Summary
Este protocolo descreve métodos para purificar, quantificar e caracterizar vesículas extracelulares (EVs) / exossomos de células epiteliais mamárias não aderentes / mesenquimatosas e para utilizá-las para transferir a capacidade de formação de glândula mamária para células epiteliais mamárias luminal. EVs / exosomas derivados de células epiteliais mamárias semelhantes a tronco podem transferir esta propriedade celular para células que ingerem EVs / exossos.
Abstract
As células podem se comunicar através de exossos, vesículas extracelulares de 100 nm (VE) que contêm proteínas, lipídios e ácidos nucleicos. As vesículas extracelulares derivadas de células epiteliais mamárias não aderentes / mesenquimatosas (NAMEC) podem ser isoladas do meio NAMEC por ultracentrifugação diferencial. Com base na sua densidade, os VE podem ser purificados através de ultracentrifugação a 110 000 x g. A preparação EV a partir da ultracentrifugação pode ser mais separada usando um gradiente de densidade contínua para evitar a contaminação com proteínas solúveis. Os EVs purificados podem então ser mais avaliados usando a análise de rastreamento de nanopartículas, que mede o tamanho eo número de vesículas na preparação. As vesículas extracelulares com um tamanho variando de 50 a 150 nm são exossos. Os EVs / exosomas derivados de NAMEC podem ser ingeridos por células epiteliais mamárias, que podem ser medidas por citometria de fluxo e microscopia confocal. Algumas propriedades das células-tronco mamárias ( por exemplo, capacidade de formação de glândula mamária) podemSer transferido dos NAMECs de haste para células epiteliais mamárias através dos EVs / exossomos derivados de NAMEC. As células epiteliais primárias preliminares da EpCAM hi / CD49f lo luminal não podem formar glândulas mamárias após serem transplantadas para almofadas de gordura de ratos, enquanto as células epiteliais mamárias basais EpCAM lo / CD49f hi formam glândulas mamárias após o transplante. A absorção de EVs / exosomas derivados de NAMEC pelas células epiteliais mamárias EpCAM hi / CD49f lo luminal permite que elas gerem glândulas mamárias após serem transplantadas para almofadas de gordura. Os EVs / exossomos derivados de células epiteliais mamárias semelhantes a tronco transferem a capacidade formadora de glândula mamária para as células epiteliais mamárias EpCAM hi / CD49f lo luminal.
Introduction
Os exossos podem mediar a comunicação celular através da transferência de proteínas de membrana e citossolo, lipídios e RNAs entre as células 1 . A comunicação mediada por exosomo demonstrou estar envolvida em muitos processos fisiológicos e patológicos ( ie, apresentação de antígenos, desenvolvimento de tolerância 2 e progressão tumoral 3 ). Os exossomos geralmente têm conteúdos semelhantes aos das células-fonte que as liberam. Assim, os exossos podem transportar propriedades celulares específicas das células originais e transferir essas propriedades para as células que as ingerem 4 .
Os exossomos são vesículas de membrana de camada dupla de 50 a 150 nm e apresentam marcadores específicos ( por exemplo, CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix e TSG101). Assim, os exossomos devem ser caracterizados por vários métodos para diferentes aspectos. A microscopia eletrônica de transmissão pode ser usada para visualizar vesículas da membranaTais como os exossomos 4 , 5 . A análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e a análise dinâmica de dispersão de luz (DLS) são usadas para medir o tamanho eo número de exossomos purificados 4 . O conteúdo da membrana lipídica dos exossomos pode ser verificado por gradiente de densidade. Os marcadores exossais, como CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix e TSG101 6 , 7 , podem ser medidos por Western Blot.
As células basais mamárias têm a capacidade de gerar glândulas mamárias quando implantadas em almofadas de gordura, enquanto as células luminal não podem 8 , 9 , 10 . Assim, as células basais mamárias também são referidas como unidades de repovoamento mamário. Ao usar o modelo de células basais e luminales mamárias, a capacidade de EVs / exossomos para transferir características celulares entre diferentes populações celulares pode ser examinada. Este trabalhoDemonstra o método de transferir a capacidade de formação de glândulas de células epiteliais basais mamárias para células epiteliais luminales luminal utilizando EVs / exosomas derivados de células epiteliais basais mamárias. As células epiteliais mamárias luminal adquiriram propriedades das células basais após a ingestão de EVs / exossos secretados a partir de células basais e podem então formar glândulas mamárias 4 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todas as pesquisas envolvendo animais obedeceram aos protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados com Animais.
1. Isolação e Validação Extracelular da Vesícula / exossoma
- Células basais epiteliais mamárias culturais, NAMECs 4 , com meio fresco e sem soro feito de 500 mL de MCDB 170, pH 7,4 + 500 mL de DMEM / F12 com bicarbonato de sódio (0,2438%); EGF (5 ng / mL); Hidrocoríssona (0,5 μg / mL); Insulina (5 μg / mL); Extracto de pituitária bovina (BPE; 35 μg / mL); E GW627368X (1 μg / mL) em pratos de 15 cm.
- Depois de contar as células com um hemocitómetro, semente 1,2 x 10 6 células em 12 mL de meio por prato de 15 cm no dia 0 por 4 dias 4 .
- Após 4 dias em cultura, centrifugar o meio de cultura a 300 xg durante 5 min usando uma centrífuga de mesa. Transfira o sobrenadante para um tubo cônico ( Figura 1 ).
- Centrifugar o sobrenadanteA 2.000 xg por 20 min em uma centrífuga de mesa. Transfira o sobrenadante para um tubo de ultracentrífuga e deixe as células mortas e os detritos celulares ( Figura 1 ).
- Centrifugar o sobrenadante a 10 000 xg durante 30 min a 4 ° C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de ultracentrífuga ( Figura 1 ).
- Centrifugar o sobrenadante a 110 000 xg durante 60 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante e ressuspenda o sedimento EV / exossoma em PBS ( Figura 1 ).
- Centrifugar o sobrenadante a 110 000 xg durante 60 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante. Ressuspender o sedimento EV / exossomo em PBS ( Figura 1 ). Ressuspender o grânulo isolado de 240-480 mL de meio condicionado NAMEC em 100 μL.
- Medir a concentração de proteína da suspensão EV com o teste de proteína BCA. Certifique-se de que a concentração seja de cerca de 20-40 μg / 100 μL. Armazenar a -20 ° C paraAnálise posterior.
- Medir a concentração eo tamanho dos EVs / exosomas por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), conforme descrito anteriormente por Gardiner et al. 11 . Diluir os EVs / exossomos (20 μg / 100 μL) com PBS a 10.000 vezes para análise NTA.
NOTA: O resultado da análise NTA reflete o número e o tamanho das vesículas analisadas. - Imagem dos VE / exossos com microscopia eletrônica de transmissão (TEM), como descrito anteriormente por Lin et al 4 .
2. Exosome Purification Using a Density Gradient
- Ressuspender o grânulo de 110 000 g do passo 1.7 em iodixanol a 40% (p / v) em PBS (2 mL). Superponha a mistura em sequência com alíquotas de iodixanol a 30%, 20%, 10% e 5% (p / v) em PBS (2 mL cada) para formar um gradiente de densidade em um tubo de ultracentrífuga.
- Centrifugar a mistura a 200.000 xg por 8 h a 4 ° C.
- Coletar cada fração de gradiente (10 fracçõesOns; 1 mL / fração) com uma pipeta do topo do tubo.
- Analisar a presença de marcadores de exossomo ( por exemplo, CD81, CD9, CD63 e Tsg101) em cada fração por SDS-PAGE 12 e Western blot. Carregar 50 μL de suspensões de cada fração em um gel a 10% contendo 0,1% (p / v) de SDS e separar as proteínas em frações com eletroforese em gel.
- Transferir as proteínas de um gel para uma membrana de PVDF e incubar a membrana com anticorpos contra os marcadores de exossomo ( por exemplo, CD81, CD9, CD63 e Tsg101) e proteína GAPDH durante a noite ( Tabela de Materiais ) a 4 ° C.
NOTA: O resultado identifica a fração contendo exossomos.
3. Etiquetagem extracelular da vesícula / exosomo
- Suspender os EVs / exossomos, obtidos no passo 1.7, em 10 μM de éster de diacetato de succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE) a 20 μg de proteína exossomal / 100 μL. Prepare uma amostra paralela coMantendo apenas CFSE e PBS, processados da mesma maneira, como um controle negativo para os ensaios de absorção EV / exossomo posteriores. Deixe as misturas a 37 ° C durante 30 min.
- Suspenda os VE / exossos em 50x volume de PBS e centrifugue a suspensão a 110 000 xg durante 60 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante e ressuspenda o sedimento EV / exossoma em PBS. Repita o passo 3.2 uma vez.
- Suspender os EVs / exossomos em PBS a uma concentração de 20 μg de proteína exossomal / 100 μL e depois filtrar o EVs / exossos através de membranas de 0,22 μm antes de adicionar o EVs / exossomos às células.
4. Ensaio de absorção de vesícula extracelular / exosoma
- Para fazer um meio de cultura, misture 500 mL de MCDB 170, pH 7,4 + 500 mL de DMEM / F12 com bicarbonato de sódio (0,2438%); EGF (5 ng / mL); Hidrocoríssona (0,5 μg / mL); Insulina (5 μg / mL); E BPE (35 μg / mL) 4 . Placa as células HMLE epiteliais mamárias humanas em pratos de 6 poços (1 x 10 6 </ Sup> células / poço) um dia antes do tratamento EV / exossomo. Adicionar EVs / exosomo marcados com fluorescência CFSE de 2 μg / mL, obtidos no passo 3.3, ao meio de cultura das células HMLE por 2-6 h. Trate as células HMLE do grupo de controle negativo com a preparação paralela, descrita no passo 3.1.
- Após a incubação de 2 a 6 horas, lave as células duas vezes com 4 mL de PBS à temperatura ambiente.
- Descarte as células com 0,25% de tripsina durante 10 min e re-suspende as células em PBS contendo 0,2% de FBS. Medir a absorção EV / exosoma da intensidade de fluorescência nas células usando um analisador de células de fluorescência 4 . Imagem as células tratadas com EVs / exossomos ou o controle negativo usando microscopia confocal.
NOTA: A fluorescência verde nas células é causada pela absorção EV / exossoma. Veja a legenda da Figura 6 para as configurações do microscópio.
5. Isolamento das células epiteliais mamárias do mouse primário
- Disseca as glândulas mamárias dos números 2, 3, 4 e 5 ( Figura 2 ) de camundongos C57BL / 6 virgens fêmeas de 12 semanas que usam tesoura e corte as glândulas em pequenos pedaços (2 mm 2 ) usando uma navalha.
- Dissocie ainda mais a suspensão de glândulas mamárias (de 10 ratinhos) durante 60 minutos a 37 ° C, agitação de 120 rpm com 50 mL de DMEM / F12 contendo 0,2% de colagenase tipo IV, 0,2% de tripsina, 5% de FBS, 5 μg / mL de gentamicina , E 1x pen-strep.
- Granular os organoícidos epiteliais da mistura por centrifugação a 350 xg durante 10 min.
- Suspender os organoides epiteliais em 4 mL de DMEM / F12 com DNase I de 0,1 mg / mL durante 5 min à temperatura ambiente. Adicione 6 mL de DMEM / F12 a uma finalVolume de 10 mL.
- Centrifugue a suspensão a 400 xg durante 10 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento em 10 mL de DMEM / F12. Centrifugue a suspensão, mas aperte o freio quando a velocidade atinge 400 xg. Descarte o sobrenadante.
NOTA: Ao bater o freio, os organoídios epiteliais são rapidamente sedimentados, enquanto os fibroblastos, como células únicas, ainda permanecem no sobrenadante. - Repita o passo 5.6 e 5.7 5-7 vezes. Adicione uma gota da suspensão a um hemocitómetro e verifique a depuração dos fibroblastos da mistura orgânica sob microscopia após cada rodada de centrifugação ( Figura 3 ).
- Placa os organoides no prato revestido com gelatina, obtido no passo 5.1, durante 48 h com DMEM / F12 contendo 1x ITS, 5% de FBS, 50 μg / mL de gentamicina, 10 ng / mL de EGF e 1x pen-strep.
- Após 48 h, remova as células flutuantes na cultura substituindo o meio com meio de cultura fresco sem FBS (DMEM / F12 contendo 1x ITS, 50 μg / mL de gentamicina, 10 ng / mL de EGF e 1x pen-strep).
- Confirme que uma monocamada de células epiteliais mamárias migra e cresce a partir dos organoides epiteliais anexados em 3 dias.
6. Separação das células epiteliais mamárias basais / luminal primárias
- Após a cultura de 3 dias, separe as células mamárias primárias de murganho com uma mistura enzimática natural com atividade enzimática proteolítica e colagenolítica durante 20 min. Neutralize a atividade enzimática com 5% de FBS em PBS.
- Centrifugue a suspensão a 450 xg durante 10 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Ressuspender o sedimento celular em 5 mg / mL de dispase durante 20 min. Neutralize a atividade enzimática com 5% de FBS em PBS.
- Centrifugue a suspensão a 450 xg durante 10 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
- Re-suspendeu as células em 100 μL de PBS com 0,2% de FBS a uma concentração de 10 7 células / mL com o diluídoAnticorpos anti-CD49f e anti-EpCAM no gelo durante 1 h no escuro.
- Lavar as células com PBS e depois incubar as células com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo em gelo durante 30 min no escuro.
- Lavar e voltar a suspender as células em PBS com FBS a 0,2%.
- Classifique as células epiteliais mamárias EpCAM hi / CD49f lo luminal em um classificador celular 4 .
7. Extracelular Vesícula / tratamento com exossomos
- Semente as células epiteliais mamárias classificadas EpCAM hi / CD49f lo luminal a partir do passo 6.7 em pratos de 6 poços revestidos com gelatina (2 x 10 5 células / poço) e depois tratá-las com PBS ou EVs / exosomas derivados de NAMEC de 2 μg / mL Obtido no passo 1.7.
- Para garantir a eficácia biológica dos EVs / exossos no tratamento de cultura a longo prazo, substitua o meio de cultura de células com meio fresco contendo PBS ou 2 μg / mL de EVs / exosomas derivados de NAMEC a cada dois dias. Não divide o mouse primaCélulas luminal durante os 10 dias de tratamento.
8. Injeção de pilhas gordas de células epiteliais mamárias
- Anestesiar os camundongos C57BL / 6 fêmeas com 3 semanas de idade com isofluorano 2-3% inalante.
- Coloque o mouse anestesiado nas costas. Remova a pele no meio do abdômen com uma barbear / creme de cabelo e limpe o local da cirurgia com três ciclos alternados de 70% de álcool e povidona-iodo.
- Faça uma incisão vertical de 1,5 cm através da pele ao longo da região ventricular torácica-inguinal com tesoura e, em seguida, exponha alternadamente as 4ª almofadas de gordura mamária direita e esquerda.
- Limpe cada almofada de gordura removendo o parênquima da glândula com tesoura. Localize o nódulo linfático na almofada de gordura e, em seguida, remova todo o parênquima da glândula abaixo do nódulo linfático.
NOTA: Dois terços da almofada de gordura devem permanecer no lugar. - Descarte as células obtidas a partir do passo 7.2 com uma mistura enzimática natural (veja a Tabela de Materiais ) com proteolítico aE atividade enzimática colagenolítica durante 10 min. Neutralize a atividade enzimática com 5% de FBS em PBS.
- Centrifugue a suspensão a 450 xg durante 10 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Contar as células com um hemocitómetro e suspender as células em PBS a uma concentração tal que 15 μL contém a dose celular desejada (10 4 -10 2 células / almofada).
- Injetar 15 μL de suspensão de células epiteliais mamárias em uma almofada de gordura usando uma seringa de vidro de 100 μL anexada a uma agulha 27G.
- Repita as etapas 8.4-8.7 para a almofada de gordura do outro lado.
- Feche a pele com clipes de ferida.
9. Mammary Gland Whole Mount
- Eutanizar o mouse com luxação cervical CO 2 mais às 8 semanas após a injeção celular (Passo 8.7).
- Faça uma incisão vertical através da camada de pele da região torácica até a região inguinal usando uma tesoura e depois exponha o 4º m da direita e da esquerdaAlmofadas de gordura amaria. Remova as 4ª glândulas mamárias ( Figura 2 ).
- Espalhe as pastilhas de gordura em lâminas de microscópio de vidro e fixe as almofadas de gordura com o fixador de Kahle (4% de formaldeído, 30% de EtOH e 2% de ácido acético glacial) à temperatura ambiente durante a noite.
Atenção: o fixador de Kahle é irritante. Execute este passo em um capô químico. - Lavar as almofadas de gordura em 250 mL de EtOH a 70% durante 15 min e depois em 250 mL de dH2O durante 5 min. Manchar as almofadas de gordura com alumínio de carmim (1 g de carmin e 2,5 g de sulfato de alumínio e potássio em 500 mL de dH2O) à temperatura ambiente durante a noite.
- Lavar as almofadas de gordura com 250 mL de EtOH a 70% durante 15 minutos, 250 mL de EtOH a 95% durante 15 minutos e 250 mL de EtOH a 100% durante 15 min.
- Limpe as almofadas de gordura em xileno por dias e pare a incubação de xileno quando as pastilhas de gordura se tornam transparentes.
Atenção: o xileno é irritante. Execute este passo em um capô químico. - Monte os slides wiMedidor de montagem e tirar imagens (2.400 dpi) das almofadas de gordura usando um scanner de slide digital.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uma vez que foi demonstrado que o bloqueio da sinalização de PGE 2 / EP 4 desencadeia a liberação de EV / exossomo a partir de células-tronco basais semelhantes a mamas 4 , este trabalho apresenta um método para isolar os EVs / exosomas induzidos pela cultura de células basais epiteliais mamárias (NAMEC). Uma vez que os NAMECs são cultivados em meio isento de soro, não existem EVs / exossomos pré-existentes derivados do soro 13 . Para as células cultivadas em meio contendo soro, os exossos pré-existentes no meio devem ser pré-limpos por ultracentrifugação a 110 000 xg antes que o meio seja usado para cultura das células de origem para a coleta de EVs / exossomos 5 . Os EVs / exossomos do meio condicionado NAMEC induzido por 4 dias podem ser isolados a partir do sedimento de 110 000 xg por ultracentrifugação diferencial, como ilustrado na Figura 1 . O número e tamanho das vesículas isoladas na pílula de 110.000 xgE pode ser medido usando análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). A fração de pelota de 110.000 g isolada por ultracentrifugação diferencial contém principalmente vesículas de ~ 100 nm ( Figura 4A ); Isso corresponde ao tamanho dos exossos (50 - 150 nm) relatados na literatura. Além disso, a análise de TEM mostrou que 110.000 g de frações de meio NAMEC-condicionado contêm abundante vesícula de membrana ( Figura 4B ). Embora a ultracentrifugação diferencial possa gerar exossomos razoavelmente puros, o passo de purificação a seguir usando um gradiente de densidade elimina ainda mais os contaminantes ( por exemplo, agregados de proteína) 5 . No gradiente de densidade, os exossos flutuam no gradiente devido ao teor de lípido na vesícula, enquanto que os agregados de proteína, se houver, permanecem na parte inferior do gradiente. Cada fração do gradiente é coletada para a detecção de criadores de exossomo ( por exemplo, CD81, CD63, CD9 e TSG101 , 7 ) por western blot. Os marcadores exossomos podem ser detectados na fração com ~ 20% de iodixanol ( Figura 5 ). A fração contendo exossomas pode ser diluída com PBS e submetida a 200.000 xg de ultracentrifugação para isolar os exossos. O sedimento de exossoma isolado é lavado uma vez em PBS e depois é ressuspenso em PBS e armazenado a -20 ° C para posterior análise.
Antes de medir a absorção de EVs / exossomos derivados de NAMEC pela contrapartida não-tronco de células epiteliais mamárias - células HMLE - os EVs / exossomos devem ser rotulados com um corante fluorescente ( por exemplo, éster de succinimidil de carboxifluoresceína (CFSE)). Uma amostra paralela contendo apenas CFSE, mas nenhum EV / exossomo é processado no mesmo procedimento de rotulagem. Esta amostra é um controle negativo usado no seguinte teste de absorção de EV / exosomo para refletir o efeito de uma quantidade de traço de CFS livre residualE tinte. As células HMLE são cultivadas com EVs / exosomas derivados de NAMEC marcados com CFSE ou o controle negativo durante 2-6 h e são então submetidos a citometria de fluxo. Em comparação com as células HMLE não tratadas, as células HMLE cultivadas com o controle negativo expressam um nível ligeiramente maior de sinal CFSE ( Figura 6A , linha vermelha versus linha laranja), o que reflete o nível de fundo da sinalização CFSE causada por CFSE livre residual de Processo de rotulagem EV / exosoma. Além disso, em comparação com as células HMLE tratadas com controle negativo, as células HMLE cultivadas com exossomas derivados de NAMEC marcados com CFSE expressam um sinal CFSE 10 vezes maior ( Figura 6A , linha azul versus linha vermelha), que resulta da absorção específica De EVs / exosomas marcados com CFSE. A captação de EVs / exosomas derivados de NAMEC marcados com CFSE por células HMLE também pode ser observada por microscopia confocal. Embora as células HMLE tratadas com controle negativo não exibam um sinal CFSE, a aceitação de NAOs EVs / exosomas derivados de MEC por células HMLE podem ser observados com o sinal CFSE sob o microscópio confocal em células EV / exossomo com marcação CFSE ( Figura 6B ).
Para avaliar se os EVs / exosomas derivados de NAMEC podem transferir a capacidade de formação de glândula mamária de células basais mamárias como células tumorais mamárias, as células luminal mamárias de ratos são primeiro isoladas para permitir a análise da formação de glândula mamária em camundongos. As células epiteliais mamárias do mouse são isoladas a partir de camundongos de 12 semanas de idade. As glândulas mamárias são cortadas em pequenos pedaços e são ainda mais dissociadas com colagenase e tripsina. Os organoídios e fibroblastos epiteliais dissociados podem ser separados por centrifugação diferencial, como descrito nos passos 5.7 e 5.8. Em cada rodada de centrifugação, o grânulo na parte inferior dos tubos deve conter principalmente organoides epiteliais, e os fibroblastos e células individuais devem flutuar no sobrenadanteT. Em comparação com a mistura que contém tanto organoides epiteliais e fibroblastos antes da centrifugação diferencial ( Figura 3 , painéis superiores), as seis rodadas de centrifugação eliminam a maioria dos fibroblastos e células individuais na mistura ( Figura 3 , painel inferior).
As células epiteliais mamárias ( Figura 7 ) dos organoides epiteliais são ainda dissociadas usando uma mistura enzimática natural com atividade enzimática proteolítica e colagenolítica e dispase para gerar células isoladas em suspensão. A classificação da suspensão de célula única pela expressão da superfície celular CD49f e EpCAM pode separar as células luminal mamárias (EpCAM hi / CD49f lo ), células basais mamárias (EpCAM lo / CD49f oi ) e células não epiteliais (EpCAM - ) ( Figura 8 ).
hi / CD49f lo luminal são cultivadas com EVs / exossos derivados de NAMEC por 10 dias, e os EVs / exosomas e o meio frescos são substituídos a cada dois dias. Após o tratamento com EV / exosomo, as células luminal luminal são implantadas nas 4ª almofadas de gordura mamária ( Figura 2 ) de camundongos. Após 8 semanas, as almofadas de gordura são isoladas e coradas para a análise da formação de glândulas mamárias ( Figura 9 ). O tratamento com EVs / exosomas derivados de NAMEC induzidos permite que células luminal adquiram capacidade de formação de glândula mamária 4 . As células luminales mamárias tratadas com EVM / derivadas de NAMEC formam glândulas mamárias em almofadas de gordura de ratos ( Figura 9 ).
Figura 1: Ilustração das ExtracelularesR Vesicle / Exosome Puri fi cation Method from Cell Culture Medium por Ultracentrifugação diferencial. A velocidade e o comprimento de cada centrifugação são indicados. Após cada uma das três primeiras centrifugações, o sobrenadante é mantido para o próximo passo. Após as centrifugações de 110 000 × g, os grânulos são mantidos e os sobrenadantes são descartados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Anatomia da glândula mamária do mouse. Os ratos têm cinco pares de glândulas mamárias, indicadas pelos números 1-5, localizados nas almofadas de gordura (vermelho) diretamente debaixo da pele. Clique aqui para ver uma versão maiorÉ figura.
Figura 3: Imagens de uma mistura de organoides epiteliais e células de almofadas de gordura antes e depois da centrifugação diferencial. Imagens de campo brilhante das misturas de células de gordura isoladas antes e depois da centrifugação diferencial, retiradas do hemocitómetro. Arrowhead: organoids epiteliais. Flecha: fibroblastos e células isoladas. Barra de escala = 0,5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Tamanho da Vesícula e Análise de Concentração de NAMEC110,000 xg Fração de Pellets. A fração de pelotização de 110 000 g do meio NAMEC é col Selecionado e submetido a ( A ) análise de rastreamento de nano-partículas (NTA) e ( B ) microscopia de transmissão eletrônica (TEM). Barra de escala = 1 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Detecção de Exossos em Frações do Gradiente de Densidade. A análise de transferência de Western dos marcadores de exossomo CD81, CD9, CD63 e Tsg101 e o gene de limpeza GAPDH revela a fração de iodixanol a 20% contendo os exossos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
55736fig6.jpg "/>
Figura 6: Detecção de absorção de vesícula extracelular / exosoma por citometria de fluxo e microscopia confocal. A captação de EV / exosomo foi medida em células HMLE. Os EVs / exossomos e o controle negativo derivado de NSEEC e marcados com CFSE são adicionados às culturas indicadas durante 6 h. Após a incubação, as células são submetidas a ( A ) citometria de fluxo e ( B ) microscopia confocal. O CFSE (verde; excitação / emissão (nm): 492/517; linha do laser do microscópio: 488) intensidades de fluorescência refletem a absorção EV / exosoma. Os núcleos celulares são corados com DAPI (azul, excitação / emissão (nm): 358/461, linha laser do microscópio: 405) e as membranas plasmáticas são coradas com mancha de membrana plasmática (vermelho; excitação / emissão (nm): 649/666; Linha de laser do microscópio: 633; veja a Tabela de Materiais ). Lente objetiva confocal: HCX PL APO 63x / 1.40-0.60 Óleo. Barra de escala = 20 μm.Ad / 55736 / 55736fig6large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Imagens de Organoids Epiteliais Anexos. Imagens de campo brilhante de células epiteliais mamárias formadas pelas células que migram e crescem fora dos organoides epiteliais anexados. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Classificação das células epiteliais mamárias primárias por superfície EpCAM e CD49f. As células epiteliais mamárias de ratos isoladas de almofadas de gordura de camundongos de 12 semanas de idade são submetidas ao tipo de célulaIng. As células luminal mamárias do rato são enriquecidas na população EpCAM hi / CD49f lo , marcada com o círculo azul; As células basais foram enriquecidas na população EpCAM lo / CD49f hi , marcada com o círculo vermelho. As células não epiteliais são marcadas com a caixa preta na trama. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Formação de glândulas mamárias pelas células mamárias luminal primárias do mouse. As células primárias EpCAM hi / CD49f lo luminal do rato são tratadas com PBS ou os EVs / exosomas derivados de NAMEC em cultura celular durante 10 dias e implantados nas almofadas de gordura desmatadas de camundongos de 3 semanas de idade. Os ratos são sacrificados e necropsiados após 8 semanas para analisar a forma da glândula mamáriaAtion. Barra de escala = 0,75 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Percentagem | MFI da EpCAM | MFI do CD49f | |
| Célula luminal mamária | 0.437 | 4,57 x 10 4 | 8183 |
| (EpCAM oi / CD49f lo ) | |||
| Célula basal mamária | 0,09 | 5452 | 2,23 x 10 4 |
| (EpCAM lo / CD49f oi ) | |||
| Não epitelialCélula (EpCAM - ) | 0,309 | 53 | 4619 |
Tabela 1: Porcentagem e Intensidade Média de Fluorescência (IMF) das Populações descritas na Figura 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os exossomas geralmente carregam características das células que os liberaram e a quantidade de exosomas liberados pode ser induzida por estímulos 4 . O meio de cultura das células pode ser coletado e submetido a ultracentrifugação diferencial para a coleta de EV / exossomo ( Figura 1 ). Atualmente, não existe um acordo geral sobre um método ideal para isolar EVs / exossomos. O método ideal usado aqui foi determinado pelo aplicativo a jusante 14 . A ultracentrifugação é um método relativamente rápido para o isolamento de EVs / exossos, que podem preservar a atividade biológica dos EVs / exossomos. No entanto, as vesículas isoladas por ultracentrifugação geralmente contêm uma mistura de EVs, que contém exosomas produzidos através de compartimentos endossômicos e / ou vesículas produzidas por brotação a partir da membrana celular.
Ao analisar os tamanhos de vesículas com NTA ( Figura 4A 15 .
Embora a ultracentrifugação diferencial possa ser usada para purificar os exossos, um gradiente de densidade deve ser usado para remover ainda mais a contaminação dos agregados proteicos das vesículas de exossomo na fração isolada de 110.000 xg 5 por exemplo, CD81, CD63, CD9 e TSG101 6 , 7 ). Ao analisar a presença de marcadores de exossomo nas frações do gradiente de densidade, é possível identificar os exossos na fração com ~ 20% de iodixanol ( Figura 5 ). Os marcadores de exossomo múltiplos devem ser examinados para identificar os exossos no gradiente de densidade, uma vez que cada população de exossomos pode expressar diferentes marcadores de exossomo 16 .
A absorção de EVs / exossomos por células pode ser medida usando EVs / exosomas marcados com corantes fluorescentes. O número de células que ingerem EVs / exossos marcados pode ser medido por citometria de fluxo ( Figura 6A ). Para confirmar que o fluoA rescisão das células resulta da absorção de EVs / exossos marcados, mas não de corante livre, o padrão de fluorescência foi examinado nas células usando microscopia. A microscopia confocal mostra que o padrão de fluorescência nas células tratadas com EV / exossomo é pontual ( Figura 6B painel direito). Os sinais pontuais provavelmente resultam de EVs / exossos marcados, não de fluorescência livre. Os sinais pontuais nas células podem ser analisados adicionalmente com microscopia de super resolução de iluminação estruturada, que tem a resolução mais alta a 85 nm 4 , 17 . A microscopia de super resolução pode confirmar que os sinais pontuais são de vesículas ocos de ~ 100 nm, que se assemelham aos exossomos 4 . Estes resultados sugerem que os exossomos derivados de NAMEC podem ser ingeridos por células epiteliais mamárias em cultura.
Os EVs / exossomos derivados de NAMEC geralmente transportam moléculas ( por exemplo, proteínas eRNAs) essenciais para as características de certas células 1 . Isso sugere que EVs / exossomos derivados de NAMEC podem transferir as propriedades de NAMECs ( por exemplo, capacidade de formação de glândula mamária) para as suas homólogas de células epiteliais. Uma vez que as células epiteliais mamárias humanas não podem formar glândulas mamárias xenogeneicamente em almofadas de gordura de rato 18 , 19 , a capacidade de transferência de formação de glândulas pode ser examinada usando células epiteliais mamárias primárias de rato. As células mamárias primárias primárias de EpCAM hi / CD49f lo luminal, que não formam glândulas mamárias, podem ser isoladas de camundongos com 6 semanas de idade ( Figura 7 e Figura 8 ). As células isoladas das almofadas de gordura de mouse podem ser divididas em três grupos ( ou seja, células EpCAM hi / CD49f lo luminal, EpCAM lo / CD49f oi células basais e EpCAM - células não epiteliais) examinando o leVS de superfície EpCAM e CD49f ( Figura 8 ). As células basais EpCAM lo / CD49f hi podem formar glândulas mamárias em modas de gordura quando transplantadas para almofadas de gordura, mas as células EpCAM hi / CD49f lo luminal não podem 4 . Assim, a população celular EpCAM hi / CD49f lo luminal pode ser usada para examinar a capacidade de EVs / exosomas induzidos por NAMEC induzidos a transferir a capacidade formadora de glândula mamária. As células isoladas EpCAM hi / CD49f lo luminal podem ser mantidas em cultura durante 7-10 dias para o tratamento EV / exosoma 4 . Deve-se notar que manter as células epiteliais mamárias primárias in vitro por mais tempo pode atenuar a viabilidade das células.
As células luminárias mamárias tratadas com EV / exossomo podem ser implantadas em almofadas de gordura limpas para analisar a capacidade formadora de glândula mamária. As almofadas de gordura de ratos utilizados para implantação devem ser limpas às 3 semanas de idade. UMAT 3 semanas de idade, as células epiteliais mamárias são confinadas à região entre o mamilo e a linfa de uma almofada de gordura. O epitélio mamário em uma almofada gorda pode ser limpo removendo a região entre o mamilo e a linfa às 3 semanas de idade. As células luminal mamárias são implantadas imediatamente após a limpeza da almofada de gordura, e a formação das glândulas pelas células implantadas pode ser analisada às 8 semanas após a implantação. O efeito de EVs / exosomas derivados de NAMEC na transferência da capacidade de formação de glândula mamária para células luminales mamárias pode ser avaliado pela formação de glândulas luminal e células luminal tratadas por EV / exossomo ( Figura 9 ). Os EVs / exossomos induzidos por NAMECs possuem propriedade de células epiteliais basais da mama - capacidade de formação de glândulas - e as células luminal que ingerem EVs / exossos induzidos por NAMECs podem adquirir a propriedade de NAMECs via EVs / exossos. Este trabalho demonstra evidências que mostram que as moléculas responsáveis pela mídia EV / exossomoA transferência da capacidade de formação da glândula mamária está presente em jangadas lipídicas de EVs / exossomos 4 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por bolsas dos Institutos Nacionais de Pesquisa em Saúde (05A1-CSPP16-014, HJL) e do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | Thermo | 1250062 | |
| Optima L-100K ultracentrifuge | Beckman | 393253 | |
| SW28 Ti Rotor | Beckman | 342204 | |
| SW41 Rotor | Beckman | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | NANOSIGHT LM10 | for nanoparticle tracking analysis (NTA) |
| Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). |
| CD81 antibody | GeneTex | GTX101766 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CD9 antibody | GeneTex | GTX100912 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CD63 antibody | Abcam | Ab59479 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| TSG101 antibody | GeneTex | GTX118736 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1:6,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | fluorescence cell analyzer | |
| collagenase Type IV | Thermo | 17104019 | |
| trypsin | Thermo | 27250018 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I3146 | a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite |
| accutase | ebioscience | 00-4555-56 | a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity |
| dispase | STEMCELL | 7913 | 5 mg/mL = 5 U/mL |
| anti-CD49f antibody | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| anti-EpCAM antibody | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | cell sorter | |
| carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs) | gifts from Dr. Robert Weinberg | ||
| permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-500 | |
| sodium bicarbonate | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| Hydrocoritisone | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE (bovine pituitary extract) | Hammod Cell Tech | 1078-NZ | |
| GW627368X | Cayman | 10009162 | |
| 15 cm culture dish | Falcon | 353025 | |
| table-top centrifuge | Eppendrof | Centrifuge 3415R | |
| ultracentrifuge tube | Beckman | 344058 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Corning | 46-013-CM | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | HT7700 | |
| gelatin | STEMCELL | 7903 | |
| 10 cm culture dish | Falcon | 353003 | |
| 6-well culture dish | Corning | 3516 | |
| female C57BL/6 mice | NLAC (National Laboratory Animal Center | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | BioWest | S01520 | |
| gentamycin | Thermo Fisher Scientific | 15710072 | |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| DNase I | 5PRIMER | 2500120 | |
| isofluorane | Halocarbon | NPC12164-002-25 | |
| formaldehyde | MACRON | H121-08 | |
| EtOH (Ethanol) | J.T. Baker | 800605 | |
| glacial acetic acid | Panreac | 131008.1611 | |
| aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | 12625 | |
| Xylene | Leica | 3803665 | |
| 0.22 μm membranes | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP Wound Clip Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask™ Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C10046 | plasma membrane stain |
References
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Boelens, M., et al. Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways. Cell. 159 (3), 499-507 (2014).
- Lin, M. C., et al. PGE2 /EP4 Signaling Controls the Transfer of the Mammary Stem Cell State by Lipid Rafts in Extracellular Vesicles. Stem Cells. , (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- György, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Olver, C., Vidal, M. Proteomic analysis of secreted exosomes. Subcell Biochem. 43, 99-131 (2007).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Prater, M. D., et al. Mammary stem cells have myoepithelial cell properties. Nat Cell Biol. 16 (10), 942-950 (2014).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Riches, A., Campbell, E., Borger, E., Powis, S. Regulation of exosome release from mammary epithelial and breast cancer cells - a new regulatory pathway. Eur J Cancer. 50 (5), 1025-1034 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), (2015).
- Outzen, H. C., Custer, R. P. Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. J Natl Cancer Inst. 55 (6), 1461-1466 (1975).
- Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. Int J Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).
