Introduction
A epilepsia é um distúrbio neurológico comum em que crises recorrentes ocorrer durante toda a vida de um paciente. A maioria das recorrências epilépticas pode ser bem controlada pelas drogas anti-epilépticas (DAE). No entanto, cerca de 30% dos pacientes epilépticos desenvolver um refractário epilepsia. causas da epilepsia distúrbios do sono, que podem agravar ainda mais a reincidência. Evidências demonstram que a epilepsia pode tanto interromper o sono durante a noite ou pode causar excessiva 2,3 sonolência diurna. Os nossos estudos anteriores indicam ainda que a epilepsia ocorre em tempo zeitgeber (ZT) 0, ou seja, o início do período de luz, à luz: ciclo escuro, diminui o sono; esta é mediada pela hormona de libertação de corticotropina (CRH), um factor homeostática. Da epilepsia em ZT13 (o início do período de escuro) aumenta a expressão de um outro factor homeostático, interleucina-1 (IL-1), o que aumenta o sono. Sono ritmos circadianos são alteradas quando a epilepsia ocorre em ZT6, o meio daperíodo de luz 4,5. Por outro lado, os problemas do sono exacerbar ainda mais a progressão e recorrência da epilepsia 6. Com base nas evidências acima, tentamos revelar um método terapêutico ideal para controlar simultaneamente epilepsia e evitar interrupções do sono em pacientes com epilepsia. Anteriormente verificou que electroacupuncture (AE) com uma frequência de estimulação de 10 Hz, em que uma certa quantidade de corrente é fornecido para o ponto de acupunctura por meio de uma agulha de aço inoxidável, com sucesso suprime eletrocorticograma (ECoG) actividades de epilepsia e distúrbios do sono induzida por epilepsia 7 . EA com uma frequência de estimulação de 100 Hz se deteriorar ainda mais as atividades epilépticas e distúrbios do sono em ratos 8,9. Esta experiência bem sucedida depende de três fatores: em primeiro lugar, um modelo animal de epilepsia viável; Em segundo lugar, um método para a gravação e a análise do sono em roedores; e em terceiro lugar, o desempenho preciso da acupuntura e a precisão do locati acupointons.
A epilepsia tem sido classificados em dois tipos principais: epilepsia focal e epilepsia generalizada. Estamos interessados em epilepsia focal lobo temporal (ELT), epilepsia generalizada, estado de mal epiléptico (SE), e a recorrência de epilepsia generalizada espontânea. Portanto, diferentes manipulações são aplicados para criar modelos de epilepsia adequados para nossos experimentos. Para estabelecer TLE focal, uma dose baixa de pilocarpina é administrado para dentro do núcleo central esquerdo da amígdala (CEA). Para verificar este modelo, seis eléctrodos de ECoG são implantados na frontal (F1 & F2), parietal (P1 e P2), e occipital (O1 & O2) lóbulos em ambos os hemisférios esquerdo e direito, e mais dois eléctrodos de referência (R1 & R2) são colocados sobre o cerebelo, em ambos os hemisférios. Uma cânula guia microinjecção adicional é cirurgicamente implantado no lado esquerdo CEA (AP, 2,8 mm a partir da bregma; mL, 4,2 mm; DV, 7.8 mm em relação ao bregma) relativos. As coordenadas são adaptados a partir da Paxinos e Watlas rato atson 10. Se o TLE focal é induzida com sucesso, somente a gravação do eletrodo no córtex parietal esquerda (P1), que fica perto da CeA esquerda, deve adquirir as ECoGs epileptiformes dominantes, sem ECoGs epileptiformes significativos registados a partir dos outros eletrodos ECoG. Intraperitoneal (ip) de pilocarpina em ratos induzem epilepsia generalizada e SE, mas isto pode ser fatal. Cinco injecções IP de pentilenotetrazol (PTZ) com um intervalo de um dia entre cada injecção induzir com sucesso epilepsia generalizada espontânea em ratos e também garantir a sobrevivência dos ratos. Dois eléctrodos de fio de ECoG são implantados no córtex frontal e parietal em ratinhos a receber sinais de ECoG e para verificar a epilepsia espontaneamente recorrentes.
A polissonografia (PSG) é um método abrangente para gravar as mudanças fisiológicas que ocorrem durante o sono, e pode objectivamente classificar sono em diferentes estágios de movimento não rápido dos olhos (NREM) e rAPID movimento dos olhos (REM). PSG registra os parâmetros de funções do corpo, incluindo as ondas cerebrais (eletroencefalograma, EEG), movimentos oculares (eletrooculograma, EOG), tons de músculo esquelético (eletromiografia, EMG), ritmos cardíacos (eletrocardiograma, ECG), e os níveis de oxigênio no sangue e parâmetros respiratórios. Em ratos, registramos ECoGs, EMG, temperatura cortical e atividade locomotora para classificar os estados de vigilância em vigília, o sono NREM e sono REM. análise de sono em ratos é conduzida usando ECoGs, EMGs, e resultados de atividade locomotora. Os ratos são implantados cirurgicamente, com três ECoG parafuso eletrodos no frontal, parietal e córtex cerebelar contralateral por cirurgia estereotáxica. determinação pós-aquisição dos estados de vigilância (vigília, sono NREM e sono REM) é conduzida de acordo com os parâmetros adquiridos a partir dos ECoGs, EMG, a temperatura do cérebro e atividade locomotora. Os critérios detalhados para classificar o comportamento do animal em ambos os ratos e murganhos são descritos em Tele protocolo.
Ambos os ratos e ratinhos necessitam de ser anestesiados com uma dose baixa de Zoletil (25 mg / kg), que é a metade da dose de anestésicos normalmente administrados durante a cirurgia estereotáxica, antes de realizar a acupunctura manual ou EA. Esta dosagem permite que os animais acordar 30 a 35 minutos após a injecção. De qualquer acupuntura manual ou EA é executada no início do período de escuro, com um período de tempo constante de 30 min, e cada animal é consecutivamente tratados durante dois a três dias. Estimulantes correntes EA são entregues num ponto de acupunctura particular através de uma agulha de aço inoxidável que é inserida no ponto de acupunctura. A corrente de estímulo é uma série de impulsos quadrados bifásica, em que a duração do impulso é de 150 ms e a intensidade de estimulação é de 1 mA. Se uma agulha for utilizada para a acupunctura manual, a agulha inserida nos acupontos se contraiu 10 vezes cada 5 min. A parte difícil da acupuntura manual ou EA é localizar os pontos de acupuntura em roedores. o locção dos pontos de acupuntura em ratos ou camundongos é semelhante à sua localização anatômica em seres humanos. Por exemplo, os pontos de acupuntura bilaterais Fengchí estão localizados 3 mm de distância da linha média posterior do pescoço, entre as duas orelhas, que é semelhante à sua localização anatómica em seres humanos 11. Além disso, os pontos de acupuntura com baixa impedância sobre a pele pode ser ainda confirmada. Sham acupuntura ou EA sham manipulação é necessária para acupuntura ou experimentos EA. Acupuntura Sham ou EA simulada deve ser realizado em um não-acupoint localizado perto do ponto de acupuntura, como perto da axila 12.
Para investigar com êxito os efeitos da acupuntura ou EA sobre a epilepsia e perturbações do sono induzida por epilepsia, os seguintes fatores devem estar no local: um modelo viável epiléptico animal, a análise precisa do ECoGs epileptiformes e a recorrência de epilepsia, um método para classificar os estados de vigilância , eo desempenho precisa da acupuntura ou eA em roedores.
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Protocol
Todos os protocolos experimentais são aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade Nacional de Taiwan.
1. Cirurgia estereotáxica para implantação ECoG Eletrodos, Eletrodos EMG, Brain Termistor e Guia Injection cânula
- Para os ratos (250-350 g, ratos Sprague-Dawley machos com 6 a 8 semanas de idade)
- Anestesiar os ratos por injecção IP com 50 mg / kg de Zoletil. Confirmar a profundidade adequada da anestesia, observando a falta de resposta após beliscar a pata traseira. Aplicar pomada, raspar a pele, e esterilizar a pele com solução de iodo-povidona e 75% de etanol. Injectar um antibiótico (penicilina G) para prevenir a infecção.
- Prepare bisturis, tesouras, hemostats, gazes e máquina de cautério para a cirurgia. Esterilizar engrenagem cirúrgica e gazes por uma autoclave ea cauterização por 75% de etanol.
- Coloque uma barra de ouvido no canal do ouvido e montar o rato ao estereotaxia.
- utilizaçãoum bisturi, fazer uma incisão na linha média de 2 cm aproximadamente no crânio ao longo de uma linha entre dois ouvidos, movendo-se caudalmente. Clipe os retalhos de pele com hemostats para expor o crânio e remover o tecido sobre o crânio com um bisturi.
- Broca oito furos (F1, F2, P1, P2, O1, O2, R1, e R2), cada um aproximadamente 0,7 mm de diâmetro, sobre o crânio com uma ferramenta rotativa. Parafuso oito eletrodos ECoG sobre os lobos frontal, parietal e occipital e do cerebelo em ambos os hemisférios esquerdo e direito. Estes eléctrodos são utilizados para a detecção de epilepsia focal.
- Use as seguintes coordenadas para os eletrodos de gravação: frontal (F1 e F2): +2,0 mm anterior ao bregma e 2,5 milímetros da linha média, parietal (P1 e P2): -2,0 mm anterior ao bregma e 3,0 milímetros da linha média , e occipital (O1 e O2): -5,5 mm anterior ao bregma e 3,0 milímetros da linha média.
- Coloque dois eléctrodos de referência (R1 e R2) em relação ao cerebelo (-11,0 mm anterior ao bregma e 4,0 milímetros a partir do midline).
- Em grupos separados de ratos, faça três furos e colocar dois eletrodos de EEG parafuso sobre o frontal direita (F2) e lobos parietais (P2) dos córtices com as mesmas coordenadas como descrito no passo 1.1.5.1. Coloque um terceiro eletrodo EEG sobre o cerebelo esquerdo (R1), que serve para aterrar a animais e reduzir os artefatos de sinal. Estes eletrodos são usados para confirmar a epilepsia generalizada e analisar as fases de vigilância.
- Separar a pele do pescoço e músculo e inserir dois eletrodos EMG no músculo do pescoço.
- Broca outro orifício no crânio e colocar uma cânula guia de microinjecção para a esquerda CEA (AP, 2,8 mm a partir da bregma; mL, 4,2 mm; DV, 7,8 milímetros em relação ao bregma) em ratos. As coordenadas são adaptados a partir da Paxinos e Watson atlas rato 10.
- Perfurar um furo maior (com um diâmetro de 1,6 mm) no crânio e inserir um termistor 30 kV calibrada na superfície do córtex parietal, que será mais tarde cimentada, a monitor a temperatura cortical em ratos.
- Use gaze e cautério para parar o sangramento quando ele ocorre.
- Passe os condutores isolados dos eletrodos ECoG e eletrodos EMG a um pedestal e ligue o termistor para a corda. Cimentar o pedestal e guia de uma cânula para o crânio com acrílico dental.
- Tratar a incisão topicamente com polysporin (bacitracina-zinco / sulfato de polimixina B) para prevenir a infecção. Dê os animais tanto ibuprofeno e penicilina G na água durante uma semana após a cirurgia.
- Para ratinhos (20 - 30 g ratos, de 6 a 8 semanas de idade C57BL / C)
- Anestesiar os ratos por injecção IP com 50 mg / kg de Zoletil e confirmar a correcta profundidade da anestesia através da observação de uma falta de resposta após a beliscar a pata traseira. Aplicar pomada. Depois de raspar a pele, esterilizar a pele com solução de iodo-povidona e 75% de etanol. Injectar um antibiótico (penicilina G) para prevenir a infecção.
- Coloque uma barra de ouvido no canal do ouvido emontar o mouse para a estereotaxia.
- Usando um bisturi, fazer uma incisão na linha média de 1,5 cm aproximadamente no crânio ao longo de uma linha entre as duas orelhas, movendo-se caudalmente. Clipe os retalhos de pele com hemostats para expor o crânio e remover o tecido sobre o crânio com um bisturi.
- Picar dois furos no crânio com tesouras cirúrgicas e colocar dois eléctrodos de fio de ECoG no lobo frontal direito (F2: +2,0 mm em relação ao bregma e 1,5 para a linha média) e lobo parietal esquerdo (P1: -3.0 mm em relação ao bregma e -2,5 mm da linha média).
- Separar a pele do pescoço e músculo e inserir dois eletrodos EMG no músculo do pescoço.
- Ligar os condutores isolados a partir dos eléctrodos de arame de ECoG e eléctrodos de EMG para os terminais fêmea e a um conector de 2,54 mm, e, em seguida, cimento ao crânio com acrílico dental.
- Tratar a incisão topicamente com polysporin (bacitracina-zinco / sulfato de polimixina B) para prevenir a infecção. Dê os animais tanto o ibuprofeno e penicilina G na água por um week após a cirurgia.
- Permitir que todos os animais recuperassem durante sete dias antes do início das experiências.
- Casa ratos ou ratinhos, separadamente, em gaiolas individuais de gravação, na sala isolada em que a temperatura é mantida a 23 ± 1 ° C e a luz: escuro (L: D) ritmo é controlada de 12: ciclo de 12 h (40 W X 4 tubos de iluminação). Fornecer alimentos e água ad libitum.
- Ligue o ECoG, EMG, e termistor através de um grupo de ancoragem para os amplificadores de uma semana após a cirurgia para iniciar as gravações.
2. Estabelecimento de Focal TLE epilepsia, SE, e espontaneamente Recurrent epilepsia
- para os ratos
- Administrar 0,5 uL de pilocarpina (2,4 mg / mL) para o CeA esquerda através da cânula guia de injecção, utilizando uma bomba de micro-injecção. A taxa de injecção deve ser fixado em 0,2 mL / min para induzir TLE focal.
- IP injectar 300 mg / kg de pilocarpina para induzir epi generalizadalepsy com recorrentes SE.
- para ratos
- IP administrar PTZ (0,035 mg / g de peso corporal do rato) num determinado ponto de ZT todos os dias. Cinco injecções consecutivas irá causar o desenvolvimento de epilepsia espontaneamente e recorrentemente generalizada.
- Para ambos os ratos e murganhos
- Amplificar os sinais de ECoG por 5.000 e filtrar os de banda analógica entre 0,1 e 40 Hz.
- Use um A placa A / D conversão para converter os sinais ECoGs analógicos em sinais digitais com uma taxa de amostragem de 128 Hz.
- Usar um software para a pontuação visual e analisar o aparecimento e a duração da epilepsia. Medir o intervalo de tempo, a fim de representar o tempo.
- Definir ECoG epilepsia pelo aparecimento de picos epilépticos com amplitudes superiores a 2 mV e com durações de mais do que 30 s 13.
3. Classificação de Vigilância Unidos
- para os ratos
- Determinar os estados de vigilância usando os parâmetros adquiridos de ECoGs, EMG, as temperaturas do cérebro, e locomoção dentro de um 12-s episódio de gravação. Ligue o ECoG, EMG, e termistor através de um grupo de ancoragem para os amplificadores de uma semana após a cirurgia para começar a gravação. Marcar os estados com um software feito sob medida de acordo com etapas 3.1.5 - 3.1.7.
- Medir as atividades de locomoção, utilizando um detector de movimento infravermelho, integrar os sinais cada 1 s, e armazenar os sinais.
- Medir a temperatura cortical e armazenar os sinais.
- Classificar os estados de vigilância de acordo com os nossos critérios previamente definidos 14.
- Pontuação vigília usando as seguintes características: ECoGs de pequena amplitude com espectros de alta-frequência, maior poder de delta (0,5-4,0 Hz) e de potência inferior theta (6,0-9,0 Hz); atividade locomotora dominante; alta atividade EMG; e aumentando gradualmente a temperatura cortical.
- Pontuação sono NREM usando o followincaracterísticas de g: de ondas delta ECoGs dominantes com grandes amplitudes, diminuiu a atividade EMG, reduziu a temperatura cortical, e nenhuma atividade locomotora.
- Pontuação sono REM usando as seguintes características: diminuição da amplitude de ECoGs com a frequência dominante teta, de repente aumento da temperatura cortical, a atividade EMG mínimo, e baixa atividade locomotora com contrações musculares do corpo.
- para ratos
- Repita a classificação dos estados de vigilância nos ratos como conduzidos nos ratos, exceto que não há temperatura cortical gravado a partir do termistor.
4. Realização de acupuntura manual e EA em Ratos
- O rato é anestesiado para o protocolo EA.
- Localize o ponto de acupuntura pela anatomia e confirme baixa impedância pele no ponto de acupuntura. A luz está piscando quando detectar a baixa impedância pele. Nota: acupontos Fengchí está localizado a 3 mm de distância da linha média posterior sejatre as duas orelhas, no pescoço.
- Inserir agulhas de aço inoxidável para os pontos de acupuntura, a uma profundidade de 2 mm.
- Twitch as agulhas inseridas 10 vezes a cada 5 min.
- Usando um estimulador elétrico funcional, entregar um trem de pulsos bifásicos (duração de 150 uS cada) com uma intensidade de 1 mA aos pontos de acupuntura através da agulha.
- Executar uma acupuntura sham ou simulada EA como um controle.
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Representative Results
Existem diferentes modelos de ratos e camundongos para satisfazer as necessidades de diferentes tipos de epilepsia. Para induzir TLE focal, 0,5 ul de pilocarpina (2,4 mg / mL) é administrado para a esquerda CeA. Os ECoGs epileptiforme predominantes são adquiridos a partir do eléctrodo de ECoG no lobo parietal do hemisfério esquerdo (Figura 1A: b), e actividades epilépticos raras são apanhados do resto dos eléctrodos de ECoG (Figura 1A: a, c, d, e e f) quando a pilocarpina é administrado. ECoGs epileptiformes são registrados principalmente imediatamente após a administração de pilocarpina. Estes resultados são adotadas a partir de 8. Estes resultados indicam a indução bem sucedida de TLE focal em ratos, após a injecção directa de uma dose baixa de pilocarpina para o ACE.
Dentro de 5 min, a IP eminjeção de 300 mg / kg pilocarpina induz efeitos colinérgicos graves sobre o comportamento, tais como piloereção, salivação, olhos vermelhos, tremendo, e automatismos faciais. A gravidade destes sinais comportamentais aumenta gradualmente até que uma apreensão generalizada ECoG ocorre (Figura 1B, a caixa azul). SE também ocorre após a epilepsia generalizada (Figura 1B, caixa vermelha). Estes resultados são adotadas a partir de 13. Os nossos resultados sugerem que uma injecção IP de 300 mg / kg de pilocarpina é um método fiável para induzir a epilepsia generalizada ECoG documentado e SE. No entanto, a taxa de sobrevivência após o desenvolvimento SE é entre 15% e 20%. O modelo de gravetos PTZ de epilepsia em ratos é usado para desenvolver epilepsia espontânea e recorrentemente generalizada. PTZ a uma dose de 0,035 mg / g de peso corporal do rato é injectado IP num ponto ZT particular (por exemplo, o início do período de escuro, ZT13) a cada dois dias, e cada injecção é separado por um intervalo de um dia. Não há epileptiformECoGs encontrados durante o período negro após o st injeção de 1 de PTZ (Figura 1C: a) ou durante o seguinte período negro, quando é um dia de folga para injecção (Figura 1C: b). Nenhuma atividade epiléptica significativa é encontrada após a 2ª, 3ª e 4ª injeções (dados não mostrados aqui). No entanto, ECoGs epileptiforme são induzidos após a injecção de PTZ 5 th (Figura 1C: c e d), juntamente com epilepsia generalizada espontaneamente e recorrentemente (Figura 1C: E e A ').
Classificamos estados de vigilância em vigília, o sono NREM e sono REM de acordo com os critérios que mencionamos no protocolo. Vigília é visualmente marcado por ECoGs dessincronizado com baixa amplitude e alta frequência. Os valores da densidade de energia na banda de frequência delta (0,5-4 Hz) são geralmente maiores do que aquelas ema banda de frequências theta (6-9 Hz) durante a vigília, e espectros de mais alta frequência (> 10 Hz) são encontrados. Vigília apresenta uma alta amplitude do EMG e muita atividade locomotora. Além disso, a temperatura cortical aumenta gradualmente quando o estado de vigilância trânsitos de ambos sono NREM ou sono REM à vigília (Figura 2). NREM é caracterizado por ECoGs sincronizados com alta amplitude e baixa frequência. Os valores de densidade de potência são dominantes na faixa de frequências delta. A amplitude EMG declina gradualmente, e nenhuma atividade locomotora é exibido durante o sono NREM. Temperatura cortical diminui quando o estado de vigilância trânsitos de vigília para o sono NREM (Figura 2). Durante o sono REM, a onda ECoG está dessincronizado, a amplitude é reduzida, a densidade de potência predominante EEG ocorre dentro da freqüência teta (6,0-9,0 Hz), a atividade EMG é o menor, fásica contração corpo é observado, ea temperatura cortical aumenta rapidamente(Figura 2).
Nós demonstramos os efeitos distintos de EA sobre a atividade epiléptica quando a EA estimula os pontos de acupuntura Fengchi com qualquer uma estimulação de alta frequência (100 Hz) ou uma estimulação de baixa frequência (10 Hz). Na Figura 3A, a micro-injecção de 0,5 mL de pilocarpina (2,4 mg / mL) para a esquerda CeA induz TLE focal, tal como mencionado anteriormente (B). No entanto, 100 Hz EA dos pontos de acupuntura bilaterais Fengchi agrava os ECoGs epileptiformes induzida por pilocarpina (C). Estes resultados encontram-se adaptado a partir de 8. Em contraste, 10-Hz EA de Fengchí bilateral suprime as ECoGs epileptiforme induzida por pilocarpina (Figura 3B: C). Estes resultados encontram-se adaptado a partir de 7. A administração de pilocarpina no CeA esquerda também suprime o sono NREM durante o período de luz do 12 horas de luz: ciclo escuro (Figura 4A e 4B). A redução do sono NREM durante afew horas do período de escuridão é principalmente devido ao efeito de anestesia, e não é um efeito directo da EA 15. A aplicação de 100 Hz EA se deteriora ainda mais a supressão induzida por pilocarpina de sono NREM (Figura 4A). Em contraste, a 10 Hz de EA acupontos bilaterais Fengchí aumenta sono NREM por si só, durante o período escuro e bloqueia a redução induzida por pilocarpina de sono NREM durante o período de luz (Figura 4B). Estes resultados são adotadas a partir de 9.
Figura 1: diferentes modelos de epilepsia em ratos e camundongos. A demonstra a TLE focal em ratos. B elucida a epilepsia generalizada com SE em ratos. C indica os ECoGs epileptiformes espontâneas e recorrentes. (A) (a), (b), (c), (d), (e) e (f) E representa osinais COG gravados a partir dos eléctrodos colocados no frontal esquerdo, parietal esquerdo, occipital esquerda, frontal direita, parietal direita e córtex occipital direita, respectivamente. (B) A seta indica a injecção ip de pilocarpina. A caixa cinza (a) demonstra as ECoGs iniciais obtidos antes da injeção de pilocarpina. A caixa azul mostra os ECoGs epileptiformes de epilepsia generalizada. A caixa vermelha (b) representa o SE. Os sinais de ECoG extraídos a partir de (a) e (b) são mostrados em (a ') e (b'). (C) (a) representa os ECoGs adquiridas após a injecção de PTZ r 1 e (b) representa os ECoGs registada no dia seguinte à injecção de PTZ r 1 em ratinhos. Actividades de epilepsia ocorrer após a injecção de 5 th PTZ (C) e depois. Os ECoGs epilépticas recorrentes que ocorrem no dia após a 5ª injecção de PTZ são mostrados em (d). Os ECoGs epilépticas recorrentes gravados 5 dias após a injecção de PTZ 5 th são mostrados em (e) . A figura na parte inferior (a ') representa os ECoGs extraídos da caixa vermelha. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Classificação de Vigilância Unidos: vigília, sono NREM e sono REM. Os estados de vigilância de ratos são classificados pelos parâmetros dos ECoGs, ECoG espectros, EMG, a atividade locomotora e temperatura cortical. Os estados de vigilância de ratinhos são caracterizados por os mesmos parâmetros, com excepção da temperatura cortical não é aplicável.
Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3: Os Efeitos de 100 Hz e EA 10 Hz sobre a Epilepsia. Em (A), o primeiro traço ECoG demonstra as ECoGs linha de base (a). A microinjecção de pilocarpina para o CeA esquerda induz TLE focal (b). Aplicação da EA 100 Hz em pontos de acupuntura bilaterais Fengchi agrava os ECoGs epileptiformes (c). Em (B), o primeiro traço ECoG demonstra as ECoGs linha de base (a). A micro-injecção de pilocarpina para o CeA esquerda induz TLE focal (b). A aplicação de EA de 10 Hz em pontos de acupuntura bilaterais Fengchi suprime os ECoGs epileptiformes (c). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Os Efeitos de 100 Hz e EA 10 Hz em EpiInterrupções do sono induzido por lepsy. (A) TLE focal induzida pela microinjeção de pilocarpina no CeA esquerda reduz o sono NREM durante o período de luz. 100 Hz EA se deteriora ainda mais a perturbação do sono induzida por epilepsia. (B) A aplicação de 10 Hz blocos EA a redução induzida por epilepsia do sono NREM durante o período de luz. Além disso, 10 Hz EA melhora do sono NREM durante o período escuro. Os valores são representados como a média ± SEM. O círculo preto representa os valores obtidos antes da microinjecção de pilocarpina, o círculo aberto representa os dados obtidos após a injecção de pilocarpina, e o triângulo aberto demonstra os valores obtidos após estímulos EA. A barra preta representa o período negro da 12 horas de luz: ciclo escuro, ea barra branca representa o período de luz. * Representa a diferença estatística entre a EA 100 Hz + grupo pilocarpina eo controle (ANOVA, P <0,05) e # indica o differenc estatísticae entre o EA-10 Hz + grupo de pilocarpina e o grupo pilocarpina (ANOVA, p <0,05). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A escolha de um modelo animal de epilepsia viável é essencial para cada finalidade experimental. Um dos nossos objetivos é elucidar os efeitos da EA na supressão de epilepsia. EA é um medicamento alternativo que pode apresentar efeitos terapêuticos na epilepsia e tem sido documentada em literatura antiga chinesa. No entanto, há uma falta de evidência científica para provar isso. Para determinar os efeitos da EA sobre epilepsia, nós nos concentramos principalmente sobre os efeitos da EA sobre a epilepsia focal suave, em vez de crise generalizada grave ou SE. Nosso estudo anterior usou um modelo TLE focal em ratos para demonstrar os efeitos de baixa frequência (10 Hz) e alta freqüência (100 Hz) EA dos pontos de acupuntura bilaterais Fengchi sobre induzida por pilocarpina focais TLE e focais induzidas por TLE perturbações do sono 7- 9. Nossos resultados sugerem que 10 Hz EA dos pontos de acupuntura bilaterais Fengchi suprime focal TLE e dormir perturbação, enquanto que 100 Hz EA exacerba tanto TLE focal e distúrbios do sono induzidas TLE. Outro exemplo é o to demonstram os efeitos da estimulação profunda do cérebro em epilepsia refratária, apreensão especialmente generalizada e SE. Nós determinamos que a estimulação cerebral profunda unilateral do núcleo anterior do tálamo (ANT), com correntes de alta frequência e baixa intensidade inibe com sucesso a recorrência de epilepsia generalizada ea duração da SE 13. Também desenvolvemos espontaneamente e recorrentemente epilepsia generalizada pelo método gravetos PTZ em ratos. Este modelo de gravetos PTZ pode ser amplamente aplicada a estudos de epilepsia. O passo crítico para a criação destes modelos de epilepsia é a utilização das dosagens apropriadas. A microinjeção de maiores quantidades de pilocarpina para o CeA podem desenvolver epilepsia generalizada secundária. IP administração de mais do que 300 mg / kg induz a pilocarpina epilepsia generalizada e SE; no entanto, a maioria dos ratos não sobreviveram após o SE desenvolvido. Além disso, doses mais baixas do que 280 mg / kg não conseguiu estabelecer com sucesso epilepsia generalizada e SE. Esta mesma Situação acontece com o modelo de gravetos PTZ. Doses maiores de PTZ pode causar SE, mas muitos ratos não sobrevivem. Em contraste, doses baixas de PTZ requerem mais injecções para estabelecer epilepsia espontaneamente recorrentes.
A classificação dos diferentes estados de vigilância em ratos e ratinhos é baseada principalmente em características de polissonografia gravados a partir de seres humanos. Nós modificamos o protocolo, a fim de analisar a atividade de sono-vigília pelos valores registados a partir de ECoG, distribuição espectral, EMG, a atividade locomotora e temperatura cortical. As características de ECoG, a distribuição espectral, EMG, a actividade locomotora e a temperatura cortical gravadas de vigília e sono NREM são semelhantes àqueles adquiridos a partir de seres humanos. No entanto, o sono REM é, por vezes ambíguo e difícil de classificar em roedores. A maior parte da literatura descreve o sono REM em roedores de acordo com suas ECoGs e EMGs. A banda de frequência ECoGs teta é predominante eo tônus muscular da EMG é menor quando ratos ou camundongos umre no sono REM. A fim de aumentar a confiança do sono REM pontuação, registramos ainda mais a atividade locomotora e da temperatura cortical. Phasic contração corpo é observado e temperatura cortical aumenta rapidamente quando os ratos entram sono REM. A actividade locomotora e a temperatura cortical, para além dos ECoGs, a distribuição espectral, e EMG, para melhorar a precisão de análise sono REM. Os mais parâmetros que estão incluídos, as classificações mais precisas podem ser feitas.
Dois pontos principais sempre foram criticados quando os pesquisadores realizar a acupuntura manual ou experimentos EA. A primeira questão é como os pesquisadores identificar e confirmar os pontos de acupuntura em ratos. O sistema de meridianos e pontos de acupuntura em seres humanos estão bem estabelecidos, porém não há nenhum mapa meridiano sistema e acupoint confirmada em roedores. Por conseguinte, a localização de pontos de acupuntura correspondentes em roedores é determinado de acordo com a localização anatómica relativa. Por exemplo, pontos de acupuntura Fengchi (GB 20) sãolocalizada na depressão entre a parte superior do esternocleidomastóideo musculus musculus de trapézio e o em seres humanos. Achamos a localização anatômica relacionada em roedores e confirmou-lo ainda mais através da medição de baixa impedância pele. A impedância de um ponto de acupuntura é menor do que a pele circundante. A segunda questão é a forma como as doses de acupuntura são controladas durante o experimento. Se acupuntura manual é usado para a experiência, a manipulação da agulha espasmos devem ser realizadas pelo mesmo investigador da mesma maneira para cada manipulação. Seria mais fácil de controlar a dose de acupuntura se EA é aplicável, como EA garante uma frequência de estimulação consistente e intensidade de corrente. Além disso, em analgesia, EA exibe mais eficácia do que a acupuntura manual de 16. No entanto, a acupuntura manual e EA com baixa frequência e estimulação de alta frequência, ao mesmo acupoint pode ativar diferentes regiões cerebrais 17, o que pode implicar underly diferenteing mecanismos.
Em resumo, este trabalho demonstra vários modelos de epilepsia induzida por químicos em ratos e ratinhos, incluindo TLE focal, epilepsia generalizada, SE, e epilepsia espontânea e recorrentemente generalizada. Nós também estabeleceu o modelo de epilepsia elétrica de gravetos tradicional e rápida em ratos. Se os leitores estão interessados no modelo elétrico-acender, consulte referências 4 e 5. Nós também fornecemos os critérios para analisar a atividade de sono-vigília em ratos e camundongos. Para avaliar o efeito da EA na atividade epiléptica e dormir, nós descrevemos como para localizar os pontos de acupuntura relacionados em ratos e como realizar a acupuntura, e também apresentar alguns resultados representativos para demonstrar os efeitos da EA sobre a epilepsia e perturbações do sono induzida por epilepsia .
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs | |||
| Zoletil | Virbac | 50 mg/kg i.p. | |
| pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503 | 300 mg/kg i.p.; 1.2 mg microinjection |
| PTZ | Sigma-Aldrich | P6500 | 0.035 mg/mouse |
| polysporin | Pfizer | ||
| Surgery | |||
| ECoG electrode | Plastics One | E363/20 | screw electrode for rats |
| Pedestal | Plastics One | MS363 | |
| Cannula | Plastics One | C315G/spc | |
| Thermistor | Omega Engineering | 44008 | |
| Dental acrylic | Tempron | ||
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Dural arms | |
| Recording equipments | |||
| ECoG amplifier | Colbourn Instruments | V75-01 | |
| A/D Board | National Instruments | NI PCI-6033E | |
| Infrared-based motion detectors | Biobserve GmbH | custom-made | |
| ICELUS | G-System | ||
| AxoScope 10 Software | Molecular Devices | ||
| Acupuncture needs | |||
| Stainless needles | Shanghai Yanglong Medical Articles Co. | 32 gauge x 1” | |
| Functions Electrical Stimulator | I.T.O., Japan | Trio 300 | |
| AcuPen | Lhasa OMS | Pointer Excel II |
References
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