Introduction
Epilepsie is een veel voorkomende neurologische aandoening waarbij recurrente aanvallen optreden gedurende de levensduur van een patiënt. De meeste epileptische recidieven kunnen worden goed gecontroleerd door anti-epileptica (AEDs). Echter ongeveer 30% van epileptische patiënten ontwikkelen refractaire epilepsie 1. Epilepsie oorzaken slaapstoornissen, die verder herhaling kan verergeren. Het bewijs toont aan dat epilepsie kunnen ofwel de slaap verstoren 's nachts of kan overmatige slaperigheid overdag 2,3 veroorzaken. Onze vorige studies verder aan dat epilepsie die zich op zeitgeber tijd (ZT) 0, dat wil zeggen, het begin van de lichte periode in het licht: donker cyclus, vermindert de slaap; dit wordt gemedieerd door corticotropine releasing hormoon (CRH), een homeostatische factor. Epilepsie bij ZT13 (het begin van de donkere periode) verhoogt de expressie van een homeostatische factor, interleukine-1 (IL-1), die slaap toeneemt. Slaap circadiane ritmes worden gewijzigd wanneer epilepsie optreedt bij ZT6, het midden van delicht periode 4,5. Aan de andere kant, slaapproblemen verder verergeren de progressie en de herhaling van epilepsie 6. Op basis van de eerder genoemde bewijs, proberen we een optimale therapeutische methode om tegelijkertijd epilepsie te controleren en te voorkomen dat slaapstoornissen bij patiënten met epilepsie te onthullen. We hebben eerder gevonden dat elektro (EA) met een 10-Hz stimulatiefrequentie, waarbij een bepaalde hoeveelheid stroom in de acupunt wordt geleverd via een roestvrij-stalen naald, succesvol onderdrukt electrocorticogram (ECoG) epileptische activiteiten en epilepsie geïnduceerde slaapstoornissen 7 . EA met een 100-Hz stimulatie frequentie verder verslechtert epileptische activiteiten en slaapstoornissen bij ratten 8,9. Deze succesvolle experiment afhankelijk van drie factoren: ten eerste, een haalbare epileptische diermodel; ten tweede een werkwijze voor slapen registratie en analyse bij knaagdieren; en ten derde, de nauwkeurige prestaties van acupunctuur en de nauwkeurigheid van de acupoint locations.
Epilepsie is onderverdeeld in twee belangrijke types: focale epilepsie en gegeneraliseerde epilepsie. Wij zijn geïnteresseerd in focale temporaalkwab epilepsie (TLE), gegeneraliseerde epilepsie, status epilepticus (SE), en de terugkeer van spontane gegeneraliseerde epilepsie. Daarom worden verschillende manipulaties toegepast op geschikte epileptische modellen te maken voor onze experimenten. Focale TLE stellen, wordt een lage dosis van pilocarpine toegediend in de linker centrale kern van de amygdala (CEA). Om dit model te verifiëren, worden zes ECoG geïmplanteerde elektroden op de frontale (F1 en F2), pariëtale (P1 en P2) en occipitale (O1 en O2) kwabben in zowel de linker en rechter hemisferen, en nog eens twee referentie-elektroden (R1 & R2) worden over het cerebellum in beide hemisferen. Een extra microinjectie geleidingscanule wordt chirurgisch geïmplanteerd in de linker cea (AP, 2,8 mm vanaf bregma, ML, 4,2 mm, DV, 7,8 mm ten opzichte van bregma). De coördinaten zijn afgeleid van de Paxinos en Watson rat atlas 10. Indien het brandpunt TLE succesvol is geïnduceerd, alleen de opname van de elektrode links pariëtale cortex (P1), dat vlak bij de linker CEA, dient de dominante epileptiform ECoGs verkrijgen, zonder significante epileptische ECoGs opgenomen vanaf de andere ECoG elektroden. Intraperitoneale (IP) injectie van pilocarpine in ratten induceren gegeneraliseerde epilepsie en SE, maar dit kan fataal zijn. Vijf IP injecties van pentyleentetrazool (PTZ) met een eendaagse interval tussen elke injectie met succes spontane gegeneraliseerde epilepsie veroorzaken bij muizen en ook zorgen voor de overleving van de muizen. Tweedraads ECoG elektroden worden geïmplanteerd in de frontale en pariëtale cortex in de muizen ECoG signalen en spontaan terugkerende epilepsie te controleren.
Polysomnografie (PSG) is een uitgebreide methode om fysiologische veranderingen die optreden tijdens de slaap nemen, en het objectief classificeren slaap in verschillende stadia van niet-snelle oogbeweging (NREM) en rAPID eye movement (REM) slaap. PSG registreert parameters van lichaamsfuncties, met inbegrip van hersengolven (elektro-encefalogram, EEG), oogbewegingen (elektro-, EOG), skeletspier tonen (electromyogram, EMG), hart ritmes (elektrocardiogram, ECG), en het bloed zuurstof en respiratoire parameters. Bij ratten, we ECoGs, EMGs, corticale temperatuur en bewegingsactiviteit opnemen waakzaamheid staten te delen in waken, NREM slaap en REM-slaap. Sleep-analyse bij muizen wordt uitgevoerd met behulp van ECoGs, EMG en bewegingsactiviteit resultaten. Ratten worden chirurgisch geïmplanteerd met drie ECoG schroef elektroden in de frontale, pariëtale en contralaterale cerebellaire cortex door stereotaxische chirurgie. Post-acquisitie bepaling van de waakzaamheid staten (waken, NREM slaap en REM-slaap) wordt uitgevoerd op basis van de ervaringen bij de ECoGs, EMG, hersenen temperatuur en bewegingsactiviteit parameters. Gedetailleerde criteria voor het categoriseren gedrag van het dier in zowel ratten als muizen beschreven in tHij protocol.
Zowel ratten als muizen moeten worden verdoofd met een lage dosis zoletil (25 mg / kg) die de helft van de dosis van anesthesie gewoonlijk toegediend tijdens stereotaxische chirurgie, alvorens manuele acupunctuur of EA. Deze dosering mogelijk maken de dieren wakker worden 30 tot 35 minuten na de injectie. Handmatige acupunctuur of EA wordt uitgevoerd bij het begin van de donkere periode, met een constante tijdsduur van 30 min, en elk dier achtereenvolgens behandeld gedurende twee tot drie dagen. EA stimulerende stromen worden afgeleverd in een bepaalde acupoint met een roestvrij stalen naald die in de acupunt wordt geplaatst. De stimulusstroomniveaus een trein van tweefasige rechthoekige pulsen, waarbij de pulsduur 150 ms en de stimulatie-intensiteit 1 mA. Als een droge naald wordt gebruikt voor het handmatig acupunctuur, wordt de naald ingebracht in de acupunctuurpunten 10 keer om de 5 min trok. Het moeilijkste deel van de handleiding acupunctuur of EA is om de acupunctuurpunten lokaliseren bij knaagdieren. de locatie van acupunten bij ratten of muizen is vergelijkbaar met de anatomische locatie bij de mens. Zo worden de bilaterale Fengchi acupunctuurpunten op 3 mm afstand van de achterste middellijn van de hals, tussen de twee oren, die vergelijkbaar is met de anatomische locatie bij de mens 11. Verder kan de acupunten met lage impedantie op de huid verder worden bevestigd. Sham acupunctuur of schijnvertoning EA manipulatie is nodig voor acupunctuur of EA experimenten. Sham acupunctuur of sham EA moet worden uitgevoerd bij een niet-acupoint dicht bij de acupoint, zoals in de buurt van de oksel 12.
Om de effecten van acupunctuur of EA over epilepsie en epilepsie veroorzaakte slaapstoornissen succes te onderzoeken, moeten de volgende factoren worden in de plaats: een haalbare epileptische diermodel, de precieze analyse van epileptische ECoGs en de herhaling van epilepsie, een methode om waakzaamheid staten classificeren en de nauwkeurige prestaties van acupunctuur of EA bij knaagdieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele protocollen worden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de National Taiwan University.
1. Stereotaxische Chirurgie voor het implanteren van ECoG Elektroden, EMG elektroden, Brain Thermistor en Injection gids canule
- Voor ratten (250-350 g, 6 tot 8 weken oude Sprague-Dawley ratten)
- Verdoven de ratten door IP-injectie met 50 mg / kg zoletil. Controleer of de juiste diepte van de anesthesie door het observeren van een gebrek aan respons na het afklemmen van de achterpoot. Solliciteer oogzalf, scheren de vacht, en steriliseer de huid met povidon-jodium-oplossing en 75% ethanol. Injecteer antibiotica (penicilline G) om infectie te voorkomen.
- Bereid scalpels, scharen, hemostats, gazen en cautery machine voor een operatie. Steriliseren chirurgische gear en gazen door een autoclaaf en de cautery met 75% ethanol.
- Plaats een oor bar in de gehoorgang en monteer de rat naar de Stereotaxis.
- gebruikeen scalpel, maken een ongeveer 2 cm middellijn incisie op de schedel langs een lijn tussen twee de oren, bewegende caudaal. Klem de huid flappen met hemostats aan de schedel bloot te leggen en het weefsel te verwijderen over de schedel met behulp van een scalpel.
- Boor acht gaten (F1, F2, P1, P2, O1, O2, R1 en R2), elk ongeveer 0,7 mm in diameter, op de schedel met een draaiend werktuig. Schroef acht ECoG elektroden op de frontale, pariëtale en occipitale lobben en cerebellum in zowel de linker en rechter hemisferen. Deze elektroden worden gebruikt voor focale epilepsie detectie.
- Gebruik de volgende coördinaten voor de opname elektroden: frontale (F1 en F2): 2,0 mm anterior tot bregma en 2,5 mm van de middellijn, pariëtale (P1 en P2): -2,0 mm anterior tot bregma en 3,0 mm van de middellijn en occipitale (O1 en O2): -5,5 mm anterior tot bregma en 3,0 mm van de middellijn.
- Plaats twee referentie-elektroden (R1 en R2) over de kleine hersenen (-11,0 mm anterior tot bregma en 4,0 mm van de midline).
- In een afzonderlijke groepen ratten, boor drie gaten en plaats twee schroeven EEG-elektroden via rechter frontale (F2) en pariëtale lobben (P2) van de cortex met dezelfde coördinaten als beschreven in stap 1.1.5.1. Plaats een derde EEG electrode via links cerebellum (R1), die dient om het dier grond en vermindert signaalartefacten. Deze elektroden worden gebruikt voor het bevestigen gegeneraliseerde epilepsie en analyseren waakzaamheid fasen.
- Scheid de hals huid en spieren en plaats twee EMG elektroden in de nek spieren.
- Boor een gat in de schedel en plaats een microinjectie geleidingscanule in het linker cea (AP, 2,8 mm vanaf bregma, ML, 4,2 mm, DV, 7,8 mm ten opzichte van bregma) bij ratten. De coördinaten zijn afgeleid van de Paxinos en Watson atlas 10 ratten.
- Boor een groter gat (met een diameter van 1,6 mm) op de schedel en plaats een gekalibreerde 30 kV thermistor op het oppervlak van de pariëtale cortex, die later zal worden gecementeerd, Monitor corticale temperatuur van ratten.
- Gebruik gaas en cautery te stoppen met bloeden wanneer het zich voordoet.
- Route de geïsoleerde draden van de ECoG elektroden en EMG elektroden op een voetstuk en sluit de thermistor aan de ketting. Cement het voetstuk en begeleiden canule aan de schedel met tandheelkundige acryl.
- Behandel de incisie plaatselijk met polysporin (zinkbacitracine / polymyxine B sulfaat) om infectie te voorkomen. Geven de dieren zowel ibuprofen en penicilline G in water gedurende één week na de operatie.
- Voor muizen (20-30 g, 6 tot 8 weken oude C57BL / C-muizen)
- Verdoven de muizen door IP-injectie met 50 mg / kg zoletil en bevestigen juiste diepte van anesthesie door het observeren van een gebrek aan respons na afklemmen van de achterpoot. Solliciteer oogzalf. Na scheren steriliseren de huid met povidon-jodiumoplossing en 75% ethanol. Injecteer antibiotica (penicilline G) om infectie te voorkomen.
- Plaats een oor bar in de gehoorgang enmonteer de muis om de Stereotaxis.
- Met behulp van een scalpel, maak dan een geschatte 1,5 cm middellijn incisie op de schedel langs een lijn tussen de twee oren, bewegende caudaal. Klem de huid flappen met hemostats aan de schedel bloot te leggen en het weefsel te verwijderen over de schedel met een scalpel.
- Poke twee gaten in de schedel met chirurgische schaar en plaats twee draad ECoG elektroden op de rechter frontale kwab (F2: 2,0 mm tot bregma en 1,5 aan de middellijn) en de linker pariëtale kwab (P1: -3,0 mm tot bregma en -2,5 mm aan de middellijn).
- Scheid de hals huid en spieren en plaats twee EMG elektroden in de nek spieren.
- Sluit de geïsoleerde draden van de draad ECoG elektroden en EMG elektroden op de vrouwelijke klemmen en een 2,54-mm-aansluiting, en vervolgens cement aan de schedel met tandheelkundige acryl.
- Behandel de incisie plaatselijk met polysporin (zinkbacitracine / polymyxine B sulfaat) om infectie te voorkomen. Geef de dieren zowel ibuprofen en penicilline G in het water voor een week na de operatie.
- Laat alle dieren voorafgaand herstellen gedurende zeven dagen om de inleiding van de experimenten.
- Huis ratten of muizen afzonderlijk in individuele opname kooien in de geïsoleerde ruimte waar de temperatuur op 23 ± 1 ° C en de licht: donker (L: D) ritme wordt geregeld in een 12: 12-h cyclus (40 W x 4 tubes verlichting). Zorg voor voedsel en water ad libitum.
- Sluit de ECoG, EMG en thermistor via een tuier aan de versterkers één week na de operatie om de opnames te starten.
2. Vaststelling van Focal TLE Epilepsie, SE, en Spontaan Recurrent Epilepsie
- voor ratten
- Dien 0,5 gl pilocarpine (2,4 mg / ul) in de linker CEA door de injectiepoort geleidingscanule met een micro-injectie pomp. De injectie tarief moet worden vastgesteld op 0,2 pl / min tot focale TLE induceren.
- IP injecteren 300 mg / kg pilocarpine veralgemeende epi inducerenlepsy met terugkerende SE.
- voor muizen
- IP toedienen PTZ (0,035 mg / muis g lichaamsgewicht) op een bepaald punt ZT om de dag. Vijf opeenvolgende injecties zal de ontwikkeling van spontaan en herhaaldelijk gegeneraliseerde epilepsie veroorzaken.
- Voor zowel ratten als muizen
- ECoG versterken de signalen 5000 en filteren analoge banddoorlaat- tussen 0,1 en 40 Hz.
- Gebruik een A / D-omvormende boord om de analoge ECoGs signalen naar digitale signalen met een 128-Hz sampling rate.
- Een software van visuele scoring en analyseren het begin en de duur van epilepsie. Meet de tijdschaal om de duur te vertegenwoordigen.
- Definieer ECoG epilepsie door het optreden van epileptische pieken met amplitudes groter dan 2 mV en duur van meer dan 30 s 13.
3. Classificatie van Waakzaamheid Staten
- voor ratten
- Bepaal de waakzaamheid staten met behulp van de parameters overgenomen van ECoGs, EMG, hersenen temperaturen, en motoriek binnen een 12-s episode van de opname. Sluit de ECoG, EMG, en thermistor door middel van een ketting om de versterkers een week na de operatie om de opname te starten. De score van de landen met een op maat gemaakte software volgens stappen 3.1.5 - 3.1.7.
- Meet vrijer kunnen bewegen met behulp van een infrarood bewegingsmelder, de integratie van de signalen elke 1 s, en de signalen op te slaan.
- Meet corticale temperatuur en de signalen op te slaan.
- Classificeren waakzaamheid staten volgens onze eerder gedefinieerde criteria 14.
- Score wakker met de volgende kenmerken: kleine amplitude ECoGs met hoge frequentiespectra hogere delta kracht (0,5-4,0 Hz) en lagere theta kracht (6,0-9,0 Hz); dominant bewegingsactiviteit; hoge EMG-activiteit; geleidelijk verhoogd corticale temperatuur.
- Score NREM slaap met behulp van de following kenmerken: delta-wave dominant ECoGs met grote amplitudes, daalde EMG-activiteit, verminderde corticale temperatuur, en geen bewegingsactiviteit.
- Score REM-slaap met behulp van de volgende kenmerken: verminderde amplitude van ECoGs met de dominante theta frequentie, plotseling verhoogde corticale temperatuur, minimaal EMG-activiteit en lage bewegingsactiviteit met het lichaam samentrekkingen.
- voor muizen
- Herhaal de indeling van waakzaamheid staten in de muizen uitgevoerd in de ratten, behalve dat er geen corticale temperatuur opgenomen van de thermistor.
4. Prestaties van Manual Acupunctuur en EA in Ratten
- De rat wordt verdoofd voor de EA-protocol.
- Zoek de acupoint door anatomie en bevestig lage huid impedantie op de acupoint. Het lampje knippert wanneer detecteert de lage impedantie huid. Opmerking: Fengchi acupoints bevinden zich 3 mm afstand van de achterste mediaan lijnsen de twee oren, de nek.
- Plaats roestvrijstalen naalden in de acupunctuurpunten op een diepte van 2 mm.
- Twitch de ingebrachte naalden 10 keer om de 5 min.
- Met behulp van een functionele elektrische stimulator leveren een trein van tweefasige pulsen (150-ps tijdsduur elk) met een intensiteit van 1 mA tot de acupunten door de naald.
- Voer een schijnvertoning acupunctuur of sham EA als een controle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er zijn verschillende rat en muismodellen de behoeften van verschillende soorten epilepsie voldoen. Focale TLE induceren, 0,5 gl pilocarpine (2,4 mg / gl) wordt toegediend in de linker cea. De overheersende epileptische ECoGs worden verkregen uit de ECoG elektrode op de parietale kwab van de linker hemisfeer (Figuur 1A: b) en zeldzame epileptische activiteiten worden opgehaald van de rest van de ECoG elektroden (Figuur 1A: a, c, d, e en f) wanneer de pilocarpine wordt toegediend. Epileptiforme ECoGs zijn voornamelijk opgenomen onmiddellijk na pilocarpine toediening. Deze resultaten worden overgenomen uit 8. Deze resultaten geven een succesvolle inductie van focale TLE bij ratten na directe injectie van een lage dosis pilocarpine in de CEA.
Binnen 5 min, het IP-inprojectie van 300 mg / kg pilocarpine induceert ernstig cholinergisch effecten op het gedrag, zoals pilo-erectie, speekselvloed, rode ogen, rillingen, en gezicht automatismen. De ernst van deze behavioral tekenen geleidelijk toe tot een ECOG gegeneraliseerde aanval optreedt (Figuur 1B, blauwe doos). SE komt ook naar aanleiding van de gegeneraliseerde epilepsie (Figuur 1B, rode doos). Deze resultaten zijn overgenomen uit 13. Onze resultaten suggereren dat een IP injectie van 300 mg / kg pilocarpine is een betrouwbare methode voor ECoG gedocumenteerde gegeneraliseerde epilepsie en SE induceren. Echter, de overlevingskans na SE ontwikkeling is tussen de 15% en 20%. De PTZ aanmaakhout model van epilepsie bij muizen wordt gebruikt om spontaan en herhaaldelijk gegeneraliseerde epilepsie ontwikkelen. PTZ in een dosis van 0,035 mg / g lichaamsgewicht muis IP geïnjecteerd op een bepaald punt ZT (bijvoorbeeld, het begin van de donkere periode, ZT13) wordt om de andere dag, en elke injectie een dag interval. Er zijn geen epileptischeECoGs gevonden tijdens de donkere periode na de 1e injectie van PTZ (figuur 1C: a) of tijdens de volgende donkere periode, wanneer het een rotdag voor injectie (figuur 1C: b). Geen significante epileptische activiteit gevonden na de 2 e, 3 e en 4 e injecties (data hier niet getoond). Echter, epileptische ECoGs geïnduceerd na de 5e PTZ injectie (Figuur 1C: c en d), samen met spontaan en herhaaldelijk gegeneraliseerde epilepsie (Figuur 1C: e en a ').
We ingedeeld waakzaamheid staten in waken, NREM slaap en REM-slaap op basis van de criteria die we in het protocol genoemd. Waakzaamheid is visueel gescoord door gedesynchroniseerd ECoGs met een lage amplitude en een hoge frequentie. De vermogensdichtheid waarden in de delta frequentieband (0,5-4 Hz) in het algemeen groter dan inde theta frequentie band (6-9 Hz) tijdens het wakker zijn, en nog veel meer hoge frequentie spectra (> 10 Hz) worden gevonden. Waakzaamheid vertoont een hoge amplitude van EMG en veel bewegingsactiviteit. Bovendien corticale temperatuur geleidelijk toeneemt wanneer de waakzaamheid staat doorvoer van beide NREM slaap of REM-slaap te waken (figuur 2). NREM slaap wordt gekenmerkt door gesynchroniseerd ECoGs met een hoge amplitude en lage frequentie. De vermogensdichtheid waarden dominant in de delta frequentieband. De EMG amplitude geleidelijk af, en er geen bewegingsactiviteit wordt vertoond tijdens NREM slaap. Corticale temperatuur daalt als de waakzaamheid staat doorvoer van wakker in NREM-slaap (figuur 2). Tijdens de REM-slaap, wordt de ECoG golf gedesynchroniseerd, de amplitude wordt verminderd, de overheersende EEG vermogensdichtheid plaatsvindt binnen de theta frequentie (6,0-9,0 Hz), is EMG activiteit van de laagste, driefase lichaam twitch wordt waargenomen, en corticale temperatuur neemt snel toe(Figuur 2).
We aangetoond dat verschillende oorzaken van EA op epileptische activiteit wanneer EA stimuleert de Fengchi acupunten met ofwel een hoogfrequente stimulatie (100 Hz) of een laagfrequente stimulatie (10 Hz). In figuur 3A, een micro-injectie van 0,5 gl pilocarpine (2,4 mg / ul) in de linker CEA induceert focal TLE, zoals eerder (B) genoemd. Echter, 100-Hz EA bilaterale Fengchi acupoints verergert de pilocarpine-geïnduceerde epileptische ECoGs (C). Deze resultaten zijn afgeleid 8. In contrast, 10 Hz EA bilaterale Fengchi onderdrukt de pilocarpine-geïnduceerde epileptische ECoGs (Figuur 3B: C). Deze resultaten zijn afgeleid 7. Toediening van pilocarpine in de linker CEA onderdrukt ook NREM slaap tijdens het licht periode van de 12-uur licht: donker cyclus (Figuur 4A en 4B). De vermindering van NREM slaap tijdens afew uren van de donkere periode vooral onder invloed van anesthesie, en geen direct effect van EA 15. Toepassing van de 100-Hz EA verder verslechtert de pilocarpine-geïnduceerde onderdrukking van de NREM-slaap (Figuur 4A). In contrast, een 10-Hz EA bilaterale Fengchi acupoints verhoogt NREM slaap per se tijdens de donkere periode en blokkeert de pilocarpine-geïnduceerde reductie van NREM slaap tijdens het licht periode (Figuur 4B). Deze resultaten worden overgenomen uit 9.
Figuur 1: Verschillende modellen voor epilepsie bij ratten en muizen. A toont de focale TLE bij ratten. B belicht de gegeneraliseerde epilepsie met SE bij ratten. C geeft het spontane en terugkerende epileptische ECoGs. (A) (a), (b), (c), (d), (e) en (f) vertegenwoordigt de ECoG signalen opgenomen van de elektroden geplaatst op de linker frontale, pariëtale links, links achterhoofd, rechter frontale, rechts pariëtale en rechts occipital cortex, respectievelijk. (B) De pijl geeft de IP injectie van pilocarpine. De grijze doos (a) toont de basislijn ECoGs verkregen vóór de pilocarpine injectie. De blauwe doos toont de epileptische ECoGs van gegeneraliseerde epilepsie. De rode doos (b) vertegenwoordigt de SE. De ECoG signalen gewonnen uit (a) en (b) getoond in (a) en (b). (C) (a) representeert de ECoGs verkregen na 1 PTZ injectie en (b) vertegenwoordigt de ECoGs opgenomen de dag na 1 PTZ injectie in muizen. Epileptische activiteiten plaatsvinden na de 5e PTZ injectie (c) en daarna. De terugkerende epileptische ECoGs die de dag na 5 th PTZ injectie optreden getoond in (d). De terugkerende epileptische ECoGs geregistreerd 5 dagen na de 5 e PTZ injectie worden getoond in (e) . Het getal aan de onderzijde (a) representeert de ECoGs geëxtraheerd uit de rode doos. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Classificatie van Waakzaamheid staten: Waakzaamheid, NREM slaap en REM-slaap. De waakzaamheid staten van ratten worden ingedeeld door de parameters van het ECoGs, ECoG spectra, EMGs, bewegingsactiviteit en corticale temperatuur. De waakzaamheid toestanden van muizen worden gekenmerkt door dezelfde parameters, behalve corticale temperatuur is niet van toepassing.
Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Pbelasting / 54896 / 54896fig3.jpg "/>
Figuur 3: De gevolgen van de 100-Hz en 10 Hz EA op epilepsie. In (A), de eerste ECoG trace toont de basislijn ECoGs (a). Micro-injectie van pilocarpine in de linker CEA induceert focal TLE (b). Toepassing van de 100-Hz EA op bilateraal Fengchi acupoints verergert de epileptische ECoGs (c). In (B), de eerste ECoG trace toont de basislijn ECoGs (a). De micro-injectie van pilocarpine in de linker CEA induceert focal TLE (b). De toepassing van 10-Hz EA bilateraal Fengchi acupunten onderdrukt de epileptische ECoGs (c). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De effecten van 100 Hz en 10 Hz EA op Epi-Lepsy geïnduceerde slaapstoornissen. (A) Focal TLE geïnduceerd door de micro-injectie van pilocarpine in de linker CEA vermindert NREM slaap tijdens het licht periode. 100-Hz EA verder verslechtert de epilepsie veroorzaakte slaapverstoring. (B) De toepassing van de 10-Hz EA blokkeert de epilepsie-geïnduceerde reductie van NREM slaap tijdens het licht periode. Bovendien, 10-Hz EA verhoogt NREM slaap tijdens de donkere periode. Waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. De zwarte cirkel staat voor de waarden die voor de micro-injectie van pilocarpine, de open cirkel geeft de verkregen is na de pilocarpine injectie data, en de open driehoek toont de waarden verkregen na EA stimuli. De zwarte balk geeft de donkere periode van de 12-uur licht: donker cyclus, en de witte balk toont het licht periode. * Duidt op het statistisch verschil tussen de 100 Hz-EA + pilocarpine en de controlegroep (ANOVA, p <0,05) en # geeft de statistische difference tussen de 10 Hz-EA pilocarpine + groep en de groep pilocarpine (ANOVA, p <0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het kiezen van een haalbare epilepsie diermodel is essentieel voor elke experimentele doeleinden. Een van onze doelen is om de effecten van EA voor epilepsie onderdrukking helderen. EA is een alternatieve geneeskunde die therapeutisch effect bij epilepsie kunnen vertonen en is gedocumenteerd in de oude Chinese literatuur. Echter, er is een gebrek aan wetenschappelijk bewijs om het te bewijzen. Om de effecten van EA op epilepsie te bepalen, we vooral gericht op de effecten van EA op mild focale epilepsie, in plaats van op een ernstige gegeneraliseerde inbeslagneming of SE. Onze eerdere studie gebruikte een focale TLE model in ratten om de effecten van laagfrequent (10 Hz) en hoge-frequentie (100 Hz) EA bilaterale Fengchi acupunctuurpunten op pilocarpine-geïnduceerde focale TLE en focal-TLE geïnduceerde slaapstoornissen 7- tonen 9. Onze resultaten suggereren dat de 10-Hz EA bilaterale Fengchi acupoints onderdrukt focal TLE en verstoring van de slaap, terwijl 100 Hz EA verergert zowel focale TLE en TLE-geïnduceerde slaapstoornissen. Een ander voorbeeld is to tonen de effecten van diepe hersenstimulatie bij refractaire epilepsie, in het bijzonder gegeneraliseerde inbeslagneming en SE. We hebben vastgesteld dat eenzijdige diepe hersenstimulatie van de voorste nucleus van de thalamus (ANT) met hoge frequentie en lage intensiteit stromen succes de herhaling van gegeneraliseerde epilepsie en de duur van SE 13 remt. We hebben ook spontaan ontwikkeld en herhaaldelijk gegeneraliseerde epilepsie met behulp van de PTZ aanmaakhout methode bij muizen. Dit PTZ aanmaakhout model op grote schaal kunnen worden toegepast op epilepsie studies. De kritische stap voor het vaststellen van deze modellen voor epilepsie is het gebruik van de geschikte doseringen. Een micro-injectie van grotere hoeveelheden van pilocarpine in de CEA kan secundaire gegeneraliseerde epilepsie ontwikkelen. IP toediening van meer dan 300 mg / kg pilocarpine induceert gegeneraliseerde epilepsie en SE; had echter de meeste ratten overleven na de SE ontwikkeld. Daarnaast doses lager dan 280 mg / kg kon niet met succes gegeneraliseerde epilepsie en SE vast te stellen. Dezelfde situation gebeurt met de PTZ-aanmaakhout model. Grotere doses van PTZ kunnen veroorzaken SE, maar veel muizen niet overleven. In contrast, lage doses van PTZ vereisen meer injecties om spontaan terugkerende epilepsie vast te stellen.
De indeling van verschillende waakzaamheid toestanden bij ratten en muizen is voornamelijk gebaseerd op kenmerken van polysomnografie opgenomen van mensen. We pasten het protocol om de slaap-waak-activiteit te analyseren door de waarden opgenomen van ECoG, spectrale verdeling, EMG, bewegingsactiviteit en corticale temperatuur. De kenmerken van ECoG, spectrale verdeling, EMG, bewegingsactiviteit en corticale temperatuur die van waken en NREM-slaap zijn vergelijkbaar met die verkregen van mensen. Echter, REM slaap soms dubbelzinnig en moeilijk te classificeren bij knaagdieren. De meeste literatuur beschrijft de REM-slaap bij knaagdieren volgens zijn ECoGs en EMGs. De theta frequentieband van ECoGs overheerst en de spieren van de EMG is het laagst bij ratten of muizen eenopnieuw in de REM-slaap. Om het vertrouwen van scoren REM slaap verhogen we verder opgenomen bewegingsactiviteit en corticale temperatuur. Fasische lichaam twitch wordt waargenomen en corticale temperatuur snel toeneemt als ratten in te voeren REM-slaap. Bewegingsactiviteit en corticale temperatuur, naast de ECoGs, spectrale verdeling en EMG, verbeteren de nauwkeurigheid van REM slaap analyse. Hoe meer parameters die zijn opgenomen, kan het nauwkeuriger indelingen worden.
Twee belangrijke punten zijn altijd bekritiseerd toen de onderzoekers het uitvoeren van handmatige acupunctuur of EA experimenten. De eerste vraag is hoe onderzoekers identificeren en te bevestigen de acupoints bij ratten. De meridiaan-systeem en acupoints bij de mens zijn goed ingeburgerd, maar er is geen meridiaan-systeem en acupoint kaart bevestigd bij knaagdieren. Daarom is de lokalisatie van overeenkomstige acupunten bij knaagdieren bepaald volgens de relatieve anatomische locatie. Bijvoorbeeld Fengchi acupunten (GB 20) zijnzich in de holte tussen het bovenste gedeelte van de musculus sternocleidomastoideus en de musculus trapezius bij mensen. Wij vonden de bijbehorende anatomische locatie bij knaagdieren en verder bevestigd door het meten van lage impedantie huid. De impedantie van een acupoint lager is dan die van de omringende huid. De tweede vraag is hoe de acupunctuur doses worden gecontroleerd tijdens het experiment. Als handmatig acupunctuur wordt gebruikt voor het experiment, moet de manipulatie van de naald trekkingen worden uitgevoerd door dezelfde onderzoeker op dezelfde wijze voor elke manipulatie. Het zou gemakkelijker zijn om de acupunctuur dosis controleren of EA van toepassing is, als EA zorgt voor een consistente stimulatie frequentie en stroomsterkte. Bovendien, in analgesie, EA vertoont meer effectiviteit dan handmatige acupunctuur 16. Echter, kunnen handmatige acupunctuur en EA met laagfrequente en hoogfrequente stimulatie tegelijk acupoint 17 verschillende hersengebieden activeren die verschillend ten grondslag liggen kunnen implicerening mechanismen.
Kortom, dit artikel toont een aantal chemisch-geïnduceerde epileptische modellen bij ratten en muizen, waaronder focale TLE, gegeneraliseerde epilepsie, SE, en spontaan en herhaaldelijk gegeneraliseerde epilepsie. Wij vestigden ook de traditionele en snelle elektro-aanmaakhout epileptische model bij ratten. Als lezers geïnteresseerd zijn in de elektrische-aanmaakhout model zijn, verwijzen wij u naar referenties 4 en 5. Wij bieden ook de criteria om de slaap-waak-activiteit te analyseren bij ratten en muizen. Om het effect van EA op epileptische activiteit en slaap evalueren beschrijven we hoe de gerelateerde acupunctuurpunten lokaliseren ratten en hoe de acupunctuur voeren en we ook enkele representatieve resultaten aan de effecten van EA voor epilepsie en epilepsie geïnduceerde slaapstoornissen tonen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs | |||
| Zoletil | Virbac | 50 mg/kg i.p. | |
| pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503 | 300 mg/kg i.p.; 1.2 mg microinjection |
| PTZ | Sigma-Aldrich | P6500 | 0.035 mg/mouse |
| polysporin | Pfizer | ||
| Surgery | |||
| ECoG electrode | Plastics One | E363/20 | screw electrode for rats |
| Pedestal | Plastics One | MS363 | |
| Cannula | Plastics One | C315G/spc | |
| Thermistor | Omega Engineering | 44008 | |
| Dental acrylic | Tempron | ||
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Dural arms | |
| Recording equipments | |||
| ECoG amplifier | Colbourn Instruments | V75-01 | |
| A/D Board | National Instruments | NI PCI-6033E | |
| Infrared-based motion detectors | Biobserve GmbH | custom-made | |
| ICELUS | G-System | ||
| AxoScope 10 Software | Molecular Devices | ||
| Acupuncture needs | |||
| Stainless needles | Shanghai Yanglong Medical Articles Co. | 32 gauge x 1” | |
| Functions Electrical Stimulator | I.T.O., Japan | Trio 300 | |
| AcuPen | Lhasa OMS | Pointer Excel II |
References
- Regesta, G., Tanganelli, P. Clinical aspects and biological bases of drug-resistant epilepsies. Epilepsy Res. 34 (2-3), 109-122 (1999).
- Malow, B. A., Bowes, R. J., Lin, X.
- Stores, G., Wiggs, L., Campling, G. Sleep disorders and their relationship to psychological disturbances in children with epilepsy. Child Care Health Dev. 24 (1), 5-19 (1998).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Lee, C. C., Chang, F. C. Kindling stimuli delivered at different times in the sleep-wake cycle. Sleep. 27 (2), 203-212 (2004).
- Yi, P. L., Chen, Y. J., Lin, C. T., Chang, F. C. Occurrence of epilepsy at different zeitgeber times alters sleep homeostasis differently in rats. Sleep. 35 (12), 1651-1665 (2012).
- Bazil, C. W.
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Jou, S. B., Chang, F. C. Low frequency electroacupuncture suppress focal epilepsy and improves epilepsy-induced sleep disruptions. J Biomed Sci. 22, 49 (2015).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Activation of amygdala opioid receptors by electroacupuncture of Feng-Chi (GB20) acupoints exacerbates focal epilepsy. BMC Complement Altern Med. 13, 290 (2013).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Amygdala opioid receptors mediate the electroacupuncture-induced deteriortation of sleep disruptions in epilepsy rats. J Biomed Sci. 20, 85 (2013).
- Paxinos, G., Watson, W. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (4th edition). , Academic Press. San Diego. (1998).
- Siu, F. K. W., Lo, S. C. L., Leung, M. C. P. Electro-acupuncture potentiates the disulphide-reducing activities of thioredoxin system by increasing thioredoxin expression in ischemia-reperfused rat brains. Life Sci. 77 (4), 386-399 (2005).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Liu, H. J., Chang, F. C. Effects of electroacupuncture at 'Anmian' (extra) acupoints on sleep activities in rats: the implication of the caudal nucleus tractus solitaries. J Biomed Sci. 11 (5), 579-590 (2004).
- Jou, S. B., Kao, I. F., Yi, P. L., Chang, F. C. Electrical stimulation of left anterior thalamic nucleus with high-frequency and low-intensity currents reduces the rate of pilocarpine-induced epilepsy in rats. Seizure. 22 (3), 221-229 (2012).
- Chang, F. C., Opp, M. R. Blockade of corticotropin-releasing hormone receptors reduces spontaneous waking in the rat. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 275 (3), Pt 2 793-802 (1998).
- Cheng, C. H., Yi, P. L., Lin, J. G., Chang, F. C. Endogenous opiates in the nucleus tractus solitaries mediate electroacupuncture-induced sleep activities in rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2011, 159209 (2011).
- Tsui, P., Leung, M. C. Comparison of the effectiveness between manual acupuncture and electro-acupuncture on patients with tennis elbow. Acupunct Electrother Res. 27 (2), 107-117 (2002).
- Napadow, V., Makris, N., Liu, J., Kettner, N. W., Kwong, K. K., Hui, K. K. Effects of electroacupuncture versus manual acupuncture on the human brain as measured by fMRI. Hum Brain Mapp. 24 (3), 193-205 (2005).
