблюдения природные реакции при подаче в направлении растворов, содержащих различные соединения, включая природные встречающимися растительных вторичных метаболитов. Наблюдая за немедленной реакции кормления с помощью этого анализа дает подробную информацию о том, как шмели обнаружить эти соединения. Это является преимуществом по сравнению с существующими "годен-не идти» методы , как PER 18,19 7 , так как этот метод дает несколько поведенческих ответных мер , включая потребление продуктов питания во время кормления дискретного боя.
Измерение нескольких параметров одновременно позволяет лучше оценить вкусовые соединения. Например, в нашем анализе, шмели избегать потребления воды или раствора сахарозы с добавкой хинина. Втягивание хоботка может быть вызвано изменением в ответах клеток сахара рецепторов 12,13. Наш анализ показывает, что шмели втягивания хоботок быстрее после контакта раствора сахарозы плюс хинина, чем только вода; это может предположить , что хинин влияет на определенный набор нейронов в дополнение к ингибирующих нейронов сахара зондирования 9,12,13,25.
Наш анализ позволяет анализ временной картины поведенческих реакций во время кормления. Аналогичный протокол, в котором измеряется время потребления и количество схваток имеет Alготов был реализован с целью оценки реакции кормления дрозофилы нутритивным и некалорийных сахара 26. Мы предполагаем , что пчелы будут демонстрировать более достоверный ответ на стимуляторы питания в нашем анализе , чем при использовании других методов , таких как PER , так как пчелы могут свободно перемещаться в удерживающей трубе 21. Этот метод позволит провести исчерпывающий анализ порогов вкуса для питательных веществ и токсинов, чтобы осветить механизмы кормления в шмелей и других потенциально видов пчел.
Disclosures
Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась за счет гранта Леверулм Trust (RPG-2012-708) и гранта BBSRC (BB / M00709X / 1) с ГСА.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bumblebee colonies | Koppert Biological Systems | NATUPOL Beehive | |
| Digital microscopic camera | Dino-lite Europe | AM4815ZT | Dino-Lite Edge |
| 100 μl microcapillary tube | Blaubrand IntraEND | 709144 | |
| 15 ml polypropylene centifuge tube | Fisher Scientific | 11849650 | |
| 1 ml disposable plastic luer slip syringe | BD | 300013 | |
| Dell Latitude 3550 laptop | Dell | Check for compatibility with video software | |
| Canon CanoScan LiDE 120 | Canon | Check for compatibility with the computer/laptop | |
| Observer software version 5.0.25 | Noldus | ||
| Kinovea software version 0.8.15 | Kinovea | ||
| silicone tubing | 6 cm length, 1 mm inside Ø & 6 cm length, 4 mm inside Ø | ||
| Male luer x1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Parmer | TW-45518-22 | |
| Female luer x 1/16" standard hose barbed polypropylene adapter | Cole-Palmer | TW-45508-12 | |
| Steel mesh | 0.5 mm mesh size | ||
| Sucrose (grade II) | Sigma-Aldrich | S5391 | |
| Quinine hydrochloride dihydrate | Sigma-Aldrich | Q1125 | |
| ImageJ software version 1.48 | ImageJ |
References
- Adler, L. S. The ecological significance of toxic nectar. Oikos. 91, 409-420 (2000).
- Hagler, J. R., Buchmann, S. L. Honey bee (Hymenoptera, Apidae) foraging responses to phenolic-rich nectars. J Kansas Entomol Soc. 66, 223-230 (1993).
- Irwin, R. E., Cook, D., Richardson, L. L., Manson, J. S., Gardner, D. R. Secondary compounds in floral rewards of toxic rangeland plants: Impacts on pollinators. J Agr Food Chem. 62, 7335-7344 (2014).
- Praz, C. J., Mueller, A., Dorn, S. Specialized bees fail to develop on non-host pollen: Do plants chemically protect their pollen. Ecology. 89, 795-804 (2008).
- Baker, H. G., Baker, I. Studies of nectar-constitution and pollinator-plant coevolution. Coevolution of animals and plants. Gilbert, L. E., Raven, P. H. , University of Texas Press. 100-140 (1975).
- Stout, J. C., Parnell, J. A. N., Arroyo, J., Crowe, T. P. Pollination ecology and seed production of Rhododendron ponticum in native and exotic habitats. Biodivers Conserv. 15, 755-777 (2006).
- Tiedeken, E. J., Stout, J. C., Stevenson, P. C., Wright, G. A. Bumblebees are not deterred by ecologically relevant concentrations of nectar toxins. J Exp Biol. 217, 1620-1625 (2014).
- Ayestaran, A., Giurfa, M., de Brito Sanchez, M. G. Toxic but drank: Gustatory aversive compounds induce post-ingestional malaise in harnessed honeybees. Plos One. 5, (2010).
- Wright, G. A., et al. Parallel reinforcement pathways for conditioned food aversions in the honeybee. Curr Biol. 20, 2234-2240 (2010).
- Hurst, V., Stevenson, P. C., Wright, G. A. Toxins induce 'malaise' behaviour in the honeybee (Apis mellifera). J Comp Physiol A. 200, 881-890 (2014).
- Whitehead, A. T., Larsen, J. R. Electrophysiological responses of galeal contact chemoreceptors of Apis mellifera to selected sugars and electrolytes. J Insect Physiol. 22, 1609-1616 (1976).
- de Brito Sanchez, M. G., et al. The tarsal taste of honey bees: behavioral and electrophysiological analyses. Front Behav Neurosci. 8, 25 (2014).
- de Brito Sanchez, M. G., Giurfa, M., Mota, T. R. D., Gauthier, M. Electrophysiological and behavioural characterization of gustatory responses to antennal 'bitter' taste in honeybees. European Journal of Neuroscience. 22, 3161-3170 (2005).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J Comp Psychol. 97, 107-119 (1983).
- Laloi, D., et al. Olfactory conditioning of the proboscis extension in bumble bees. Entomol Exp Appl. 90, 123-129 (1999).
- Smith, B. H., Burden, C. M. A proboscis extension response protocol for investigating behavioral plasticity in insects: Application to basic, biomedical, and agricultural Research. J Vis Exp. , (2014).
- Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural Pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J Vis Exp. , (2011).
- Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). Journal of comparative physiology. A, Neuroethology, sensory, neural, and behavioral physiology. 189, 675-684 (2003).
- Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. Sucrose responsiveness and behavioral plasticity in honey bees (Apis mellifera). Apidologie. 35, 133-142 (2004).
- Kessler, S. C., et al. Bees prefer foods containing neonicotinoid pesticides. Nature. 521, 74-76 (2015).
- Mommaerts, V., Wackers, F., Smagghe, G. Assessment of gustatory responses to different sugars in harnessed and free-moving bumblebee workers (Bombus terrestris). Chem Senses. 38, 399-407 (2013).
- Chittka, L., Dyer, A. G., Bock, F., Dornhaus, A. Psychophysics: Bees trade off foraging speed for accuracy. Nature. 424, 388 (2003).
- Kessler, S., González, J., Vlimant, M., Glauser, G., Guerin, P. M. Quinine and artesunate inhibit feeding in the African malaria mosquito Anopheles gambiae: the role of gustatory organs within the mouthparts. Physiol Entomol. 39, 172-182 (2014).
- Iacovone, A., Salerno, G., French, A. S., Conti, E., Marion-Poll, F. Antennal gustatory perception and behavioural responses in Trissolcus brochymenae females. J Insect Physiol. 78, 15-25 (2015).
- French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J. Neurosci. 35, 3990-4004 (2015).
- LeDue, E., Chen, Y. -C., Jung, A. Y., Dahanukar, A., Gordon, M. D. Pharyngeal sense organs drive robust sugar consumption in Drosophila. Nat. Commun. 6, 6667 (2015).
