Summary
Ce protocole décrit des méthodes pour purifier, quantifier et caractériser les vésicules extracellulaires (EV) / les exosomes provenant de cellules épithéliales mammaires non adhérentes / mésenchymateuses et pour les utiliser pour transférer la capacité de formation de glandes mammaires aux cellules épithéliales mammaires luminescentes. Les EV / exosomes dérivés de cellules épithéliales mammaires de type tige peuvent transférer cette propriété cellulaire vers des cellules qui ingerent les EV / exosomes.
Abstract
Les cellules peuvent communiquer via des exosomes, des vésicules extracellulaires de 100 nm (EV) qui contiennent des protéines, des lipides et des acides nucléiques. Les vésicules extracellulaires dérivées des cellules épithéliales mammaires non adhérentes / mésenchymateuses (NAMEC) peuvent être isolées à partir du milieu NAMEC par ultracentrifugation différentielle. Sur la base de leur densité, les EV peuvent être purifiés par ultracentrifugation à 110 000 x g. La préparation EV de l'ultracentrifugation peut être séparée davantage en utilisant un gradient de densité continue pour éviter la contamination par des protéines solubles. Les EV purifiés peuvent ensuite être évalués à l'aide d'une analyse de suivi des nanoparticules, qui mesure la taille et le nombre de vésicules dans la préparation. Les vésicules extracellulaires d'une taille allant de 50 à 150 nm sont des exosomes. Les EV / exosomes dérivés de NAMEC peuvent être ingérés par des cellules épithéliales mammaires, qui peuvent être mesurées par cytométrie de flux et microscopie confocale. Certaines propriétés de cellules souches mammaires ( p. Ex., Capacité de formation de glandes mammaires) peuventÊtre transféré des NAMEC de type tige aux cellules épithéliales mammaires via les EV / exosomes dérivés de NAMEC. Les cellules épithéliales mammaires primaires primaires isolées EpCAM hi / CD49f lo luminal ne peuvent pas former de glandes mammaires après avoir été transplantées dans des tampons à graisse de souris, tandis que les cellules épithéliales mammaires basiques EpCAM lo / CD49f hi forment des glandes mammaires après une transplantation. L'absorption des EV / exosomes dérivés de NAMEC par les cellules epitheliales mammaires EpCAM hi / CD49f lo luminal leur permet de générer des glandes mammaires après avoir été transplanté dans des graisses. Les EV / exosomes dérivés de cellules épithéliales mammaires de type tige transfèrent la capacité de formation de glandes mammaires aux cellules epitheliales mammaires EpCAM hi / CD49f lo luminal.
Introduction
Les exosomes peuvent méditer la communication cellulaire en transférant des protéines membranaires et cytosoliques, des lipides et des ARN entre les cellules 1 . La communication à médiation exosome a été démontrée comme impliquant de nombreux processus physiologiques et pathologiques ( ex: présentation de l'antigène, développement de la tolérance 2 et progression de la tumeur 3 ). Les exosomes ont souvent des contenus similaires à ceux des cellules sources qui les libèrent. Ainsi, les exosomes peuvent transporter des propriétés cellulaires spécifiques des cellules sources et transférer ces propriétés aux cellules qui les ingestion 4 .
Les exosomes sont des vésicules membranaires à double couche de 50 à 150 nm et présentent des marqueurs spécifiques ( p. Ex., CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix et TSG101). Ainsi, les exosomes doivent être caractérisés par diverses méthodes pour différents aspects. La microscopie électronique à transmission peut être utilisée pour visualiser les vésicules membranairesTels que les exosomes 4 , 5 . L'analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et l'analyse dynamique de la diffusion de la lumière (DLS) sont utilisées pour mesurer la taille et le nombre d'exosomes purifiés 4 . La teneur en membrane lipidique des exosomes peut être vérifiée par gradient de densité. Les marqueurs exosomaux, tels que CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix et TSG101 6 , 7 , peuvent être mesurés par Western Blot.
Les cellules basales mammaires ont la capacité de générer des glandes mammaires lorsqu'elles sont implantées dans des tampons à graisse, tandis que les cellules luminaires ne peuvent pas 8 , 9 , 10 . Ainsi, les cellules basales mammaires sont également appelées unités reproductrices mammaires. En utilisant le modèle de cellules mammaires basales et luminales, on peut examiner la capacité des EV / exosomes à transférer les caractéristiques cellulaires entre différentes populations cellulaires. Ce travailDémontre la méthode de transfert de la capacité de formation de glande des cellules épithéliales basales mammaires aux cellules épithéliales luminescales mammaires en utilisant EVs / exosomes dérivés de cellules épithéliales basales mammaires. Les cellules épithéliales mammaires luminal ont acquis des propriétés basales après l'ingestion d'EV / exosomes sécrétés à partir de cellules basales et peuvent alors former des glandes mammaires 4 .
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Protocol
Toutes les recherches impliquant des animaux ont respecté les protocoles approuvés par le Comité institutionnel sur les soins des animaux.
1. Isolation et validation de la vésicule extracellulaire / exosome
- Cellules basales épithéliales mammaires de culture, NAMEC 4 , avec un milieu frais exempt de sérum de 500 ml de MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml de DMEM / F12 avec du bicarbonate de sodium (0,2438%); EGF (5 ng / mL); Hydrocoritisone (0,5 μg / mL); Insuline (5 μg / mL); Extrait d'hypophyse bovine (BPE; 35 μg / mL); Et GW627368X (1 μg / mL) dans des plats de 15 cm.
- Après avoir compté les cellules avec un hémocytomètre, semmez 1,2 x 10 6 cellules dans 12 ml de milieu par plat de 15 cm le jour 0 pendant 4 jours 4 .
- Après 4 jours de culture, centrifuger le milieu de culture à 300 xg pendant 5 minutes en utilisant une centrifugeuse à table. Transférer le surnageant dans un tube conique ( Figure 1 ).
- Centrifuger le surnageantÀ 2 000 xg pendant 20 min dans une centrifugeuse à table. Transférer le surnageant dans un tube à ultracentrifugation et laisser les cellules mortes et les débris cellulaires ( Figure 1 ).
- Centrifuger le surnageant à 10 000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube ultracentrifugeuse ( Figure 1 ).
- Centrifuger le surnageant à 110 000 xg pendant 60 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension le granulat EV / exosome dans PBS ( Figure 1 ).
- Centrifuger le surnageant à 110 000 xg pendant 60 min à 4 ° C. Retirer le surnageant. Remettre en suspension la granulés EV / exosome dans PBS ( Figure 1 ). Remettre en suspension la pastille isolée de 240-480 ml de milieu conditionné NAMEC dans 100 μL.
- Mesurer la concentration en protéines de la suspension EV avec l'analyse des protéines BCA. Assurez-vous que la concentration est d'environ 20 à 40 μg / 100 μL. Conserver à -20 ° C pourAnalyse approfondie.
- Mesurer la concentration et la taille des EV / exosomes par analyse de suivi des nanoparticules (NTA), comme décrit précédemment par Gardiner et al. 11 . Diluer les EV / exosomes (20 μg / 100 μL) avec PBS à 10 000 fois pour l'analyse NTA.
NOTE: Le résultat de l'analyse NTA reflète le nombre et la taille des vésicules analysées. - Image des EV / exosomes avec microscopie électronique de transmission (TEM), comme décrit précédemment par Lin et al 4 .
2. Purification d'exosome à l'aide d'un gradient de densité
- Remettre en suspension la pastille de 110 000 g de l'étape 1.7 dans de l'iodixanol à 40% (p / v) dans du PBS (2 ml). Superposer le mélange en séquence avec des aliquotes d'iodixanol à 30%, 20%, 10% et 5% (p / v) dans du PBS (2 ml chacun) pour former un gradient de densité dans un tube à ultracentrifugation.
- Centrifuger le mélange à 200 000 xg pendant 8 h à 4 ° C.
- Recueillir chaque fraction de gradient (10 fractiOns; 1 ml / fraction) avec une pipette du haut du tube.
- Analyser la présence de marqueurs d'exosome ( p. Ex., CD81, CD9, CD63 et Tsg101) dans chaque fraction par SDS-PAGE 12 et Western blot. Charger 50 -LL de suspensions de chaque fraction sur un gel à 10% contenant 0,1% (p / v) de SDS et séparer les protéines en fractions par électrophorèse sur gel.
- Transférer les protéines d'un gel à une membrane de PVDF et incuber la membrane avec des anticorps contre les marqueurs d'exosome ( p. Ex., CD81, CD9, CD63 et Tsg101) et la protéine GAPDH pendant la nuit ( Tableau des matériaux ) à 4 ° C.
REMARQUE: le résultat identifie la fraction contenant des exosomes.
3. Étiquetage extracellulaire de la vésicule / exosome
- Suspendre les EV / exosomes, obtenus à l'étape 1.7, dans 10 μM d'ester de diacétate de succinimidyle de carboxyfluorescéine (CFSE) à 20 μg de protéine exosomale / 100 μL. Préparer un échantillon parallèle coNe réduisant que le CFSE et le PBS, traités de la même manière, comme un témoin négatif pour les tests d'absorption EV / exosome ultérieurs. Laisser les mélanges à 37 ° C pendant 30 min.
- Suspendre les EV / exosomes dans 50x volume de PBS et centrifuger la suspension à 110 000 xg pendant 60 minutes à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre à nouveau le culot EV / exosome dans du PBS. Répétez l'étape 3.2 une fois.
- Suspendre les EV / exosomes dans le PBS à une concentration de 20 μg de protéine exosomale / 100 μL, puis filtrer les EV / exosomes à travers des membranes de 0,22 μm avant d'ajouter les EV / exosomes aux cellules.
4. Essai extracellulaire de la vésicule / exosome
- Pour fabriquer un milieu de culture, mélanger 500 ml de MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml de DMEM / F12 avec du bicarbonate de sodium (0,2438%); EGF (5 ng / mL); Hydrocoritisone (0,5 μg / mL); Insuline (5 μg / mL); Et BPE (35 μg / mL) 4 . Placer les cellules HMLE épithéliales mammaires humaines dans des plats à 6 puits (1 x 10 6 </ Sup> cellules / puits) un jour avant le traitement EV / exosome. Ajouter des EV / exosome marqués par fluorescence CFSE de 2 μg / mL, obtenus à l'étape 3.3, au milieu de culture des cellules HMLE pendant 2 à 6 h. Traiter les cellules HMLE du groupe de contrôle négatif avec la préparation parallèle, décrite à l'étape 3.1.
- Après l'incubation de 2 à 6 heures, laver les cellules deux fois avec 4 ml de PBS à température ambiante.
- Détachez les cellules avec 0,25% de trypsine pendant 10 min et ré-suspendez les cellules dans du PBS contenant 0,2% de FBS. Mesurer l'absorption EV / exosome de l'intensité de fluorescence dans les cellules en utilisant un analyseur de cellules de fluorescence 4 . Image des cellules traitées avec EVs / exosomes ou le contrôle négatif à l'aide de microscopie confocale.
NOTE: La fluorescence verte dans les cellules est causée par l'absorption EV / exosome. Voir la légende de la figure 6 pour les paramètres du microscope.
5. Isolation des cellules épithéliales mammaires de la souris primaire
- Dissectionnez les glandes mammaires numéro 2, 3, 4 et 5 ( Figure 2 ) à partir de souris C57BL / 6 vierges femelles de 12 semaines utilisant des ciseaux et coupez les glandes en petits morceaux (2 mm 2 ) à l'aide d'un rasoir.
- Dissociez encore davantage la suspension de glandes mammaires (à partir de 10 souris) pendant 60 minutes à 37 ° C, une agitation de 120 tr / min avec 50 ml de DMEM / F12 contenant 0,2% de collagénase de type IV, 0,2% de trypsine, 5% de FBS, 5 μg / ml de gentamycine , Et 1x streptocoque.
- Pellet en descendant les organoïdes épithéliaux du mélange par centrifugation à 350 xg pendant 10 min.
- Suspendre les organoïdes épithéliaux dans 4 mL de DMEM / F12 avec 0,1 mg / mL d'ADNase I pendant 5 minutes à température ambiante. Ajouter 6 mL de DMEM / F12 à une finaleVolume de 10 ml.
- Centrifuger la suspension à 400 xg pendant 10 min à température ambiante et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension la pastille dans 10 mL de DMEM / F12. Centrifugez la suspension mais frappez le frein lorsque la vitesse atteint 400 x g. Jeter le surnageant.
REMARQUE: En frappant le frein, les organoïdes épithéliaux sont rapidement massés en pellets, tandis que les fibroblastes, en tant que cellules individuelles, restent encore sur le surnageant. - Répétez l'étape 5.6 et 5.7 5-7 fois. Ajouter une goutte de suspension à un hémocytomètre, puis vérifier le dégagement des fibroblastes du mélange organoïde sous microscopie après chaque cycle de centrifugation ( Figure 3 ).
- Placer les organoïdes dans le plat revêtu de gélatine, obtenu à l'étape 5.1, pendant 48 h avec DMEM / F12 contenant 1x ITS, 5% de FBS, 50 μg / ml de gentamycine, 10 ng / mL d'EGF et 1x stylo-streptococèses.
- Après 48 h, retirer les cellules flottantes dans la culture en remplaçant le milieu par un milieu de culture frais sans FBS (DMEM / F12 contenant 1x ITS, 50 μg / ml de gentamycine, 10 ng / mL EGF et 1x stylo-streptococèses).
- Confirmez qu'une monocouche de cellules épithéliales mammaires migre et se développe à partir des organoïdes épithéliaux attachés en 3 jours.
6. Séparation des cellules épithéliales mammaires basales / luminescales primaires
- Après la culture de 3 jours, détachez les cellules mammaires primaires de souris avec un mélange enzymatique naturel avec une activité enzymatique protéolytique et collagénolytique pendant 20 min. Neutraliser l'activité enzymatique avec 5% de FBS dans du PBS.
- Centrifuger la suspension à 450 xg pendant 10 min à température ambiante et jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot cellulaire dans une solution à 5 mg / ml pendant 20 min. Neutraliser l'activité enzymatique avec 5% de FBS dans du PBS.
- Centrifuger la suspension à 450 xg pendant 10 min à température ambiante et jeter le surnageant.
- Remis en suspension les cellules dans 100 ul de PBS avec 0,2% de FBS à une concentration de 10 7 cellules / mL avec le diluantAnticorps anti-CD49f et anti-EpCAM sur de la glace pendant 1 h dans l'obscurité.
- Lavez les cellules avec du PBS puis incupez les cellules avec un anticorps secondaire conjugué au fluorophore sur de la glace pendant 30 minutes dans l'obscurité.
- Laver et ré-suspendre les cellules dans du PBS avec 0,2% de FBS.
- Trier les cellules épithéliales mammaires EpCAM hi / CD49f lo luminal sur un trieur de cellules 4 .
7. Traitement extracellulaire de la vésicule / exosome
- Graisser les cellules epitheliales mammaires EpCAM hi / CD49f lo luminal triées de l'étape 6.7 sur des boîtes à 6 puits revêtues de gélatine (2 x 10 5 cellules / puits) puis les traiter avec du PBS ou des EV / exosomes dérivés de NAMEC de 2 μg / mL Obtenu à l'étape 1.7.
- Pour assurer l'efficacité biologique des EV / exosomes dans le traitement de culture à long terme, remplacer le milieu de culture cellulaire par un milieu frais contenant du PBS ou des EV / exosomes dérivés de NAMEC à 2 μg / mL tous les deux jours. Ne divisez pas la souris primaPendant les 10 jours de traitement.
8. Injection par graisse des cellules épithéliales mammaires
- Anesthésier une souris C57BL / 6 femelle de 3 semaines avec de l'isofluorane à 2-3% d'inhalation.
- Placez la souris anesthésiée sur son dos. Retirez la fourrure sur le milieu de l'abdomen avec un rasoir / crème capillaire et nettoyez le site chirurgical avec trois cycles alternatifs de 70% d'alcool et de povidone-iode.
- Faire une incision verticale de 1,5 cm à travers la peau le long de la région thoracique-inguinale ventrale avec des ciseaux et ensuite exposer alternativement les 4ème capsules de graisse mammaire droite et gauche.
- Effacez chaque coussinet gras en éliminant le parenchyme des glandes avec des ciseaux. Localisez le ganglion lymphatique dans le tampon gras, puis retirez le parenchyme de la glande entière au-dessous du ganglion lymphatique.
REMARQUE: les deux tiers de la graisse devraient rester en place. - Détachez les cellules obtenues à partir de l'étape 7.2 avec un mélange enzymatique naturel (voir le tableau des matériaux ) avec une protéolytique aNd activité enzymatique collagénolytique pendant 10 min. Neutraliser l'activité enzymatique avec 5% de FBS dans du PBS.
- Centrifuger la suspension à 450 xg pendant 10 min à température ambiante et jeter le surnageant. Compter les cellules avec un hémocytomètre et suspendre les cellules dans du PBS à une concentration telle que 15 μL contient la dose cellulaire souhaitée (10 4 -10 2 cell / pad).
- Injecter 15 μL de suspension de cellules épithéliales mammaires dans un tampon gras en utilisant une seringue en verre de 100 μl attachée à une aiguille 27G.
- Répétez les étapes 8.4-8.7 pour le tampon gras de l'autre côté.
- Fermez la peau avec des clips enroulés.
9. Mammale Gland Whole Mount
- Euthanaser la souris avec une dislocation cervicale CO 2 plus 8 semaines après l'injection cellulaire (étape 8.7).
- Faire une incision verticale à travers la couche de peau de la région thoracique à la région inguinale à l'aide de ciseaux, puis exposer les deux à droite et à gauche 4 mCoussinets gras gras. Enlevez les 4 th glandes mammaires ( Figure 2 ).
- Posez les coussinets gras sur les lames de microscope en verre et fixez les coussinets gras avec le fixateur de Kahle (4% de formaldéhyde, 30% d'EtOH et 2% d'acide acétique glacial) à température ambiante pendant une nuit.
Attention: le fixateur de Kahle est un irritant. Effectuez cette étape dans un capot chimique. - Laver les tampons gras dans 250 ml d'EtOH à 70% pendant 15 minutes puis dans 250 ml de dH 2 O pendant 5 min. Tachez les tampons gras avec de l'alun de carmin (1 g de carmin et 2,5 g de sulfate de potassium d'aluminium dans 500 ml de dH2O) à température ambiante pendant une nuit.
- Laver les tampons gras avec 250 ml d'EtOH à 70% pendant 15 min, 250 ml d'EtOH à 95% pendant 15 minutes et 250 ml d'EtOH à 100% pendant 15 min.
- Nettoyez les tampons gras dans le xylène pendant des jours et arrête l'incubation au xylène lorsque les graisses se transforment.
Attention: le xylène est un irritant. Effectuez cette étape dans un capot chimique. - Monter les diapositives avecÈme support de montage et prenez des images (2,400 ppp) des blocs de graisse à l'aide d'un scanner à glissière numérique.
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Representative Results
Comme il a été démontré que le blocage de la signalisation de PGE 2 / EP 4 déclenche la libération d'EV / exosome à partir de cellules souches basales de type mammaire 4 , ce travail présente une méthode pour isoler les EV / exosomes induits de la culture de cellules basales épithéliales mammaires (NAMEC). Étant donné que les NAMEC sont cultivés dans un milieu exempt de sérum, il n'existe pas d'EVs / exosomes préexistants dérivés du sérum 13 . Pour les cellules cultivées dans un milieu contenant du sérum, les exosomes préexistants dans le milieu doivent être pré-nettoyés par ultracentrifugation à 110 000 xg avant que le milieu ne soit utilisé pour cultiver les cellules sources pour la collecte d'EV / exosomes 5 . Les EVs / exosomes du milieu conditionné NAMEC induit par 4 jours peuvent être isolés à partir de la pastille de 110 000 xg par ultracentrifugation différentielle, comme illustré à la Figure 1 . Le nombre et la taille des vésicules isolées dans la pellicule de 110 000 xgEt peut être mesuré à l'aide d'une analyse de suivi des nanoparticules (NTA). La fraction de pastilles de 110 000 g isolée par ultracentrifugation différentielle contient principalement des vésicules de ~ 100 nm ( figure 4A ); Cela correspond à la taille des exosomes (50 - 150 nm) rapportés dans la littérature. De plus, l'analyse TEM a montré que des fractions de 110 000 g de milieu conditionné par NAMEC contiennent des vésicules membranaires abondantes ( figure 4B ). Bien que l'ultracentrifugation différentielle puisse générer des exosomes raisonnablement purs, l'étape de purification suivante utilisant un gradient de densité élimine encore les contaminants ( par exemple, les agrégats de protéines) 5 . Dans le gradient de densité, les exosomes flottent dans le gradient en raison de la teneur en lipides de la vésicule, tandis que les agrégats de protéines, le cas échéant, restent au bas du gradient. Chaque fraction du gradient est collectée pour la détection des exosomes ( p. Ex., CD81, CD63, CD9 et TSG101 , 7 ) par western blot. Les marqueurs d'exosome peuvent être détectés dans la fraction avec ~ 20% d'iodixanol ( Figure 5 ). La fraction contenant des exosomes peut être diluée avec du PBS et soumise à une ultracentrifugation de 200 000 xg pour isoler les exosomes. Le culot d'exosome isolé est lavé une fois dans du PBS, puis est remis en suspension dans du PBS et stocké à -20 ° C pour une analyse plus approfondie.
Avant de mesurer l'absorption d'EVs / exosomes dérivés de NAMEC par l'équivalent non-tige des cellules épithéliales mammaires - cellules HMLE - les EV / exosomes doivent être étiquetés avec un colorant fluorescent ( p. Ex., Ester de succinimidyl de carboxyfluorescéine (CFSE)). Un échantillon parallèle contenant seulement CFSE mais aucun EV / exosome n'est traité dans la même procédure d'étiquetage. Cet échantillon est un témoin négatif utilisé dans l'essai d'absorption EV / exosome suivant pour refléter l'effet d'une trace de SFC libre résiduelE colorant. Les cellules HMLE sont cultivées avec EVs / exosomes dérivés de NAMEC marqués au CFSE ou le témoin négatif pendant 2-6 h et sont ensuite soumis à une cytométrie en flux. Par rapport aux cellules HMLE non traitées, les cellules HMLE cultivées avec le contrôle négatif expriment un niveau légèrement plus élevé de signal CFSE ( Figure 6A , ligne rouge par rapport à la ligne orange), ce qui reflète le niveau de fond de la signalisation CFSE provoqué par le CFSE sans résidu à partir du Processus d'étiquetage EV / exosome. En outre, par rapport aux cellules HMLE traitées par traitement négatif, les cellules HMLE cultivées avec des exosomes dérivés de NAMEC marqués au CFSE expriment un signal CFSE 10 fois plus élevé ( figure 6A , ligne bleue par rapport à ligne rouge), qui résulte de l'absorption spécifique Des EV / exosomes étiquetés par CFSE. L'absorption d'EVs / exosomes dérivés de NAMEC et étiquetés par CFSE par des cellules HMLE peut également être observée par microscopie confocale. Alors que les cellules HMLE traitées contre le contrôle négatif ne présentent pas de signal CFSE, l'absorption de NALes EVs / exosomes dérivés de MEC par des cellules HMLE peuvent être observés avec le signal CFSE sous microscope confocal dans des cellules EV / exosome traité par CFSE ( Figure 6B ).
Pour évaluer si les EV / exosomes dérivés de NAMEC peuvent transférer la capacité de formation de glandes mammaires de cellules basales mammaires à cellules mammaires mammaires, les cellules luminescentes mammaires de souris sont isolées pour permettre l'analyse de la formation de glandes mammaires chez la souris. Les cellules épithéliales mammaires de souris sont isolées à partir de souris de 12 semaines. Les glandes mammaires sont coupées en petits morceaux et sont encore dissociées de la collagénase et de la trypsine. Les organoïdes et les fibroblastes épithéliaux dissociés peuvent être séparés par centrifugation différentielle, comme décrit aux étapes 5.7 et 5.8. Dans chaque cycle de centrifugation, la pastille au fond des tubes devrait contenir principalement des organoïdes épithéliaux, et les fibroblastes et les cellules individuelles devraient flotter sur le surnageantT. Par rapport au mélange contenant à la fois des organoïdes épithéliaux et des fibroblastes avant la centrifugation différentielle ( figure 3 , panneaux supérieurs), les six cycles de centrifugation éliminent la plupart des fibroblastes et des cellules individuelles dans le mélange ( figure 3 , panneau inférieur).
Les cellules épithéliales mammaires ( figure 7 ) des organoïdes épithéliaux sont encore dissociées en utilisant un mélange enzymatique naturel avec une activité et une activité enzymatiques protéolytiques et collagénolytiques pour générer des cellules individuelles en suspension. Le tri de la suspension monocellulaire par l'expression de la surface cellulaire CD49f et EpCAM peut séparer les cellules luminesnelles mammaires (EpCAM hi / CD49f lo ), les cellules basales mammaires (EpCAM lo / CD49f hi ) et les cellules non épithéliales (EpCAM - ) ( Figure 8 ).
hi / CD49f lo luminal sont cultivées avec EVs / exosomes dérivés de NAMEC pendant 10 jours, et les EV / exosomes et le milieu frais sont remplacés tous les deux jours. Après un traitement par EV / exosome, les cellules luminesnelles mammaires sont implantées dans les 4ème plaques de graisse mammaire ( Figure 2 ) de souris. Après 8 semaines, les blocs de graisse sont isolés et colorés pour l'analyse de la formation des glandes mammaires ( Figure 9 ). Le traitement par des EV / exosomes dérivés de NAMEC induit permet aux cellules luminaires d'acquérir une capacité de formation de glandes mammaires 4 . Les cellules luminescentes mammaires traitées par EVM / extravasées par NAMEC forment des glandes mammaires dans des tampons à graisse de souris ( Figure 9 ).
Figure 1: Illustration des extracellulesMéthode de purification de Vesicle / Exosome à partir du milieu de culture cellulaire par ultracentrifugation différentielle. La vitesse et la longueur de chaque centrifugation sont indiquées. Après chacune des trois premières centrifugations, le surnageant est conservé pour l'étape suivante. Après les centrifugations de 110 000 × g, les pastilles sont conservées et les surnageants sont éliminés. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Anatomie des glandes mammaires de la souris. Les souris ont cinq paires de glandes mammaires, indiquées par les nombres 1-5, situés dans les tampons gras (rouge) directement sous la peau. Cliquez ici pour voir une plus grande version deEst une figure.
Figure 3: Images d'un mélange d'organoïdes épithéliaux et de cellules de graisse avant et après centrifugation différentielle. Des images de champ lumineux des mélanges de cellules de graisse isolés avant et après centrifugation différentielle, prises à partir de l'hémocytomètre. Flèche: organoïdes épithéliaux. Flèche: fibroblastes et cellules individuelles. Barre d'échelle = 0,5 mm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Taille de la vésicule et analyse de concentration de NAMEC110,000 xg Fraction des pastilles. La fraction de granulés de 110 000 g du milieu NAMEC est col Sélectionné et soumis à ( A ) analyse de suivi de nanoparticules (NTA) et ( B ) microscopie électronique de transmission (TEM). Barre d'échelle = 1 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: Détection des exosomes dans les fractions du dégradé de densité. L'analyse Western Blot des marqueurs d'exosome CD81, CD9, CD63 et Tsg101 et le gène de ménage GAPDH révèle la fraction 20% iodixanol contenant les exosomes. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Figure 6: Détection de l'absorption de vésicule extracellulaire / exosome par cytométrie de flux et microscopie confocale. L'absorption EV / exosome a été mesurée dans les cellules HMLE. Les EV / exosomes et les témoins négatifs marqués par CFSE sont ajoutés aux cultures indiquées pendant 6 h. Après l'incubation, les cellules sont soumises à ( A ) cytométrie en flux et ( B ) microscopie confocale. Le CFSE (vert, excitation / émission (nm): 492/517; ligne laser du microscope: 488) les intensités de fl uorescence reflètent l'absorption EV / exosome. Les noyaux cellulaires sont colorés avec DAPI (bleu; excitation / émission (nm): 358/461; ligne laser au microscope: 405) et les membranes plasmatiques sont colorées avec une tache de membrane plasmatique (rouge; excitation / émission (nm): 649/666; Ligne laser au microscope: 633, voir la Table des matériaux ). Lentille d'objectif confocale: HCX PL APO 63x / 1.40-0.60 Huile. Barre d'échelle = 20 μm.Ad / 55736 / 55736fig6large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7: Images d'organoïdes épithéliales attachés. Des images de champ lumineux des cellules épithéliales mammaires formées par les cellules qui migrent et se développent à partir des organoïdes épithéliaux attachés. Barre d'échelle = 100 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8: Tri des cellules épithéliales mammaires primaires par surface EpCAM et CD49f. Les cellules épithéliales mammaires de souris isolées à partir de tampons gras de souris de 12 semaines sont soumises à un tri cellulaireIng. Les cellules luminescentes mammaires de la souris sont enrichies dans la population EpCAM hi / CD49f lo , marquée du cercle bleu; Les cellules basales ont été enrichies dans la population EpCAM lo / CD49f hi , marquée par le cercle rouge. Les cellules non épithéliales sont marquées avec la boîte noire dans l'intrigue. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 9: Formation de la glandes mammaires par les cellules mammaires luminescales principales de la souris. Les cellules tumorales primaires EpCAM hi / CD49f lo luminal sont traitées avec du PBS ou des EVs / exosomes dérivés de NAMEC dans une culture cellulaire pendant 10 jours et implantés dans les tampons gras de souris de 3 semaines. Les souris sont euthanasiées et nécropsées après 8 semaines pour analyser la forme des glandes mammairesAtion. Barre d'échelle = 0,75 cm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Pourcentage | IMF d'EpCAM | MFI de CD49f | |
| Cellule luminal mammaire | 0,437 | 4,57 x 10 4 | 8183 |
| (EpCAM hi / CD49f lo ) | |||
| Cellule basale mammaire | 0,09 | 5452 | 2,23 x 10 4 |
| (EpCAM lo / CD49f salut ) | |||
| Non épithélialeCellule (EpCAM - ) | 0,309 | 53 | 4619 |
Tableau 1: Pourcentage et intensité moyenne de fluorescence (IMF) des populations décrites à la figure 8.
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Discussion
Les exosomes portent souvent des caractéristiques des cellules qui les libèrent, et la quantité d'exosomes libérés peut être induite par des stimuli 4 . Le milieu de culture des cellules peut être collecté et soumis à une ultracentrifugation différentielle pour la collecte EV / exosome ( figure 1 ). Il n'existe actuellement aucun accord général sur une méthode idéale pour isoler EV / exosomes. La méthode optimale utilisée ici a été déterminée par l'application en aval 14 . L'ultracentrifugation est une méthode relativement rapide pour l'isolement des EV / exosomes, qui peut préserver l'activité biologique des EV / exosomes. Cependant, les vésicules isolées par ultracentrifugation contiennent généralement un mélange d'EVs, qui contiennent des exosomes produits via des compartiments endosomaux et / ou des vésicules produites par bourgeonnement à partir de la membrane cellulaire.
En analysant la taille des vésicules avec NTA ( Figure 4A 15 .
Bien que l'ultracentrifugation différentielle puisse être utilisée pour purifier les exosomes, un gradient de densité devrait être utilisé pour éliminer davantage la contamination des agrégats de protéines des vésicules d'exosome dans la fraction isolée de 110 000 xg 5 p. Ex. CD81, CD63, CD9 et TSG101 6 , 7 ). En analysant la présence de marqueurs d'exosome dans les fractions du gradient de densité, il est possible d'identifier les exosomes dans la fraction avec ~ 20% d'iodixanol ( Figure 5 ). Les marqueurs d'exosome multiples doivent être examinés pour identifier les exosomes dans le gradient de densité, car chaque population d'exosomes peut exprimer différents marqueurs d'exosome 16 .
L'absorption d'EV / exosomes par les cellules peut être mesurée à l'aide d'EVs / exosomes marqués par un colorant fluorescent. Le nombre de cellules contenant des EV / exosomes identifiés peut être mesuré par cytométrie en flux ( Figure 6A ). Pour confirmer que le fluoLe rayonnement des cellules résulte de l'absorption des EV / exosomes marqués mais pas du colorant libre, le modèle de fluorescence a été examiné dans les cellules en utilisant la microscopie. La microscopie confocale montre que le motif de fluorescence dans les cellules traitées par EV / exosome est ponctué ( Figure 6B panneau droit). Les signaux ponctuels proviennent probablement des EV / exosomes marqués, et non de la fluorescence libre. Les signaux ponctuels dans les cellules peuvent être analysés plus en profondeur avec une microscopie de super résolution à l'éclairage structuré, qui a la plus haute résolution à 85 nm 4 , 17 . La microscopie de super résolution peut confirmer que les signaux ponctuels proviennent de vésicules creuses de ~ 100 nm, qui ressemblent à des exosomes 4 . Ces résultats suggèrent que les exosomes dérivés de NAMEC peuvent être ingérés par des cellules épithéliales mammaires en culture.
Les EV / exosomes dérivés de NAMEC portent souvent des molécules ( p. Ex., Protéines et miARN) essentiels pour les caractéristiques de certaines cellules 1 . Cela suggère que les EV / exosomes dérivés de NAMEC peuvent transférer les propriétés des NAMEC ( par exemple, la capacité de formation de la glande mammaire) à leurs homologues de cellules épithéliales. Étant donné que les cellules épithéliales mammaires humaines ne peuvent pas former des glandes mammaires de manière xénogénétique dans des tampons en graisse de souris 18 , 19 , le transfert de capacité de formation de glandes peut être examiné à l'aide de cellules épithéliales mammaires primaires de souris. Les cellules primaires mammaires EpCAM hi / CD49f lo luminal, qui ne forment pas de glandes mammaires, peuvent être isolées à partir de souris de 6 semaines ( Figure 7 et Figure 8 ). Les cellules isolées des tampons à graisse de souris peuvent être divisées en trois groupes ( c.-à-d. Les cellules EpCAM hi / CD49f lo luminal, EpCAM lo / CD49f hi cellules basales et EpCAM - cellules non épithéliales) en examinant leVels de surface EpCAM et CD49f ( Figure 8 ). Les cellules basiques EpCAM lo / CD49f hi peuvent former des glandes mammaires dans les modes gras lorsqu'elles sont transplantées dans des tampons gras, mais les cellules luminescentes EpCAM hi / CD49f lo luminal ne peuvent pas 4 . Ainsi, la population cellulaire EpCAM hi / CD49f lo luminal peut être utilisée pour examiner la capacité des EV / exosomes dérivés de NAMEC induits à transférer la capacité de formation de glandes mammaires. Les cellules isolées EpCAM hi / CD49f lo luminal peuvent être conservées en culture pendant 7 à 10 jours pour le traitement EV / exosome 4 . Il convient de noter que le maintien des cellules épithéliales mammaires primaires in vitro pendant plus longtemps peut atténuer la viabilité des cellules.
Les cellules luminescentes mammaires traitées par EV / exosome peuvent être implantées dans des tampons gras effacés pour analyser la capacité de formation de la glande mammaire. Les graisses de souris utilisées pour l'implantation doivent être nettoyées à l'âge de 3 semaines. UNET 3 semaines d'âge, les cellules épithéliales mammaires sont confinées à la région entre le tétine et la lymphe d'un tampon gras. L'épithélium mammaire dans un tampon gras peut être éliminé en éliminant la région entre le tétine et la lymphe à l'âge de 3 semaines. Les cellules luminesnelles mammaires sont implantées juste après avoir nettoyé le tampon gras, et la formation des glandes par les cellules implantées peut être analysée au bout de 8 semaines après l'implantation. L'effet des EV / exosomes dérivés de NAMEC sur le transfert de la capacité de formation de glandes mammaires aux cellules luminaires mammaires peut être évalué par la formation des cellules luminaires et des cellules luminaires traitées par EV / exosome ( Figure 9 ). Les EVs / exosomes induits par les NAMEC portent la propriété des cellules épithéliales basales mammaires - capacité de formation des glandes - et les cellules luminaires qui ingèrent les EV / exosomes induits par les NAMEC peuvent acquérir la propriété des NAMEC via EV / exosomes. Ce travail démontre des preuves montrant que les molécules responsables de l'EV / exosome-mediaLe transfert de la capacité de formation des glandes mammaires est présent dans les radeaux lipidiques d'EV / exosomes 4 .
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions des Instituts nationaux de recherche en santé (05A1-CSPP16-014, HJL) et du Ministère de la science et de la technologie (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | Thermo | 1250062 | |
| Optima L-100K ultracentrifuge | Beckman | 393253 | |
| SW28 Ti Rotor | Beckman | 342204 | |
| SW41 Rotor | Beckman | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | NANOSIGHT LM10 | for nanoparticle tracking analysis (NTA) |
| Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). |
| CD81 antibody | GeneTex | GTX101766 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CD9 antibody | GeneTex | GTX100912 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CD63 antibody | Abcam | Ab59479 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| TSG101 antibody | GeneTex | GTX118736 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1:6,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | fluorescence cell analyzer | |
| collagenase Type IV | Thermo | 17104019 | |
| trypsin | Thermo | 27250018 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I3146 | a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite |
| accutase | ebioscience | 00-4555-56 | a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity |
| dispase | STEMCELL | 7913 | 5 mg/mL = 5 U/mL |
| anti-CD49f antibody | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| anti-EpCAM antibody | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | cell sorter | |
| carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs) | gifts from Dr. Robert Weinberg | ||
| permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-500 | |
| sodium bicarbonate | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| Hydrocoritisone | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE (bovine pituitary extract) | Hammod Cell Tech | 1078-NZ | |
| GW627368X | Cayman | 10009162 | |
| 15 cm culture dish | Falcon | 353025 | |
| table-top centrifuge | Eppendrof | Centrifuge 3415R | |
| ultracentrifuge tube | Beckman | 344058 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Corning | 46-013-CM | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | HT7700 | |
| gelatin | STEMCELL | 7903 | |
| 10 cm culture dish | Falcon | 353003 | |
| 6-well culture dish | Corning | 3516 | |
| female C57BL/6 mice | NLAC (National Laboratory Animal Center | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | BioWest | S01520 | |
| gentamycin | Thermo Fisher Scientific | 15710072 | |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| DNase I | 5PRIMER | 2500120 | |
| isofluorane | Halocarbon | NPC12164-002-25 | |
| formaldehyde | MACRON | H121-08 | |
| EtOH (Ethanol) | J.T. Baker | 800605 | |
| glacial acetic acid | Panreac | 131008.1611 | |
| aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | 12625 | |
| Xylene | Leica | 3803665 | |
| 0.22 μm membranes | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP Wound Clip Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask™ Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C10046 | plasma membrane stain |
References
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