Summary
Denne protokol beskriver fremgangsmåder til oprensning, kvantificering og karakterisering af ekstracellulære vesikler (EV'er) / exosomer fra ikke-adhærerende / mesenkymale brystepithelceller og til anvendelse af dem til overførsel af brystkirteldannende evne til luminale brystepithelceller. EV'er / exosomer afledt af stamlignende brystepithelceller kan overføre denne celleegenskab til celler, der indtager EV'er / exosomer.
Abstract
Celler kan kommunikere via exosomer, ~ 100 nm ekstracellulære vesikler (EV'er), der indeholder proteiner, lipider og nukleinsyrer. Non-adherent / mesenchymale brystepitelcelle (NAMEC) -afledte ekstracellulære vesikler kan isoleres fra NAMEC-medium via differentiel ultracentrifugering. Baseret på deres tæthed kan EV'er renses via ultracentrifugering ved 110.000 x g. EV-præparatet fra ultracentrifugering kan separeres yderligere under anvendelse af en kontinuert densitetsgradient for at forhindre forurening med opløselige proteiner. De oprensede EV'er kan derefter evalueres yderligere ved anvendelse af nanopartikel-sporingsanalyse, som måler størrelsen og antallet af vesikler i præparatet. De ekstracellulære vesikler med en størrelse i området fra 50 til 150 nm er exosomer. De NAMEC-afledte EV'er / exosomer kan indtages af brystepithelceller, som kan måles ved hjælp af flowcytometri og konfokal mikroskopi. Nogle bryst stamcelleegenskaber ( fx brystkirtlen-dannende evne) kanOverføres fra stamme-lignende NAMEC'er til brystepithelceller via de NAMEC-afledte EV'er / exosomer. Isolerede primære EpCAM hi / CD49f lo luminale brystepithelceller kan ikke danne brystkirtler efter transplantation i musfedtpuder, medens EpCAM lo / CD49f hi basale brystpitelceller danner brystkirtler efter transplantation. Optagelse af NAMEC-afledte EV'er / eksosomer ved EpCAM hi / CD49f lo luminale brystepitelceller giver dem mulighed for at generere brystkirtler efter at være transplanteret i fedtplader. De EV'er / exosomer afledt af stamlignende brystepithelceller overfører brystkirtlen-dannende evne til EpCAM hi / CD49f luminale brystepithelceller.
Introduction
Eksosomer kan formidle cellulær kommunikation ved at overføre membran og cytosoliske proteiner, lipider og RNA'er mellem cellerne 1 . Eksosomemedieret kommunikation har vist sig at være involveret i mange fysiologiske og patologiske processer ( dvs. antigenpræsentation, udvikling af tolerance 2 og tumorprogression 3 ). Eksosomer har ofte indhold svarende til dem fra kildecellerne, der frigiver dem. Eksosomerne kan således bære specifikke celleegenskaber fra kildecellerne og overføre disse egenskaber til cellerne, der indtager dem 4 .
Eksosomer er 50- til 150 nm dobbeltlagsmembranvesikler og nuværende specifikke markører ( fx CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix og TSG101). Eksosomer skal således karakteriseres ved forskellige metoder til forskellige aspekter. Transmissionselektronmikroskopi kan bruges til at visualisere membranvesiklerSåsom eksosomer 4 , 5 . Nanoparticle tracking analysis (NTA) og dynamisk lysspredningsanalyse (DLS) anvendes til måling af størrelse og antal rensede exosomer 4 . Lipidmembranindholdet i exosomer kan verificeres ved densitetsgradient. Exosomale markører, såsom CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix og TSG101 6 , 7 , kan måles ved Western blotting.
Mammare basale celler har evnen til at generere brystkirtler, når de implanteres i fedtpuder, mens luminale celler ikke kan 8 , 9 , 10 . Således omtales også brystbasale celler som brystrepopulerende enheder. Ved anvendelse af modellen af basale og luminale celler fra brystet kan evnen af EV'er / exosomer til at overføre celleegenskaber mellem forskellige cellepopulationer undersøges. Dette arbejdeDemonstrerer fremgangsmåden til overførsel af kirteldannende evne fra brystbasale epithelceller til brystluminale epithelceller ved anvendelse af EV'er / exosomer afledt fra brystbasale epithelceller. Luminale brystepithelceller erhvervede basalcelleegenskaber efter indtagelse af EV'er / eksosomer udskilt fra basale celler og kan dernæst danne brystkirtler 4 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle undersøgelser, der involverer dyr, overholdt protokoller godkendt af Institutional Committee on Animal Care.
1. Ekstracellulær vesikel / exosomisolering og validering
- Kulturbrystepitelbasale celler, NAMEC 4 , med frisk, serumfrit medium fremstillet af 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM / F12 med natriumbicarbonat (0,2438%); EGF (5 ng / ml); Hydrocoritison (0,5 μg / ml); Insulin (5 μg / ml); Bovint hypofyseekstrakt (BPE; 35 μg / ml); Og GW627368X (1 μg / ml) i 15 cm skåle.
- Efter at have talt cellerne med et hæmocytometer, frø 1,2 x 10 6 celler i 12 ml medium pr. 15 cm skål på dag 0 i 4 dage 4 .
- Efter 4 dage i kultur centrifuger dyrkningsmediet ved 300 xg i 5 minutter ved anvendelse af en bordtemperscentrifuge. Overfør supernatanten til et konisk rør ( figur 1 ).
- Centrifuger supernatantenVed 2000 xg i 20 minutter i en bord-topcentrifuge. Overfør supernatanten til et ultracentrifugerør og forlad de døde celler og celleaffald ( figur 1 ).
- Centrifuger supernatanten ved 10.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Overfør supernatanten til et nyt ultracentrifugerør ( figur 1 ).
- Centrifuger supernatanten ved 110.000 xg i 60 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender EV / exosom pellet i PBS ( Figur 1 ).
- Centrifuger supernatanten ved 110.000 xg i 60 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten. Resuspender EV / exosom pellet i PBS ( Figur 1 ). Resuspender pelleten isoleret fra 240-480 ml NAMEC-konditioneret medium i 100 μl.
- Mål proteinkoncentrationen af EV-suspensionen med BCA-proteinassayet. Sørg for, at koncentrationen er omkring 20-40 μg / 100 μL. Opbevares ved -20 ° C tilYderligere analyse.
- Mål koncentrationen og størrelsen af EV'er / eksosomer ved hjælp af nanopartikelsporingsanalyse (NTA), som beskrevet tidligere af Gardiner et al. 11 . Fortynd evt. / Eksosomer (20 μg / 100 μl) med PBS til 10.000 gange for NTA-analyse.
BEMÆRK: Resultatet af NTA-analysen afspejler antallet og størrelsen af de analyserede vesikler. - Billedet af EV'er / exosomer med transmissionselektronmikroskopi (TEM), som tidligere beskrevet af Lin et al. 4 .
2. Exosome Oprensning Brug En Density Gradient
- Resuspender 110.000 g pellet fra trin 1.7 i 40% (w / v) iodixanol i PBS (2 ml). Overlejre blandingen i rækkefølge med alikvoter på 30%, 20%, 10% og 5% (vægt / volumen) iodixanol i PBS (2 ml hver) for at danne en densitetsgradient i et ultracentrifugerør.
- Centrifuger blandingen ved 200.000 xg i 8 timer ved 4 ° C.
- Saml hver gradientfraktion (10 fractions; 1 ml / fraktion) med en pipette fra toppen af røret.
- Analysér tilstedeværelsen af exosommarkører ( f.eks. CD81, CD9, CD63 og Tsg101) i hver fraktion ved SDS-PAGE 12 og Western blot. Indlæs 50 μl suspensioner af hver fraktion på en 10% gel indeholdende 0,1% (vægt / volumen) SDS og separér proteinerne i fraktioner med gelelektroforese.
- Overfør proteinerne fra en gel til en PVDF-membran og inkubér membranen med antistoffer mod exosommarkørerne ( f.eks. CD81, CD9, CD63 og Tsg101) og husholdningsprotein GAPDH natten over ( Tabel af materialer ) ved 4 ° C.
BEMÆRK: Resultatet identificerer den fraktion, der indeholder eksosomer.
3. Ekstracellulær vesikel / eksosomærkning
- Suspension EV'er / exosomer opnået i trin 1.7 i 10 μM carboxyfluoresceinsuccinimidyldiacetatester (CFSE) ved 20 μg exosomalt protein / 100 μl. Forbered en parallel prøve coOpnåelse af kun CFSE og PBS, behandlet på samme måde som en negativ kontrol for de senere EV / exosomoptagelsesassays. Lad blandingerne være ved 37 ° C i 30 minutter.
- Suspension EV'er / exosomer i 50x volumen PBS og centrifuger suspensionen ved 110.000 xg i 60 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender EV / exosom pellet i PBS. Gentag trin 3.2 en gang.
- Suspension EV'er / exosomer i PBS i en koncentration på 20 μg exosomalt protein / 100 μL og filtrer derefter EV'er / eksosomer gennem 0,22 μm membraner før tilsætning af EV'er / exosomer til cellerne.
4. Ekstracellulær Vesikel / Eksosomoptagelsesassay
- Til fremstilling af kulturmedium blandes 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM / F12 med natriumbicarbonat (0,2438%); EGF (5 ng / ml); Hydrocoritison (0,5 μg / ml); Insulin (5 μg / ml); Og BPE (35 μg / ml) 4 . Plad de humane brystepitheliale HMLE-celler i 6-brøndsretter (1 x 10 6 </ Sup> celler / brønd) en dag før EV / exosombehandling. Tilsæt 2 μg / ml CFSE-fluorescensmærkede EV'er / exosomer, opnået i trin 3.3, til dyrkningsmediet af HMLE-celler i 2-6 timer. Behandl HMLE-cellerne i den negative kontrolgruppe med det parallelle præparat, beskrevet i trin 3.1.
- Efter 2- til 6-timers inkubation vaskes cellerne to gange med 4 ml PBS ved stuetemperatur.
- Fjern cellerne med 0,25% trypsin i 10 minutter og suspender cellerne igen i PBS indeholdende 0,2% FBS. Mål EV / exosomoptagelsen fra fluorescensintensiteten i cellerne ved anvendelse af en fluorescenscelleanalysator 4 . Billed cellerne behandlet med EV'er / eksosomer eller den negative kontrol ved hjælp af konfokal mikroskopi.
BEMÆRK: Den grønne fluorescens i cellerne skyldes EV / eksosomoptagelsen. Se legenden om figur 6 for mikroskopindstillingerne.
5. Isolering af primære mus mammary epithelceller
- Dissect nummer 2, 3, 4 og 5 brystkirtler ( figur 2 ) fra 12 uger gamle jomfru C57BL / 6 mus ved hjælp af en saks og skær kirtlerne i små stykker (2 mm 2 ) ved hjælp af en barberkniv.
- Yderligere dissocierer opslæmningen af brystkirtler (fra 10 mus) i 60 minutter ved 37 ° C, 120 omdr./min. Omrøring med 50 ml DMEM / F12 indeholdende 0,2% kollagenase type IV, 0,2% trypsin, 5% FBS, 5 ug / ml gentamycin , Og 1x pen-strep.
- Pellet ned epithelialorganoiderne fra blandingen ved centrifugering ved 350 xg i 10 minutter.
- Suspension af epitelorganoiderne i 4 ml DMEM / F12 med 0,1 mg / ml DNase I i 5 minutter ved stuetemperatur. Tilsæt 6 ml DMEM / F12 til en endeligVolumen på 10 ml.
- Centrifug suspensionen ved 400 xg i 10 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten.
- Resuspender pelleten i 10 ml DMEM / F12. Centrifuger suspensionen, men ramt bremsen, når hastigheden når 400 x g. Kassér supernatanten.
BEMÆRK: Ved at ramme bremsen pelleteres epitheliale organoider hurtigt, mens fibroblaster, som enkelte celler, stadig forbliver i supernatanten. - Gentag trin 5.6 og 5.7 5-7 gange. Tilsæt en suspension af suspensionen til et hæmocytometer og kontroller derefter clearance af fibroblaster fra organoidblandingen under mikroskopi efter hver runde centrifugering ( figur 3 ).
- Plad organoiderne i den gelatinebelagte skål, opnået i trin 5.1, i 48 timer med DMEM / F12 indeholdende 1x ITS, 5% FBS, 50 μg / ml gentamycin, 10 ng / ml EGF og 1x penstrimmel.
- Efter 48 timer fjernes de flydende celler i kulturen ved at erstatte mediet med frisk dyrkningsmedium uden FBS (DMEM / F12 indeholdende 1x ITS, 50 μg / mL gentamycin, 10 ng / ml EGF og 1x pen-strep).
- Bekræft at et monolag af brystepithelceller migrerer og vokser ud fra de vedhæftede epitelorganoider i 3 dage.
6. Separation af primære mus-basale / luminale mamma-epithelceller
- Efter 3-dages kulturen skal musens primære brystceller afmonteres med en naturlig enzymblanding med proteolytisk og kollagenolytisk enzymaktivitet i 20 minutter. Neutraliser enzymaktiviteten med 5% FBS i PBS.
- Centrifug suspensionen ved 450 xg i 10 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten. Resuspender cellepellet i 5 mg / ml dispas i 20 minutter. Neutraliser enzymaktiviteten med 5% FBS i PBS.
- Centrifug suspensionen ved 450 xg i 10 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten.
- Cellerne suspenderes i 100 μl PBS med 0,2% FBS ved en koncentration på 10 7 celler / ml med den fortyndedeAnti-CD49f og anti-EpCAM antistoffer på is i 1 time i mørket.
- Vask cellerne med PBS og inkuber derefter cellerne med fluorophore-konjugeret sekundært antistof på is i 30 minutter i mørke.
- Vask og genopsæt cellerne i PBS med 0,2% FBS.
- Sorter EpCAM hi / CD49f lo luminale brystepitelceller på en celle sorter 4 .
7. Ekstracellulær vesikel / eksosbehandling
- Sæd den sorterede EpCAM hi / CD49f lo luminale brystepithelceller fra trin 6.7 på gelatinekovertede 6-brøndsretter (2 x 10 5 celler / brønd) og behandl dem derefter med PBS eller de 2 μg / ml NAMEC-afledte EV'er / exosomer Opnået i trin 1.7.
- For at sikre den biologiske effektivitet af EV'er / exosomer i langvarig kulturbehandling erstatter cellekulturmediet med frisk medium indeholdende PBS eller 2 μg / ml NAMEC-afledte EV'er / eksosomer hver anden dag. Split ikke musen primaRy luminale celler under 10-dages behandling.
8. Fedtpudeindsprøjtning af mammale epithelceller
- Bedøve en 3 ugers gammel C57BL / 6 mus med isofluoran 2-3% inhalerende middel.
- Anbring den bedøvede mus på ryggen. Fjern pelsen på midterunderlivet med en barberkniv / hårcreme og rengør operationen med tre alternerende cykler på 70% alkohol og povidon-iod.
- Lav et 1,5 cm lodret snit gennem huden langs det ventrale thorax-inguinale område med en saks og derefter skiftevis den højre og venstre fjerde fedtpude.
- Fjern hver fedtplade ved at fjerne kirtelparenchyma med saks. Find lymfeknudepunktet i fedtpuden og fjern derefter hele kirtlen parenchyma under lymfeknudepunktet.
BEMÆRK: To tredjedele af fedtpuden skal forblive på plads. - Fjern cellerne opnået fra trin 7.2 med en naturlig enzymblanding (se Materialetabellen ) med proteolytisk aNd kollagenolytisk enzymaktivitet i 10 minutter. Neutraliser enzymaktiviteten med 5% FBS i PBS.
- Centrifug suspensionen ved 450 xg i 10 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten. Tæl cellerne med et hæmocytometer og suspender cellerne i PBS i en koncentration, således at 15 μl indeholder den ønskede celledosis (10 4 -10 2 celle / pad).
- Injicer 15 μl af brystepitelcellesuspension i en fedtpude ved anvendelse af en 100 μl glassprøjte fastgjort til en 27G nål.
- Gentag trin 8.4-8.7 for fedtpuden på den anden side.
- Luk huden med sårklip.
9. Mammary Gland Whole Mount
- Euthaniser musen med CO 2 plus cervikal dislokation 8 uger efter celleindsprøjtningen (Trin 8.7).
- Lav et lodret snit gennem hudlaget fra thoracic region til inguinal regionen ved hjælp af en saks og derefter udsætte både højre og venstre 4. mAmmary fed pads. Fjern den fjerde mammakirtler ( figur 2 ).
- Spred fedtpadsene på glasmikroskop dias og fiks fadderne med Kahle's fixative (4% formaldehyd, 30% EtOH og 2% iseddikesyre) ved stuetemperatur natten over.
Forsigtig: Kahles fikseringsmiddel er en irritation. Udfør dette trin i en kemisk hætte. - Vask fedtpladerne i 250 ml 70% EtOH i 15 minutter og derefter i 250 ml dH20 i 5 minutter. Stiv fedtpladerne med karminaluminium (1 g carmin og 2,5 g aluminiumkaliumsulfat i 500 ml dH20) ved stuetemperatur natten over.
- Vask fedtpladerne med 250 ml 70% EtOH i 15 minutter, 250 ml 95% EtOH i 15 minutter og 250 ml 100% EtOH i 15 minutter.
- Rens fedtpladerne i xylen i dagevis og stop xyleninkubationen, når fedtpladerne bliver gennemsigtige.
Forsigtig: Xylen er en irritation. Udfør dette trin i en kemisk hætte. - Monter gliderne wiTh monteringsmedium og tage billeder (2.400 dpi) af fedtpladerne ved hjælp af en digital slide scanner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eftersom det har vist sig, at blokering af PGE2 / EP4-signalering udløser EV / exosom-frigivelse fra basallignende stamceller fra mammal 4 , fremlægger dette værk en fremgangsmåde til isolering af de inducerede EV'er / exosomer fra mammalepithelial basalcelle (NAMEC) -kultur. Da NAMEC'er dyrkes i serumfrit medium, er der ingen eksisterende EV'er / exosomer afledt af serum 13 . For celler dyrket i serumholdigt medium skal eksisterende eksosomer i mediet forrenses ved ultracentrifugering ved 110.000 xg, før mediet anvendes til dyrkning af kildecellerne til opsamling af EV'er / eksosomer 5 . EV'er / exosomer fra det 4 dage inducerede NAMEC-konditionerede medium kan isoleres fra 110.000 xg pellet ved differentiel ultracentrifugering som illustreret i figur 1 . Antallet og størrelsen af de isolerede vesikler i 110.000 xg pellEt kan måles ved hjælp af nanopartikelsporingsanalyse (NTA). Den 110.000 g pelletsfraktion isoleret ved differentiel ultracentrifugering indeholder hovedsageligt ~ 100 nm vesikler ( figur 4A ); Dette svarer til størrelsen af eksosomer (50-150 nm), der er rapporteret i litteraturen. Derudover viste TEM-analyse, at 110.000 g fraktioner af NAMEC-konditioneret medium indeholder rigelige membranvesikler ( figur 4B ). Skønt differentieret ultracentrifugering kan frembringe rimeligt rene exosomer, eliminerer følgende oprensningstrin ved anvendelse af en densitetsgradient yderligere forurenende stoffer ( fx proteinaggregater) 5 . I densitetsgradienten flyder eksosomer i gradienten på grund af lipidindholdet i vesiklen, medens proteinaggregater, hvis nogen, forbliver i bunden af gradienten. Hver del af gradienten opsamles til påvisning af exosom beslutningstagere ( fx CD81, CD63, CD9 og TSG101 , 7 ) ved Western blotting. Exosommarkører kan detekteres i fraktionen med ~ 20% iodixanol ( figur 5 ). Fraktionen indeholdende exosomer kan fortyndes med PBS og udsættes for 200.000 xg ultracentrifugering for at isolere exosomer. Den isolerede exosompellet vaskes en gang i PBS og resuspenderes derefter i PBS og opbevares ved -20 ° C til yderligere analyse.
Før måling af optagelsen af NAMEC-afledte EV'er / exosomer af den ikke-stamme-modstående del af brystepitelceller-HMLE-celler, skal EV'er / exosomer mærkes med et fluorescerende farvestof ( fx carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE)). En parallelprøve indeholdende kun CFSE men ingen EV / exosom behandles i samme mærkningsprocedure. Denne prøve er en negativ kontrol, der anvendes i følgende EV / eksosomoptagelsesassay for at afspejle effekten af en spormængde resterende fri CFSE farvestof. HMLE-celler dyrkes med CFSE-mærket, NAMEC-afledte EV'er / exosomer eller den negative kontrol i 2-6 timer og udsættes derefter for flowcytometri. Sammenlignet med de ubehandlede HMLE-celler udtrykker HMLE-cellerne, der dyrkes med den negative kontrol, et lidt højere CFSE-signal ( Figur 6A , rød linje versus orange linje), hvilket afspejler baggrundsniveauet for CFSE-signalering forårsaget af resterende fri CFSE, der er tilbage fra EV / exosom mærkningsproces. I sammenligning med de negative kontrolbehandlede HMLE-celler udtrykker HMLE-cellerne, der dyrkes med CFSE-mærkede, NAMEC-afledte exosomer et 10-fold højere CFSE-signal ( Figur 6A , blå linje versus rød linje), som skyldes den specifikke optagelse Af CFSE-mærket EV'er / exosomer. Optagelsen af CFSE-mærkede, NAMEC-afledte EV'er / exosomer af HMLE-celler kan også observeres ved konfokal mikroskopi. Mens de negative kontrolbehandlede HMLE-celler ikke udviser et CFSE-signal, optages NAMEC-afledte EV'er / exosomer af HMLE-celler kan observeres med CFSE-signalet under det konfokale mikroskop i CFSE-mærkede EV / exosombehandlede celler ( Figur 6B ).
For at vurdere, om NAMEC-afledte EV'er / exosomer kan overføre mammakirteldannende evne fra stamlignende mammale basale celler til brystluminale celler, isoleres først først luminale celler fra mamma-mammor for at muliggøre analyse af brystkirtledannelse hos mus. Musbrystepithelceller er isoleret fra 12 ugers gamle mus. Brystkirtlerne skæres i små stykker og dissocieres yderligere med collagenase og trypsin. De dissocierede epitheliale organoider og fibroblaster kan adskilles ved differentiel centrifugering som beskrevet i trin 5.7 og 5.8. I hver runde centrifugering bør pelleten i bunden af rørene indeholde hovedsagelig epithelialorganoider, og fibroblasterne og enkeltcellerne skal flyde i supernatanent. Sammenlignet med blandingen indeholdende både epithelialorganoider og fibroblaster inden differentialcentrifugeringen ( Figur 3 , øvre paneler) fjerner de seks centrifugeringsrunder de fleste fibroblaster og enkeltceller i blandingen ( Figur 3 , bundpanel).
Brøndepitelcellerne ( Figur 7 ) af epithelorganoiderne dissocieres yderligere under anvendelse af en naturlig enzymblanding med proteolytisk og collagenolytisk enzymaktivitet og dispaser til dannelse af enkeltceller i suspension. Sortering af encellesuspensionen ved ekspression af celleoverflade CD49f og EpCAM kan adskille brystluminale celler (EpCAM hi / CD49f lo ), basale basalceller (EpCAM lo / CD49f hi ) og ikke-epitelceller (EpCAM - ) ( Figur 8 ).
hi / CD49f lo luminale brystepitelceller dyrkes med NAMEC-afledte EV'er / exosomer i 10 dage, og de friske EV'er / exosomer og medium udskiftes hver anden dag. Efter EV / exosombehandling implanteres brystcellens luminale celler i musens fjerde brystfedtpude ( figur 2 ). Efter 8 uger isoleres de fede pads og farves til analyse af brystkirtledannelse ( figur 9 ). Behandlingen med inducerede NAMEC-afledte EV'er / exosomer gør det muligt for luminale celler at erhverve brystkirteldannende evne 4 . De NAMEC-afledte, EV / exosombehandlede brystluminale celler danner brystkirtler i musemuskler ( figur 9 ).
Figur 1: Illustration af ExtracellulaR vesikel / eksosom puri fi cationsmetode fra cellekulturmedium ved differentiel ultracentrifugering. Hastigheden og længden af hver centrifugering er angivet. Efter hver af de første tre centrifugeringer holdes supernatanten til det næste trin. Efter centrifugeringerne på 110.000 x g holdes pelletsene, og supernatanterne kasseres. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Mus Mammary Gland Anatomy. Mus har fem par brystkirtler, angivet med tallene 1-5, der er placeret i fedtpuden (rød) direkte under huden. Klik her for at se en større version af thEr figur.
Figur 3: Billeder af en blanding af epithelialorganoider og celler af fedtpuder før og efter differentieret centrifugering. Lysfiberbilleder af de isolerede fedtpadscelleblandinger før og efter differentieret centrifugering taget fra hæmocytometeret. Pilehoved: epithelialorganoider. Arrow: fibroblaster og enkeltceller. Skalestang = 0,5 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Vesikelstørrelse og koncentrationsanalyse af NAMEC110.000 xg pelletfraktion. Den 110.000 g pelletsfraktion af NAMEC-mediet er col Lectured og udsat for ( A ) nano-particle tracking analyse (NTA) og ( B ) transmissionelektron mikroskopi (TEM). Målestang = 1 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Påvisning af eksosomer i fraktioner af densitetsgradienten. Western blot-analyse af exosommarkører CD81, CD9, CD63 og Tsg101 og husholdningsgen GAPDH afslører 20% iodixanolfraktionen indeholdende exosomer. Klik her for at se en større version af denne figur.
55736fig6.jpg "/>
Figur 6: Påvisning af ekstracellulær vesikel / eksosomoptagelse ved hjælp af flowcytometri og konfokal mikroskopi. EV / eksosomoptagelse blev målt i HMLE-celler. CFSE-mærkede, NAMEC-afledte EV'er / exosomer og negativ kontrol tilsættes til de angivne kulturer i 6 timer. Efter inkubationen udsættes cellerne for ( A ) flowcytometri og ( B ) konfokal mikroskopi. CFSE'en (grøn, excitation / emission (nm): 492/517; mikroskoplaserlinje: 488) fluorescensintensiteter reagerer EV / exosomoptagelsen. Cellekerner farves med DAPI (blå; excitation / emission (nm): 358/461; mikroskoplaserlinie: 405), og plasmamembranerne farves med plasmamembranfarve (rød; excitation / emission (nm): 649/666; Mikroskoplaserlinie: 633; Se Materialebordet ). Confocal objektiv: HCX PL APO 63x / 1,40-0,60 Olie. Skalbjælke = 20 μm.Ad / 55736 / 55736fig6large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Billeder af vedhæftede epitelorganoider. Lysfiberbilleder af brystepithelceller dannet af cellerne, der migrerer og vokser ud af de vedhæftede epitelorganoider. Målestang = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Sortering af primære mus mammary epithelceller ved overflade EpCAM og CD49f. Musbrystepithelceller isoleret fra fedtpuder af 12 ugers gamle mus underkastes cellesorting. Mus mammary luminale celler beriges i EpCAM hi / CD49f lo population, markeret med den blå cirkel; Basale celler blev beriget i EpCAM lo / CD49f hi populationen, markeret med den røde cirkel. Ikke-epithelceller er markeret med den sorte boks i plottet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Mammekirteldannelse ved primære mus-luminale moderkammer. De primære mus EpCAM hi / CD49f lo luminale celler behandles med PBS eller de NAMEC-afledte EV'er / exosomer i cellekultur i 10 dage og implanteres i de rydde fedtpuder af 3 ugers gamle mus. Musene euthaniseres og nedtages efter 8 uger for at analysere brystkirtlen formtion. Skalbjælke = 0,75 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Procent | MFI af EpCAM | MFI af CD49f | |
| Bryst luminale celle | 0,437 | 4,57 x 10 4 | 8183 |
| (EpCAM hi / CD49f lo ) | |||
| Basal celle i munden | 0,09 | 5452 | 2,23 x 10 4 |
| (EpCAM lo / CD49f hi ) | |||
| Ikke-epitelCelle (EpCAM-) | 0,309 | 53 | 4619 |
Tabel 1: Procentdel og middelfluorescensintensitet (MFI) for populationerne beskrevet i figur 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksosomer har ofte karakteristika for de celler, der frigjorde dem, og mængden af frigivne exosomer kan induceres af stimuli 4 . Kultursmediet fra celler kan opsamles og udsættes for differentiel ultracentrifugering for EV / eksosomopsamling ( Figur 1 ). Der er i øjeblikket ingen generel aftale om en ideel metode til at isolere EV'er / eksosomer. Den optimale metode, der anvendes her, er blevet bestemt af downstream-applikationen 14 . Ultracentrifugering er en relativt hurtig metode til isolering af EV'er / exosomer, som kan bevare den biologiske aktivitet af EV'er / exosomer. Vesiklerne isoleret ved ultracentrifugering indeholder imidlertid i almindelighed en blanding af EV'er, som indeholder exosomer produceret via endosomale kamre og / eller vesikler frembragt via budding fra cellemembranen.
Ved at analysere størrelserne af vesikler med NTA ( figur 4A 15 .
Skønt differentieret ultracentrifugering kan anvendes til rensning af exosomer, bør en densitetsgradient anvendes til yderligere fjernelse af forureningen af proteinaggregater fra exosomvesiklerne i den isolerede 110.000 xg fraktion 5 fx CD81, CD63, CD9 og TSG101 6 , 7 ). Ved at analysere tilstedeværelsen af exosommarkører i fraktionerne af densitetsgradienten er det muligt at identificere exosomer i fraktionen med ~ 20% iodixanol ( figur 5 ). Flere eksosomarkører bør undersøges for at identificere exosomer i densitetsgradienten, da hver population af exosomer kan udtrykke forskellige exosommarkører 16 .
Optagelsen af EV'er / exosomer af celler kan måles under anvendelse af fluorescerende farvestof-mærket EV'er / exosomer. Antallet af celler, der indtager mærket EV'er / exosomer, kan måles ved hjælp af flowcytometri ( figur 6A ). At bekræfte, at fluoenRescens fra cellerne skyldes optagelsen af mærkede EV'er / exosomer, men ikke fra frit farvestof blev mønsteret af fluorescens undersøgt i cellerne ved anvendelse af mikroskopi. Konfokal mikroskopi viser, at mønsteret af fluorescens i de EV / exosombehandlede celler punkteres ( Figur 6B højre panel). De punkterede signaler skyldes sandsynligvis af mærket EV'er / exosomer, ikke fra fri fluorescens. De punkterede signaler i cellerne kan analyseres yderligere med struktureret belysnings superopløsningsmikroskopi, som har den højeste opløsning ved 85 nm 4 , 17 . Superopløsningsmikroskopi kan bekræfte, at punkterne er fra ~ 100 nm hule vesikler, der ligner exosomer 4 . Disse resultater antyder, at NAMEC-afledte exosomer kan indtages af brystepithelceller i kultur.
NAMEC-afledte EV'er / eksosomer bærer ofte molekyler ( fx proteiner og miRNA'er) essentielle for egenskaberne hos visse celler 1 . Dette antyder, at NAMEC-afledte EV'er / exosomer kan overføre egenskaberne af NAMEC'er ( fx brystkirteldannende evne) til deres epithelcelle-modparter. Da humane brystepithelceller ikke kan danne brystkirtler xenogent i musfedtpuder 18 , 19 , kan overførslen af kirteldannende evne undersøges ved anvendelse af primære mamma-epitelceller fra muse. Mus primærbryst EpCAM hi / CD49f lo luminale celler, der ikke danner brystkirtler, kan isoleres fra 6 uger gamle mus ( figur 7 og figur 8 ). De isolerede celler fra musfedtpuder kan opdeles i tre grupper ( dvs. EpCAM hi / CD49f lo luminale celler, EpCAM lo / CD49f hi basale celler og EpCAM - non-epitelceller) ved at undersøge leFlager af overflade EpCAM og CD49f ( figur 8 ). EpCAM lo / CD49f høje basale celler kan danne brystkirtler i fedtfadder, når de transplanteres i fedtpuder, men EpCAM hi / CD49f lo luminale celler kan ikke 4 . Således kan EpCAM hi / CD49f lo luminale cellepopulationen anvendes til at undersøge evnen af inducerede NAMEC-afledte EV'er / exosomer til at overføre brystkirtelsdannende evne. De isolerede EpCAM hi / CD49f lo luminale celler kan opbevares i kultur i 7-10 dage til EV / exosombehandling 4 . Det skal bemærkes, at at holde primære brystepitelceller in vitro i længere tid kan dæmpe cellernes levedygtighed.
De EV / exosombehandlede brystluminale celler kan implanteres i rydde fedtpuder for at analysere brystkirtlen-dannende evne. De fede puder af mus, der anvendes til implantation, skal ryddes ved 3 uger. ENT 3 uger gamle, brystepitelceller er begrænset til regionen mellem brystvorten og lymfeknuderne. Mammarepitel i en fedtpude kan ryddes ved at fjerne regionen mellem brystvorten og lymfet ved 3 uger. Mammary luminale celler implanteres umiddelbart efter rydning af fedtpuden, og kirteldannelsen af de implanterede celler kan analyseres 8 uger efter implanteringen. Effekten af NAMEC-afledte EV'er / exosomer ved overførsel af brystkirtlen-dannende evne til brystluminale celler kan evalueres ved kirteldannelsen af luminale celler og EV / eksosombehandlede luminale celler ( Figur 9 ). De inducerede EV'er / exosomer fra NAMEC'er bærer egenskaben af basale epithelceller i brystkirtlen - kirtlendannende evne - og de luminale celler, der indtager de inducerede EV'er / exosomer fra NAMEC'er, kan erhverve ejendommen fra NAMEC'er via EV'er / exosomer. Dette arbejde demonstrerer beviser, der viser, at molekyler, der er ansvarlige for EV / exosommedietTed overførsel af brystkirtlen formningsevne er til stede i lipidflåder af EV'er / exosomer 4 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Health Research Institutes (05A1-CSPP16-014, HJL) og fra ministeriet for videnskab og teknologi (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | Thermo | 1250062 | |
| Optima L-100K ultracentrifuge | Beckman | 393253 | |
| SW28 Ti Rotor | Beckman | 342204 | |
| SW41 Rotor | Beckman | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | NANOSIGHT LM10 | for nanoparticle tracking analysis (NTA) |
| Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). |
| CD81 antibody | GeneTex | GTX101766 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CD9 antibody | GeneTex | GTX100912 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CD63 antibody | Abcam | Ab59479 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| TSG101 antibody | GeneTex | GTX118736 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1:6,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | fluorescence cell analyzer | |
| collagenase Type IV | Thermo | 17104019 | |
| trypsin | Thermo | 27250018 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I3146 | a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite |
| accutase | ebioscience | 00-4555-56 | a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity |
| dispase | STEMCELL | 7913 | 5 mg/mL = 5 U/mL |
| anti-CD49f antibody | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| anti-EpCAM antibody | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | cell sorter | |
| carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs) | gifts from Dr. Robert Weinberg | ||
| permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-500 | |
| sodium bicarbonate | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| Hydrocoritisone | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE (bovine pituitary extract) | Hammod Cell Tech | 1078-NZ | |
| GW627368X | Cayman | 10009162 | |
| 15 cm culture dish | Falcon | 353025 | |
| table-top centrifuge | Eppendrof | Centrifuge 3415R | |
| ultracentrifuge tube | Beckman | 344058 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Corning | 46-013-CM | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | HT7700 | |
| gelatin | STEMCELL | 7903 | |
| 10 cm culture dish | Falcon | 353003 | |
| 6-well culture dish | Corning | 3516 | |
| female C57BL/6 mice | NLAC (National Laboratory Animal Center | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | BioWest | S01520 | |
| gentamycin | Thermo Fisher Scientific | 15710072 | |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| DNase I | 5PRIMER | 2500120 | |
| isofluorane | Halocarbon | NPC12164-002-25 | |
| formaldehyde | MACRON | H121-08 | |
| EtOH (Ethanol) | J.T. Baker | 800605 | |
| glacial acetic acid | Panreac | 131008.1611 | |
| aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | 12625 | |
| Xylene | Leica | 3803665 | |
| 0.22 μm membranes | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP Wound Clip Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask™ Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C10046 | plasma membrane stain |
References
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Boelens, M., et al. Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways. Cell. 159 (3), 499-507 (2014).
- Lin, M. C., et al. PGE2 /EP4 Signaling Controls the Transfer of the Mammary Stem Cell State by Lipid Rafts in Extracellular Vesicles. Stem Cells. , (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- György, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Olver, C., Vidal, M. Proteomic analysis of secreted exosomes. Subcell Biochem. 43, 99-131 (2007).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Prater, M. D., et al. Mammary stem cells have myoepithelial cell properties. Nat Cell Biol. 16 (10), 942-950 (2014).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Riches, A., Campbell, E., Borger, E., Powis, S. Regulation of exosome release from mammary epithelial and breast cancer cells - a new regulatory pathway. Eur J Cancer. 50 (5), 1025-1034 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), (2015).
- Outzen, H. C., Custer, R. P. Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. J Natl Cancer Inst. 55 (6), 1461-1466 (1975).
- Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. Int J Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).
