Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

AKI 충격적 건강 ^한 결과로 이어질 수있는 신장 기능의 급격한 손실이다. AKI는 더 높은 중요한 치료의 경우 30 % ~ 50 %의 요금과 노인, 그리고 50-70% ^1-3의 사망률로 인해 입원 환자 중 약 20 %의 높은 빈도로 세계적으로 중요한 건강 문제입니다. 불행하게도, AKI의 유병률은 증가하고있다 인한 항생제 등 nephrotoxins에 수술 후 스트레스, 허혈, 노출을 포함 AKI을 유도 할 수있는 요인의 다양성에 부분적으로 향후 10 년간 더욱 확대 할 것으로 예상된다 화학 요법 약물 ^4.

AKI 일반적 필수적인 기능 단위이며, 혈액 필터 및 중앙 포집 관 ^(1)에 소변 배수 세그먼트 세뇨관으로 구성되어 네프론, 발생, 신장 내의 급격한 세포 손상을 포함한다. 경우 네프론의 상당수는AKI 중에 손상, 즉각적인 효과가 죽고 죽어가는 세포 ^1에서 장애물로 인해 네프론을 통해 순환 폐기물 통관의 중단 및 축소 또는 폐지 유체 유동을 포함한다. 시간이 지남에 관 폐쇄가 영구적으로 신장 기능 ^1을 줄여 전체 네프론의 퇴보로 이어질 수 있습니다. AKI 다음과 같은 신장의 생리 학적 변화는 만성 흉터 ^1로 이어질 수 복잡한 염증성 이벤트를 포함한다.

이러한 성과에도 불구하고, 네프론은 관 상피 ^5,6 재구성 AKI 후 재생을 받아야하는 몇 가지 능력을 가지고있다. 네프론 재생의 증가 분자량이 이해되었지만, 메커니즘은 많은 관해서 애매 남아 조사 ^7을 계속 필요로한다. AKI는 영구적 인 신장 손상을 초래하는 정도는 알 수없는 남아 있습니다. 현재의 연구는 신장에 대한 회생 가능성이있다 제안가장 높은 더 두드러 또는 반복 에피소드가 만성 신장 질환 (CKD)으로 이어질하면서, AKI 덜 심한 경우는 다음과 생명을 구하는 이식 또는 투석 ^8,9가 필요 말기 신장 질환 (ESRD) 절정에 달하다. 또한, 이미 CKD으로 고통받는 사람들은 AKI ^8,9의 심각한 에피소드를 계약의 더 높은 위험에 노출됩니다. 함께 찍은, 기초 및 임상 연구, 이해하고 치료하고 AKI을 방지하기 위해 매우 중요합니다 계속이 분명하다.

동물 모델 연구 AKI ⁽¹⁰⁾ 중에 발생하는 지역 및 환경 변화의 진행을 감상하는 수단이되고있다. 이러한 이해를 확장 할뿐만 아니라, 새로운 치료법을 개발하기 위해, 제브라 피쉬 동물 모델은 가지 ^{(11, 12)의} 다양한 사용되어왔다. 제브라 피쉬 신장의 네프론은 배아와 성인 모두에서, 포유류 ^{13 ~ 16과} 보존의 높은 수준을 표시합니다. ZE에서 또한, 네프론 상피 부상brafish는 관 세포의 지방 파괴가 관내 증식과 네프론 구조 ^17-19의 재설정 다음된다 높은 척추 동물에서 프로세스를 닮았다. 배아 그러나, 시스플라틴 같은 nephrotoxins에서 광범위한 세뇨관 손상은 치사 ^{(20, 21)와} 연결되어 있습니다. 이에 비해, 제브라 피쉬 성인 AKI를 생존과 신장에 실질적인 재생 능력을 나타낸다. 예를 들어, 아미노 글리코 시드 계 항생제 겐타 마이신에 노출 된 다음, 제브라은 세뇨관 상피 손상을 재생하고 새로운 네프론 단위뿐만 ^{22-24 성장.} 이 겐타 마이신에 의한 AKI 연구는 다양한 nephrotoxins에서 신장 손상을 이해하는 귀중한 정보를 제공하고 있지만 효과 손상 ^(25)의 다른 유형에 대한 반응을 평가하는 중요한 남아있다.

제브라 피쉬 배아 인해 크기, 투명도, 유전 취급 용이성에, 콩팥 세포 독소 연구를위한 많은 장점이 있습니다 <마이크로 인젝션 ^{(20, 21)의} 방법은 조사를 위해 분자 (들)을 관리하는 데 사용됩니다 SUP> 25. 네프론은 24 시간 게시물 수정 (HPF)에 의해 형성된 약 48 HPF ^{(26, 27)에} 의해 혈액을 필터링하기 시작한다. 따라서, 배아 신장의 신속한 형성 및 함수는 실험적 분석을 용이하게한다. 그러나, 마이크로 인젝션 프로세스 기술적 과제를 가지고 기술 습득에 가파른 학습 곡선이있을 수있다. 이 비디오 문서에서는, 우리는 microinjections을 수행하고 성공적인 주사의 속도를 향상시키기 위해 문제 해결 팁을 제공하는 방법에 대해 설명합니다.

이 프로토콜에 설명 된 제브라 피쉬 배아 작업을위한 절차는 노틀담 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

솔루션 1. 준비

1. RT에서 73.0 g의 NaCl, 3.15 g의 KCl, 9.15 g의 _CaCl2를 증류수 5 L의 9.95 g의 _황산 및 저장을 혼합하여 E3 배아 매체 50X 스톡 용액을 만든다.
2. 제브라 피쉬 배아의 배양를 들어, 다음 매 1 살균제 역할을 1 배 E3의 L, 및 상점에 0.05 % 메틸렌 블루의 200 μl를 추가, 증류수 1X 작업 솔루션 E3 배아 미디어 주식의 50 배 원액을 희석 RT.
3. 0.06 mg을 PTU와 50X E3 재고 40ml를 조합하여 0.003 %, 1- 페닐 -2- 티오 우레아 (PTU)와 E3 배아 매체 색소 블로킹 용액을 만든다. 증류수 2 L의 총 부피를 가져온다.
4. 솔루션에 PTU 분말을 얻을 RT에서 E3 / PTU의 O / N를 저어. 그런 다음에 E3 / PTU를 저장RT.
   E3 / PTU는 약 1 주일의 수명을 가지고 있으며, 이전 솔루션은 제브라 피쉬 애벌레에 색소 침착 개발을 차단 덜 효과​​적 일 것입니다 있습니다.
5. 500㎖의 증류수에 Tricaine 1 g을 첨가하여 0.2 % Tricaine (MS-222)의 마취제 용액을 1 M 트리스, pH가 9.5 7.2 pH를 조정한다.
6. Tricaine 4 ℃에서 추가 0.2 %의 1/10 ^번째 볼륨, 1X E3 (NO 메틸렌 블루)의 용액을 배치하여 촬상하는 2 % 메틸 셀룰로오스 용액을 준비.
   주 : 메틸 셀룰로오스 용액을 부드럽게 현미경 살아있는 배아를 안정화하기 위해 사용되는 두꺼운 투명한 용액이다. 조작이 수행 된 후 배아는 동물의 부상과 같은 시편의 후속 단계에서 현미경을 사용하지 않고 메틸 셀룰로오스를 용해 1 배 E3에서 세척 할 수 있습니다.
7. 4 ° C로 냉각하면 볶음 접시에 적극적으로 1 배 E3 / Tricaine 솔루션을 저어 점차 메틸의 적절한 금액을 추가셀룰로오스 분말을 격렬히 교반하면서 계속. 점차적 메틸 불용성 응집체의 형성을 방지하기 위해 용액에 분말을 추가한다.
8. 모든 분말이 2 % 메틸 셀룰로즈 / E3 / tricaine 용액에 혼합 한 후 39 ° C 냉장실 O / N의 합성 용액을 교반한다.
   참고 : 차가운 온도가 완전히 분말을 용해에 가장 적합합니다. 용액을 하룻밤 후에 명확하지 않으면, 추가적인 업무 시간 및 / 또는 제 O / N 동안 교반한다.
9. 30 분 또는 2 시간까지 4 ° C에서 고속 (12,000 XG)에서 1.5 ml의 튜브와 스핀에 2 % 메틸 셀룰로오스 / E3 / tricaine 솔루션 나누어지는 혼합물로부터 기포를 제거합니다.
10. 장기간 저장을 4 ℃에서 2 % 메틸 셀룰로즈 / E3 / Tricaine 용액을 놓는다.
    참고 : 이전에 사용에 분취 량은 제브라 피쉬 표본 작업을위한 RT에 미리 예열해야합니다.

도구 2. 준비

1. 포에 사용되는 배아의 조작 도구를 준비5 "직선 해부 바늘의 끝 부분에 젤 로딩 팁을 부착하여, 미세 주입을 위해 배아를 sitioning, 테이프 나 순간 접착제로 고정합니다.
2. 먼저 불을 배치하여 바늘 풀러를 사용하여 미세 주사 바늘을 준비 악기에 필라멘트와 10cm의 붕규산 유리를 연마 핸들을 조여 붕규산 유리를 고정합니다.
3. 미세 테이퍼 바늘을 패션 할 붕규산 유리를 잡아 당깁니다. 다음 설정을 사용 : (540)를 가열, (245), 속도 (200), 시간 (125)를 잡아 당깁니다.
4. 모델링 점토의 스트립을 중단 페트리 접시 안에 장소 바늘, 바늘 끝을 보호하고 먼지 축적을 방지하기 위해 덮여 접시를 유지합니다.
5. microinjections 용 바늘을 준비 완료하려면 약 0.05-0.1 mm의 직경을 가진 예리한 각도 분사구를 만들 바늘의 인출 단부를 절단하는 면도날 에지 또는 미세 핀셋을 사용한다.
6. 마이크로 인젝션 트레이를 확인하기 위해, 10에서 1.5 % 아가 로스 / E3 용액을 조제0 ㎖의 삼각 플라스크 후 약 10 분 동안 실온에서 냉각 할 수 있도록 전자 레인지에 종기에 E3를 가열하여 아가 로스를 녹인다.
7. 약 0.5 cm의 깊이 기반을 만드는 페트리 접시로 냉각 아가 / E3 용액을 붓는다. 이 약 0.3 cm의 깊이와 제 2 층을 부어과 조립식 배아 잘 금형을 삽입하고 아가로 오스 실온에서 고화 할 수 응고합니다.
   주 : 기포의 수를 감소시키는 각도로 아가로 주형을 두는 상단 한천 / E3 층에 몰드를 삽입 할 때.
8. 전체 미세 주입 트레이가 설정되면, 조립식 배아 그럼 4 ° C에서 E3 솔루션 및 저장과 접시를 작성, 천천히 그리고 신중하게 scoopula를 사용하여 성형 올립니다.

3. 배아 준비

1. 상대 챔버에 칸막이를 배치하여 제브라 피쉬 상대 탱크를 설정하고 시스템 물을 채우십시오.
2. 디바이더 (S)의 각 측면에 하나의 물고기를 배치UCH는 각 결합 챔버는 한 여성과 한 남성 물고기를 포함하고, 각각의 결합 챔버를 포함하는 것이.
3. 다음날 아침, 산란을 사용할 수 있도록 칸막이를 제거합니다.
4. 후 약 30 분, 그리고 수족관에 성인을 반환 한 후, 미세 와이어 메쉬 스트레이너 도구를 통해 상대 탱크의 물을 통과하여 태아를 수집 물고기를 확인합니다.
5. 페트리 접시 위에 스트레이너를 반전하고 배아를 수집 E3 씻어.
6. 28.5 ° CO / N에서 배아를 품어.
7. 배아는 24 ~ 26 체절 단계 ^(26)에 도달하면, 배아의 각 접시에 50 ㎎ / ㎖ 프로 나제의 100 μl를 추가하고 약 15 RT의 요리 (23 ° C)를 배양하여 dechorionate 다음 E3 미디어의 대부분을 가만히 따르다 분.
   참고 :이 방법 설명 및 28.5 ° C에서 O / N을 배양 수집하는 경우 배아가 24 ~ 26 체절 단계에 도달하는 것은 수정의 시간에서 약 24 ~ 25 시간이 소요됩니다.
8. 와 접시를 채우다음 E3 및 배아에서 chorions을 제거하기 위해 부드럽게 소용돌이 친다.
9. E3 / 프로 나제​​를 가만히 따르다와 신선한 E3 25 ㎖로 접시를 씻어. 반복 세정 단계는 모든 프로 나제​​를 제거합니다.
10. 색소 침착의 개발을 차단하려면 E3를 가만히 따르다 및 배아가 24 시간 게시물 수정에 도달 한 신선한 E3 / PTU 25 ㎖로 교체하십시오.
    참고 : 실험은 며칠에 걸친를 들어, 깨끗한 접시를 유지하기 위해 하루에 한 번씩 신선한 미디어와 함께 E3 / PTU 솔루션을 교체합니다.

콩팥 세포 독소 솔루션 4. 미세 주입

1. 주사 당일, 해당 차량 제어와 함께 원하는 콩팥 세포 독소 용액을 제조 하였다.
2. 소용돌이 또는 약물 (들)을 보장하기 위해 부드럽게 섞어 물 컬럼의 튜브 톱의 측면을 검사 / 솔루션에 있습니다.
   주 : 콩팥 세포 독소 용액은 미세 주입 효율을 감시하고 또한 subseq에서 신장 클리어런스를 평가하기 위해 형광 접합 된 덱스 트란 미량 포함하도록 제조 될 수있다uent 시간은 ^{20,28 포인트.}
3. 바늘의 뒷면에 미세한 젤 로딩 팁을 스레딩에 의해 콩팥 세포 독소의 ~ 2-3 μL와 트림 미세 주사 바늘을 넣고 용액이 중력에 의해 트리밍 바늘 끝을 채울 수 있도록 테이프의 조각 수직으로 바늘을 일시 중지합니다.
4. 바늘 끝이 가득되면, 미세 조작기에로드 된 바늘을 고정합니다.
5. 마이크로 미터 슬라이드에 미네랄 오일 방울을 배치하여 미세 주입 부피를 시험하여 액적 크기를 평가하기 위해 오일에 주입. 500 (PL)의 주입량은 0.1 mm의 직경을 갖는다.
6. 인큐베이터에서 배아의 접시를 제거하고 배아 접시에 약 0.2 % Tricaine 5 ㎖를 추가하여 마취.
7. 전체 마취를 보장하기 위해, 부드럽게 배아 조작 도구의 끝 배아를 터치합니다. 운동 부족은 충분한 마취를 나타냅니다.
8. 성공적인 마취 후, TRANSF으로 사출 금형 배아 전송어 피펫.
9. 트렁크가 우울증 함께 달려 꼬리가 우울증에서 올라 스틱 것을 잘 등의 깊은 영역에 머리를 배치하는 금형의 다른 우물에 각 배아를 기동.
10. 미세 조작기로 채워진 바늘을 삽입하고 배아 옆에 바늘 끝의 위치.
11. 부드럽게 전방으로 조이스틱을 움직여서 꼬리기에 바늘을 삽입하고 미세 주입을 전달하기 위해 풋 페달을 누르기.
    참고 : 성공적인 주입은 액체를 보면서 계측 할 수있다 순환을 입력합니다. 또한, 형광 접합 된 덱스 트란과 nephrotoxicant의 공동 주입 절차 이후 성공적으로 주사를 확인하기 위해 연구를 할 수 있습니다.
12. 조심스럽게 배아에서 바늘을 제거하기 위해 조이스틱을 뒤로 당기십시오.
13. 주입 후, 깨끗한 접시에 배아를 전송하고 Tricaine를 제거하고 신선한 E3 / PTU로 교체하는 린스.
14. 엉덩이에 원하는 시점에 배아 부화원하는대로 실험 분석을 위해 메틸 설치 미디어 또는 과정에서 촬영으로 설명 할 수의 형태.
    주 : 배아 신장 회복은 일반적으로 상처를 나타낸다 부종, 개인의 비율을 결정하기 위해 평가되어야한다.

설정된 미세 주입 스테이션은 실체 현미경, 미세 조작기 및 압력 조절기 (그림 1A)를 포함한다. 분사 플레이트 Transillumination이 절차 (도 1b) 중에 시료를 확인하는 것이 바람직하다. 주사 바늘의 제조 백로드 바늘 끝과 절단 가장자리를 제조 하였다 적절한 붕규산 유리를 당기는 것을 포함한다. 최적으로, 바늘 끝이 절단 과정 동안 (도 1C)와 같은 미세 겸자로 크게 절단기구의 가장자리를 구부려서 만든 컷을 둔보다 경사져 (그림 1D). 이 경 사진 가장자리는 매우 중요하고 매우 부드럽게 제브라 피쉬에 바늘을 삽입 할 수있는 능력에 영향을 미칠 것입니다.

주사 당일, 배아 견고하지만 유연한 배아를 사용하여 배치 된조작 도구 (그림 1E). 주사의 경우, 배아 몸통 후속 주입 단계 (도 1F)에 대한 영향력을 제공하는 사출 트레이의 측면을 따라 휴식되도록, 였는데 하였다. 주입하는 동안, 하나는 바늘 삽입의 혈관 대상을 시각화하고 주입 된 물질이 순환 (그림 1G)를 입력 관찰 배아 몸통 뷰의 평면을 집중해야한다.

제브라 피쉬 배아의 투명도는 마이크로 인젝션 절차를 용이하게하고, 또한 통상적 인 실험 시간 경과 (도 2A) 중에 색소의 개발을 줄이기 위해 24 HPF에서 PTU 화학 처리에 의해 향상 될 수있다. 여기에, 배아 표본이 있었다 다음, 72 HPF 단계를 통해 발전시켰다 중 모의 식염수 차량에 미세 주입, 또는 2.5 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신 (그림 2A)와 미세 주입, 주입.이후 라이브 관찰 실체 현미경 (그림 2B)로 transillumination 조명을 사용하여, 주입 후 일 이틀에 실시 하였다. 모의 또는 식염수 주입 된 배아와 비교 만 젠타 주입 개인은 이전에 발행 된 관찰과 일치 11,20,21 정상적인 신장 기능의 폐기를 제안이 경우 심낭 부종, 부종의 개발 (도 2B)를 보였다.

그림 1. 마이크로 인젝션 장치 및 도구를 제공합니다. 실체 현미경 (왼쪽)과 설정 (A) 사출 역, micromanipulator에 바늘 홀더 (가운데) 및 압력 조절기 (오른쪽). 분사 판 (B) Transillumination. 왼쪽 (C) : 블런트 컷 바늘. 오른쪽 : 경 사진 컷 바늘. (D) F오프라인 집게는 바늘 끝을 절단하는 데 사용. (E) 삽입 사출 금형에 시료를 위치 시키는데 사용될 조작 도구. (F) 배아 마이크로 인젝션 몰드 배열. 스케일 바 = 0.5 mm. 주입을위한 배아에 바늘의 (G) 위치는 다음. 스케일 바 = 0.15 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

제브라 피쉬의 실험 타임 라인 콩팥 세포 독소 그림 2. 실험 타임 라인 및 포스트 분사 부종 분석. (A) 예, 여기 겐타 마이신 연구에 적용. 배아는 dechorionated 및 24 시간 게시물 수정 (HPF)에서 PTU 용액으로 처리 하였다. 이 작다로 나타낸 바와 같이 매일은 PTU 솔루션은 경사와 신선한 매체로 대체녹색 화살표 r에. 모의 주입 또는 하나 식염수 (차량 제어) 또는 겐타 마이신을 주사 : 72 HPF에서 배아는 사출 금형에 전송 한 후 다음과 같이 처리, 마취시켰다. 신선한 미디어에서 배아를 부활 후, 배아는 분석과 이미지 수집을위한 1, 2 일 후 주입 (각각 96, 1​​20 HPF)에서 관찰되었다. (B) 위 : uninjected 제브라 피쉬 배아. 중동 : 식염수 72 HPF에서 주입 된 배아. 아래 : 배아는 2.5 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신 주사. 스케일 바 = 0.5 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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