Summary
Dit protocol beschrijft methoden voor het zuiveren, kwantificeren en karakteriseren van extracellulaire vesicles (EVs) / exosomen van niet-aanhechtende / mesenchymale mammary epitheelcellen en voor het gebruik ervan om het vermogen van de borstkanker te overdragen naar luminale mammary epitheelcellen. EV's / exosomen afgeleid van stamachtige mammale epitheelcellen kunnen deze celeigenschap overbrengen aan cellen die de EV's / exosomen innemen.
Abstract
Cellen kunnen communiceren via exosomen, ~ 100 nm extracellulaire vesicles (EV's) die proteïnen, lipiden en nucleïnezuren bevatten. Non-adherent / mesenchymale mammary epithelial cell (NAMEC) -gerelateerde extracellulaire vesicles kunnen worden geïsoleerd uit NAMEC medium via differentiële ultracentrifugatie. Op grond van hun dichtheid kunnen EV's worden gezuiverd via ultracentrifugatie bij 110.000 x g. De EV-bereiding uit ultracentrifugatie kan verder worden gescheiden door gebruik te maken van een continu dichtheidsgradiënt om verontreiniging met oplosbare eiwitten te voorkomen. De gezuiverde EV's kunnen vervolgens verder geëvalueerd worden met behulp van nanoparticle-tracking analyse, die de grootte en het aantal blaasjes in de bereiding meet. De extracellulaire blaasjes met een grootte van 50 tot 150 nm zijn exosomen. De NAMEC-afgeleide EV's / exosomen kunnen worden ingezet door mammale epitheelcellen, die kunnen worden gemeten door flowcytometrie en confocale microscopie. Sommige mammale stamcellen eigenschappen ( bijv. Membraanvormende vermogen) kunnenWorden overgebracht van de stamachtige NAMEC's naar epitheliale cellen via de NAMEC-afgeleide EV's / exosomen. Geïsoleerde primaire EpCAM hi / CD49f lo luminale mammary epithelialcellen kunnen geen mammaklieren vormen nadat ze in muizenvetpads zijn getransplanteerd, terwijl EpCAM lo / CD49f hi basale mammary epitheelcellen na de transplantatie membraan vormen. Toepassing van NAMEC-afgeleide EV's / exosomen door EpCAM hi / CD49f lo luminale mammary epithelialcellen stelt hen in staat om melkklippen te genereren na transplantatie in vetpads. De EV's / exosomen afgeleid van stamachtige mammale epitheelcellen overdragen de kliervormende vermogen van EpCAM hi / CD49f lo luminale mammary epitheelcellen.
Introduction
Exosomen kunnen cellulaire communicatie bemiddelen door membraan- en cytosolische eiwitten, lipiden en RNA's tussen cellen 1 over te brengen . Exosoomgemedieerde communicatie is aangetoond dat zij betrokken zijn bij veel fysiologische en pathologische processen ( dwz antigeenpresentatie, ontwikkeling van tolerantie 2 en tumorprogressie 3 ). Exosomen hebben vaak dezelfde inhoud als die van de broncellen die ze vrijmaken. Zo kunnen de exosomen specifieke celeigenschappen van de broncellen dragen en deze eigenschappen overbrengen naar de cellen die ze innemen 4 .
Exosomen zijn 50- tot 150 nm dubbellaagse membraan vesicles en aanwezige specifieke markers ( bijv. CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix en TSG101). Zo moeten exosomen worden gekenmerkt door verschillende methoden voor verschillende aspecten. Transmissie elektronenmicroscopie kan worden gebruikt om membraan vesicles te visualiserenZoals exosomen 4 , 5 . Nanoparticle tracking analyse (NTA) en dynamische lichtverspreiding analyse (DLS) worden gebruikt voor het meten van de grootte en het aantal gezuiverde exosomen 4 . Het lipidemembraangehalte van exosomen kan door dichtheidsgradiënt worden gecontroleerd. Exosomale markers, zoals CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix en TSG101 6 , 7 kunnen worden gemeten door Western blotting.
Mammary basale cellen hebben de mogelijkheid om mammekirtels te genereren wanneer ze in vetpads geïmplanteerd worden, terwijl luminale cellen niet kunnen 8 , 9 , 10 . Zo worden ook basaalcellen van mammoet ook aangeduid als mammografische repopulerende eenheden. Door gebruik te maken van het model van basale en luminale cellen van de mammoet kan het vermogen van EV's / exosomen om celkenmerken tussen verschillende celpopulaties over te dragen, worden onderzocht. Dit werkDemonstreert de werkwijze voor het overbrengen van kliervormend vermogen van basale epitheelcellen naar mammary luminale epitheelcellen door gebruik te maken van EV's / exosomen afgeleid van mammale basale epitheelcellen. Luminale mammary epithelialcellen verworven basale cel eigenschappen na de inname van EV's / exosomen afgescheiden van basale cellen en kunnen dan mammary klieren 4 vormen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle onderzoeken waarbij dieren betrokken zijn, voldoen aan protocollen die zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenwelzijn.
1. Extracellulaire Vesikel / Exosome Isolatie en Validatie
- Cultuur mammale epitheliale basale cellen, NAMECs 4 , met vers, serumvrij medium gemaakt van 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM / F12 met natriumbicarbonaat (0,2438%); EGF (5 ng / ml); Hydrocoritison (0,5 μg / ml); Insuline (5 μg / ml); Boviene hypofyse extract (BPE; 35 μg / ml); En GW627368X (1 μg / ml) in 15 cm gerechten.
- Na het tellen van de cellen met een hemocytometer, zaad 1,2 x 10 6 cellen in 12 ml medium per 15 cm gerecht op dag 0 gedurende 4 dagen 4 .
- Na 4 dagen in cultuur centrifugeer het kweekmedium bij 300 xg gedurende 5 minuten met behulp van een tafelcentrifuge. Breng de supernatant over naar een conische buis ( Figuur 1 ).
- Centrifugeer het supernatantGedurende 20 minuten bij 2000 xg in een tafelcentrifuge. Breng de supernatant over naar een ultracentrifugebuis en laat de dode cellen en celresten achter ( Figuur 1 ).
- Centrifugeer het supernatant bij 10.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Breng de supernatant over naar een nieuwe ultracentrifugebuis ( Figuur 1 ).
- Centrifugeer het supernatant bij 110.000 xg gedurende 60 minuten bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en resuspendeer de EV / exosome pellet in PBS ( Figuur 1 ).
- Centrifugeer het supernatant bij 110.000 xg gedurende 60 minuten bij 4 ° C. Verwijder de supernatant. Resuspendeer de EV / exosome pellet in PBS ( Figuur 1 ). Resuspendeer de pellet geïsoleerd van 240-480 ml NAMEC-geconditioneerd medium in 100 μl.
- Meet de eiwitconcentratie van de EV-suspensie met de BCA-eiwitassay. Zorg ervoor dat de concentratie ongeveer 20-40 μg / 100 μL bedraagt. Bewaren bij -20 ° C voorverdere analyse.
- Meet de concentratie en grootte van de EV's / exosomen door nanoparticle tracking analysis (NTA), zoals eerder beschreven door Gardiner et al. 11 . Verdun de EV's / exosomen (20 μg / 100 μL) met PBS tot 10.000 keer voor NTA-analyse.
OPMERKING: Het resultaat van de NTA-analyse weerspiegelt het aantal en de grootte van de geanalyseerde blaasjes. - Beeld de EV's / exosomen met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), zoals eerder beschreven door Lin et al. 4 .
2. Exosome zuivering met behulp van een dichtheidsgradiënt
- Resuspendeer de 110.000 g pellet uit stap 1.7 in 40% (w / v) iodixanol in PBS (2 ml). Plaats het mengsel in volgorde met een hoeveelheid van 30%, 20%, 10% en 5% (w / v) iodixanol in PBS (2 ml elk) om een dichtheidsgradiënt in een ultracentrifugebuis te vormen.
- Centrifugeer het mengsel bij 200.000 xg gedurende 8 uur bij 4 ° C.
- Verzamel elke gradiëntfractie (10 fractions; 1 ml / fractie) met een pipet uit de bovenkant van de buis.
- Analyseer de aanwezigheid van exosoommarkers ( bijv. CD81, CD9, CD63 en Tsg101) in elke fractie door SDS-PAGE 12 en Western blot. Loop 50 μl suspensies van elke fractie op een 10% gel bevattende 0,1% (w / v) SDS en scheid de eiwitten in fracties met gelelektroforese.
- Breng de eiwitten over van een gel naar een PVDF membraan en incubeer het membraan met antilichamen tegen de exosoommarkeringen ( bijv. CD81, CD9, CD63 en Tsg101) en huishoudelijke eiwit GAPDH overnacht ( Table of Materials ) bij 4 ° C.
OPMERKING: Het resultaat identificeert de fractie die exosomen bevat.
3. Extracellulaire Vesicle / Exosome Etikettering
- Schors de EVs / exosomen, verkregen in stap 1.7, in 10 μM carboxyfluoresceïne succinimidyldiacetaatester (CFSE) bij 20 μg exosomaal eiwit / 100 μl. Bereid een parallel monster coAlleen CFSE en PBS, op dezelfde wijze verwerkt, als een negatieve controle voor de latere EV / exosome opname assays. Laat de mengsels gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Schors de EV's / exosomen in 50x volume PBS en centrifugeer de suspensie bij 110.000 xg gedurende 60 minuten bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en resuspendeer de EV / exosome pellet in PBS. Herhaal stap 3.2 een keer.
- Suspenseer de EV's / exosomen in PBS bij een concentratie van 20 μg exosomale eiwit / 100 μl en filter vervolgens de EV's / exosomen door middel van 0,22 μm membranen voordat de EV's / exosomen aan de cellen worden toegevoegd.
4. Extracellulaire Vesikel / Exosome Opname Assay
- Om cultuurmedium te maken, meng 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM / F12 met natriumbicarbonaat (0,2438%); EGF (5 ng / ml); Hydrocoritison (0,5 μg / ml); Insuline (5 μg / ml); En BPE (35 μg / ml) 4 . Platte de HMLE-cellen van de menselijke mammary epitheel in 6-putjes (1 x 10 6 </ Sup> cellen / putjes) één dag voor EV / exosome behandeling. Voeg 2 μg / ml CFSE fluorescentie-gemerkte EVs / exosoom, verkregen in stap 3.3, toe aan het kweekmedium van de HMLE-cellen gedurende 2-6 uur. Behandel de HMLE-cellen van de negatieve controlegroep met de parallelle bereiding, beschreven in stap 3.1.
- Na de 2- tot 6-uur incubatie wassen de cellen tweemaal met 4 ml PBS bij kamertemperatuur.
- Verwijder de cellen met 0,25% trypsine gedurende 10 minuten en zet de cellen opnieuw op in PBS die 0,2% FBS bevat. Meet de EV / exosome opname uit de fluorescentie-intensiteit in de cellen met behulp van een fluorescentiecelanalysator 4 . Beeld de cellen die met EV's / exosomen worden behandeld of de negatieve controle met behulp van confocale microscopie.
OPMERKING: De groene fluorescentie in de cellen wordt veroorzaakt door de opname EV / exosome. Zie de legende van Figuur 6 voor de instellingen van de microscoop.
5. Isolatie van Primaire Muis Mammary Epithelial Cells
- Dissecteer de 2, 3, 4 en 5 borstklippen ( Figuur 2 ) van 12-jarige vrouwelijke C57BL / 6-muizen met behulp van een schaar en snijd de klieren in kleine stukken (2 mm 2 ) met een scheermes.
- Verdere dissociatie van de slurrie van borstklippen (van 10 muizen) gedurende 60 minuten bij 37 ° C, 120 rpm geroerd met 50 ml DMEM / F12 bevattende 0,2% collagenase type IV, 0,2% trypsine, 5% FBS, 5 ug / ml gentamycine , En 1x pen-streep.
- Pellet de epitheliale organoïden uit het mengsel door centrifugeren bij 350 xg gedurende 10 minuten.
- Suspensieer de epitheliale organoïden in 4 ml DMEM / F12 met 0,1 mg / ml DNase I gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 6 ml DMEM / F12 toe aan een finaleVolume van 10 ml.
- Centrifugeer de suspensie bij 400 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant weg.
- Resulteer de pellet in 10 ml DMEM / F12. Centrifugeer de vering maar sla de rem als de snelheid 400 x g bereikt. Gooi de supernatant weg.
OPMERKING: Door de rem te slaan worden epitheliale organoïden snel gepelletteerd, terwijl fibroblasten, als enkele cellen, nog in de supernatant blijven. - Herhaal stap 5.6 en 5.7 5-7 keer. Voeg een druppel van de suspensie toe aan een hemocytometer en controleer vervolgens de speling van fibroblasten uit het organoïde mengsel onder microscopie na elke centrifugeringsronde ( Figuur 3 ).
- Platte de organoïden in de gelatine gecoate schotel, verkregen in stap 5.1, gedurende 48 uur met DMEM / F12 die 1x ITS, 5% FBS, 50 μg / ml gentamycine, 10 ng / ml EGF en 1x penstrip bevatten.
- Na 48 uur verwijder de drijvende cellen in de kweek door het medium te vervangen door vers cultureel medium zonder FBS (FBSDMEM / F12 bevattende 1x ITS, 50 μg / ml gentamycine, 10 ng / ml EGF en 1x penstreep).
- Bevestig dat een monolaag van mammale epitheelcellen migreert en groeit uit de bijgevoegde epitheliale organoïden in 3 dagen.
6. Scheiding van Primaire Muis Basale / Luminale Mammary Epithelial Cells
- Na de 3-daagse cultuur, verwijder de muis primaire mammarycellen met een natuurlijk enzymmengsel met proteolytische en collageenolytische enzymactiviteit gedurende 20 minuten. Neutraliseer de enzymactiviteit met 5% FBS in PBS.
- Centrifugeer de suspensie bij 450 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant weg. Resuspendeer de celpellet in 5 mg / ml dispas gedurende 20 minuten. Neutraliseer de enzymactiviteit met 5% FBS in PBS.
- Centrifugeer de suspensie bij 450 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant weg.
- Zet de cellen opnieuw op in 100 μl PBS met 0,2% FBS bij een concentratie van 10 7 cellen / ml met de verdundeAnti-CD49f en anti-EpCAM antilichamen op ijs gedurende 1 uur in het donker.
- Was de cellen met PBS en incubeer vervolgens de cellen met fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam op ijs gedurende 30 minuten in het donker.
- De cellen in PBS wassen en opnieuw opschorten met 0,2% FBS.
- Sorteer de EpCAM hi / CD49f lo luminale mammary epitheelcellen op een cel sorter 4 .
7. Extracellulaire Vesikel / Exosome Behandeling
- Zet de gesorteerde EpCAM hi / CD49f lo luminale mammale epitheliale cellen uit stap 6.7 op gelatinecoated 6-putjes (2 x 10 5 cellen / putjes) en behandel ze vervolgens met PBS of de 2 μg / mL NAMEC-afgeleide EV's / exosomen Verkregen in stap 1.7.
- Om de biologische werkzaamheid van de EV's / exosomen te waarborgen in de langdurige cultuurbehandeling, vervang het celkweekmedium met vers medium die PBS bevat of 2 μg / ml NAMEC-afgeleide EV's / exosomen om de twee dagen. Verdeel de muis niet primaRij luminale cellen tijdens de 10-daagse behandeling.
8. Vetpasta Injectie Van Mammary Epithelial Cells
- Anesthetiseer een 3-jarige vrouwelijke C57BL / 6-muizen met isofluoraan 2-3% inhaleermiddel.
- Plaats de verdoofde muis op zijn rug. Verwijder de vacht op het middel van de buik met een scheermes / haarcrème en maak de operatieplaats schoon met drie alternatieve cycli van 70% alcohol en povidon-jodium.
- Maak een 1,5 cm verticale insnijding door de huid langs het ventrale thoracale inguinale gebied met een schaar en wissel dan de rechter en linker 4e dikke vetpads.
- Verwijder elk vetpaneel door het verwijderen van klierparenchyma met een schaar. Plaats de lymfeklieren in het vetpaneel en verwijder het hele klierparenchym onder het lymfeknoop.
OPMERKING: tweederde van het vetblok moet op zijn plaats blijven. - Verwijder de cellen die zijn verkregen uit stap 7.2 met een natuurlijk enzymmengsel (zie de Tabel van Materialen ) met proteolytische aEn collagenolytische enzymactiviteit gedurende 10 minuten. Neutraliseer de enzymactiviteit met 5% FBS in PBS.
- Centrifugeer de suspensie bij 450 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant weg. Tel de cellen met een hemocytometer en schud de cellen in PBS bij een concentratie, zodat 15 μL de gewenste celdosis bevat (10 4 -10 2 cel / pad).
- Spuit 15 μL van de epitheelcel suspensie in een vetpaneel met behulp van een 100 μL glazen spuit bevestigd aan een 27G naald.
- Herhaal de stappen 8.4-8.7 voor het vetpaneel aan de andere kant.
- Sluit de huid met wondklemmen.
9. Mammary Gland Whole Mount
- Euthanize de muis met CO 2 plus cervicale dislocatie na 8 weken na de celinjectie (stap 8.7).
- Maak een verticale snede door de huidlaag van het thoracale gebied naar het inguinale gebied met behulp van een schaar en laat dan zowel rechts als links 4e mAmmary dikke pads. Verwijder de 4e borstklieren ( figuur 2 ).
- Spreid de vetbladen op glasmicroscoopschuiven en maak de vetbladen met Kahle's fixatief (4% formaldehyde, 30% EtOH en 2% ijsazijn) bij kamertemperatuur 's nachts.
Let op: Kahle's fixative is een irritant. Doe deze stap in een chemische kap. - Was de vetbladen in 250 ml 70% EtOH gedurende 15 minuten en daarna gedurende 250 minuten in 250 ml dH20. Vlek de vetpadsjes met karminealuminium (1 g karmine en 2,5 g aluminiumkaliumsulfaat in 500 ml dH 2 O) bij kamertemperatuur 's nachts.
- Was de vetpadsjes gedurende 15 minuten met 250 ml 70% EtOH gedurende 250 minuten, 250 ml 95% EtOH en 250 ml 100% EtOH gedurende 15 minuten.
- Reinig de vetblokken in xyleen voor dagen en stop de xyleen incubatie wanneer de vetpadsjes transparant worden.
Let op: Xylene is een irritant. Doe deze stap in een chemische kap. - Monteer de glijbanen wiMontage medium en neem afbeeldingen (2.400 dpi) van de dikke pads met behulp van een digitale dia scanner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aangezien aangetoond is dat het blokkeren van PGE 2 / EP 4 signalering triggers EV / exosome vrijgave van basale basale stamcellen 4, presenteert dit werk een werkwijze voor het isoleren van de geïnduceerde EV's / exosomen uit mammary epithelial basal cell (NAMEC) cultuur. Aangezien NAMEC's worden gekweekt in serumvrij medium, zijn er geen bestaande EV's / exosomen afgeleid van serum 13 . Voor cellen die in serum bevattend medium worden gekweekt, moeten vooraf bestaande exosomen in het medium vooraf worden gereinigd door ultracentrifugatie bij 110.000 xg voordat het medium wordt gebruikt om de broncellen te cultiveren voor de verzameling van EV's / exosomen 5 . EV's / exosomen uit het 4 dagen geïnduceerde NAMEC-geconditioneerde medium kunnen geïsoleerd worden uit de 110.000 xg pellet door differentiële ultracentrifugatie, zoals geïllustreerd in Figuur 1 . Het aantal en de grootte van de geïsoleerde vesicles in de 110.000 xg pellEt kan worden gemeten met behulp van nanoparticle tracking analysis (NTA). De 110.000 g-pelletfractie geïsoleerd door differentiële ultracentrifugatie bevat voornamelijk ~ 100 nm vesicles ( Figuur 4A ); Dit komt overeen met de grootte van exosomen (50-150 nm) die in de literatuur is gerapporteerd. Daarnaast bleek dat TEM-analyse aantoonde dat 110.000 g fracties van NAMEC-geconditioneerd medium overvloedige membraanvezels bevatten ( Figuur 4B ). Hoewel de differentiële ultracentrifugatie redelijke zuivere exosomen kan genereren, elimineert de volgende purificatiestap met behulp van een dichtheidsgradiënt verder verontreinigingen (bijvoorbeeld eiwitaggregaten) 5 . In de dichtheidsgradiënt zweven exosomen in het gradiënt wegens het lipidegehalte in de vesikel, terwijl eiwitaggregaten, indien aanwezig, op de bodem van de gradiënt blijven. Elke fractie van het gradiënt wordt verzameld voor de detectie van exosome makers (bijvoorbeeld CD81, CD63, CD9 en TSG101 , 7 ) door Western Blotting. Exosome markers kunnen gedetecteerd worden in de fractie met ~ 20% iodixanol ( Figuur 5 ). De fractie die exosomen bevat kan worden verdund met PBS en onderworpen aan 200.000 xg ultracentrifugatie om de exosomen te isoleren. De geïsoleerde exosome pellet wordt 1 keer gewassen in PBS en wordt vervolgens geresuspendeerd in PBS en opgeslagen bij -20 ° C voor verdere analyse.
Alvorens de opname van NAMEC-afgeleide EV's / exosomen door de niet-stam tegenhanger van mammale epitheliale cellen-HMLE-cellen te meten, moeten de EV's / exosomen worden gemerkt met een fluorescerende kleurstof (bijvoorbeeld carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE)). Een parallelle steekproef die alleen CFSE bevat maar geen EV / exosoom wordt in dezelfde etiketteringsprocedure verwerkt. Dit monster is een negatieve controle die wordt gebruikt in de volgende EV / exosome opname test om het effect van een trace hoeveelheid residueel vrij CFS te weerspiegelenE kleurstof. HMLE-cellen worden gekweekt met CFSE-gemerkte, NAMEC-afgeleide EV's / exosomen of de negatieve controle gedurende 2-6 uur en worden vervolgens onderworpen aan stromingscytometrie. In vergelijking met de onbehandelde HMLE-cellen vertoonden de HMLE-cellen die met de negatieve controle zijn gekweekt, een iets hoger niveau van CFSE-signaal ( Figuur 6A , rode lijn versus oranje lijn), die het achtergrondniveau van CFSE-signalering veroorzaakt door resterende vrije CFSE weergeeft van de EV / exosome etiketteringsproces. Bovendien, in vergelijking met de negatieve controle behandelde HMLE cellen, expressieert de HMLE-cellen die zijn gekweekt met CFSE-gemerkte, NAMEC-afgeleide exosomen een 10-voudig hoger CFSE-signaal ( Figuur 6A , blauwe lijn versus rode lijn), die voortvloeit uit de specifieke opname Van CFSE-gemerkte EV's / exosomen. De opname van CFSE-gemerkte, NAMEC-afgeleide EV's / exosomen door HMLE-cellen kan ook waargenomen worden door confocale microscopie. Terwijl de negatieve controlebehandelde HMLE-cellen geen CFSE-signaal vertoonden, neemt de opname van NAMEC-afgeleide EV's / exosomen door HMLE-cellen kunnen waargenomen worden met het CFSE-signaal onder de confocale microscoop in CFSE-gemerkte EV / exosoombehandelde cellen ( Figuur 6B ).
Om te beoordelen of NAMEC-afgeleide EV's / exosomen het vermogen tot het vormen van een klierkanker van stamvormige basale cellen naar mammale luminale cellen kunnen overdragen, worden muizenluminale cellen eerst geïsoleerde om de analyse van de membraanvorming in muizen toe te laten. Muisvogelpitheelcellen worden geïsoleerd uit 12 week oude muizen. De borstklippen worden in kleine stukken gesneden en verder gescheiden met collagenase en trypsine. De gedissocieerde epitheliale organoïden en fibroblasten kunnen gescheiden worden door differentiële centrifugatie, zoals beschreven in stap 5.7 en 5.8. In elke centrifugeringsronde moet de pellet onderaan de buizen hoofdzakelijk epitheliale organoïden bevatten en de fibroblasten en enkele cellen zouden in de supernatan drijvent. In vergelijking met het mengsel dat zowel epitheliale organoïden als fibroblasten bevat vóór de differentiële centrifugatie ( Figuur 3 , bovenste panelen), verwijdert de zes centrifugeringscentra de meeste fibroblasten en enkele cellen in het mengsel ( Figuur 3 , onderpaneel).
De epitheelcellen van de mammografie ( Figuur 7 ) van de epitheliale organoïden worden verder gedissocieerd onder gebruikmaking van een natuurlijk enzymmengsel met proteolytische en collageenolytische enzymactiviteit en afgifte om enkele cellen in suspensie te genereren. Het sorteren van de enkelcelsuspensie door expressie van celoppervlak CD49f en EpCAM kan de luminale cellen van de mammoetcellen (EpCAM hi / CD49f lo ), basale basecellen (EpCAM lo / CD49f hi ) en niet-epitheliale cellen (EpCAM - ) ( Figuur 8 ).
hi / CD49f lo luminale mammary epitheelcellen worden 10 dagen lang met NAMEC afgeleide EV's / exosomen gekweekt en de verse EV's / exosomen en medium worden om de twee dagen vervangen. Na de EV / exosome behandeling worden de luminale cellen van de mammieren geïmplanteerd in de 4e mammary fat pads ( Figuur 2 ) van muizen. Na 8 weken worden de dikke pads geïsoleerd en gekleurd voor de analyse van de borstkankervorming ( Figuur 9 ). De behandeling met geïnduceerde NAMEC-afgeleide EV's / exosomen maakt het mogelijk om luminale cellen het vermogen van de kliervormende moleculen te verwerven 4 . De NAMEC-afgeleide, EV / exosome-behandelde luminale cellen van de mammieren vormen borstklippen in muizenvetpads ( Figuur 9 ).
Figuur 1: Illustratie van de extracellulaVesikel- / Exosome Puri fi catie Methode van Cell Culture Medium door Differentiële Ultracentrifugatie. De snelheid en lengte van elke centrifugatie worden aangegeven. Na elk van de eerste drie centrifugaties wordt de supernatant voor de volgende stap gehouden. Na de centrifugaties van 110.000 x g worden de pellets gehouden en de supernatanten weggegooid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Anatomie van de mamma's van de muisklier. Muizen hebben vijf paar mammoklippen, aangeduid met de cijfers 1-5, in de dikke pads (rood) direct onder de huid. Klik hier om een grotere versie van th te zienIs figuur.
Figuur 3: Beelden van een mengsel van epitheliale organoïden en cellen van vetpads voor en na differentiële centrifugatie. Heldere-fi-beelden van de geïsoleerde vetpadscelmengsels vóór en na differentiële centrifugatie, genomen uit de hemocytometer. Pijlpunt: epitheliale organoïden. Pijl: fibroblasten en enkele cellen. Schaalbalk = 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vesikelgrootte en Concentratie Analyse van NAMEC110.000 xg Pelletfractie. De 110.000 g pelletfractie van het NAMEC-medium is col Getekend en onderworpen aan ( A ) nano-particle tracking analyse (NTA) en ( B ) transmissie-elektronen microscopie (TEM). Schaalbalk = 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Detectie van exosomen in fracties van de dichtheidsgraadiënt. Western blot analyse van exosoommarkeringen CD81, CD9, CD63 en Tsg101 en huishoudingsgen GAPDH onthult de 20% iodixanolfractie die de exosomen bevat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
55736fig6.jpg "/>
Figuur 6: Detectie van Extracellulaire Vesicle / Exosome Opname door Flow Cytometry en Confocal Microscopy. EV / exosome opname werd gemeten in HMLE cellen. CFSE-gemerkte, NAMEC-afgeleide EV's / exosomen en negatieve controle worden gedurende 6 uur aan de aangegeven culturen toegevoegd. Na de incubatie worden de cellen onderworpen ( A ) flow cytometrie en ( B ) confocale microscopie. De CFSE (groen; excitatie / emissie (nm): 492/517; microscooplaserlijn: 488) lichtsterkteintensiteiten leiden tot de EV / exosome opname. Celkernen zijn gekleurd met DAPI (blauw; excitatie / emissie (nm): 358/461; Microscooplaserlijn: 405) en de plasmamembranen worden gekleurd met plasmamembraanvlek (rood; excitatie / emissie (nm): 649/666; Microscooplaserlijn: 633; zie de tabel van materialen ). Confocal objectieflens: HCX PL APO 63x / 1.40-0.60 Olie. Schaalbalk = 20 μm.Ad / 55736 / 55736fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 7: Beelden van Bijgesloten Epitheliale Organoïden. Heldere-fi-beelden van mammale epitheliale cellen die door de cellen worden gevormd, migreren en groeien uit de bijgevoegde epitheliale organoïden. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Sorteren van Primaire Muis Mammary Epithelial Cells door Oppervlakte EpCAM en CD49f. Muisvogelpitheelcellen die geïsoleerd zijn van vetpadsjes van 12-weken oude muizen worden onderworpen aan celsoorting. Muis-mammary luminale cellen worden verrijkt in de EpCAM hi / CD49f lo populatie, gemarkeerd met de blauwe cirkel; Basale cellen werden verrijkt in de EpCAM lo / CD49f hoge populatie, gemarkeerd met de rode cirkel. Niet-epitheelcellen worden gemarkeerd met de zwarte doos in het plot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Mammary Gland Formation door Primêre Muis Luminale Mammary Cells. De primaire muis EpCAM hi / CD49f lo luminale cellen worden gedurende 10 dagen met PBS of de NAMEC-afgeleide EV's / exosomen in de celkweek behandeld en geïmplanteerd in de gereinigde vetpadsjes van 3 weken oude muizen. De muizen worden na 8 weken geëuthaniseerd en ingewikkeld om de borstkankervorm te analyserenatie. Schaalbalk = 0,75 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Percentage | MFI van EpCAM | MFI van CD49f | |
| Mammale luminale cel | 0,437 | 4,57 x 10 4 | 8183 |
| (EpCAM hi / CD49f lo ) | |||
| Basale cel van de mamma | 0.09 | 5452 | 2,23 x 10 4 |
| (EpCAM lo / CD49f hi ) | |||
| Niet-epithelialeCel (EpCAM - ) | 0.309 | 53 | 4619 |
Tabel 1: Percentage en gemiddelde fluorescentieintensiteit (MFI) van de populaties die in Figuur 8 worden beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Exosomen dragen vaak eigenschappen van de cellen die hen vrijgegeven, en de hoeveelheid vrijgegeven exosomen kan door stimuli 4 worden geïnduceerd. Het kweekmedium van cellen kan worden verzameld en onderworpen aan differentiële ultracentrifugatie voor EV / exosoom-collectie ( Figuur 1 ). Er is momenteel geen algemene overeenstemming over een ideale methode om EV's / exosomen te isoleren. De hier gebruikte optimale methode is bepaald door de downstream applicatie 14 . Ultracentrifugatie is een relatief snelle methode voor de isolatie van EV's / exosomen, die de biologische activiteit van de EV's / exosomen kan behouden. Echter, de vesicles geïsoleerd door ultracentrifugatie bevatten in het algemeen een mengsel van EV's, die exosomen bevatten die worden geproduceerd via endosomale compartimenten en / of blaasjes die worden geproduceerd via het uitblazen van het celmembraan.
Door de grootte van vesicles met NTA te analyseren ( Figuur 4A 15 .
Hoewel diffractieve ultracentrifugatie kan worden gebruikt om exosomen te zuiveren, dient een dichtheidsgradiënt te worden gebruikt om de verontreiniging van eiwitaggregaten verder te verwijderen van de exosoomvezels in de geïsoleerde fractie van 110.000 xg 5 6 , 7 ). Door de aanwezigheid van exosoommarkers in de fracties van het dichtheidsgradiënt te analyseren, is het mogelijk om exosomen in de fractie met ~ 20% iodixanol te identificeren ( Figuur 5 ). Multiple exosome markers moeten worden onderzocht om exosomen in het dichtheidsgradiënt te identificeren, aangezien elke populatie van exosomen verschillende exosoommarkers kan uitdrukken 16 .
De opname van EV's / exosomen door cellen kan worden gemeten met behulp van fluorescerende kleurstof-gemerkte EV's / exosomen. Het aantal cellen die geëtiketteerde EV's / exosomen invoert, kan worden gemeten door flowcytometrie ( Figuur 6A ). Om te bevestigen dat de fluoRescentie van de cellen resulteert uit de opname van gemerkte EV's / exosomen, maar niet van vrije kleurstof, het patroon van fluorescentie werd onderzocht in de cellen met behulp van microscopie. Confocal microscopie laat zien dat het patroon van fluorescentie in de EV / exosoombehandelde cellen punctueert ( Figuur 6B rechter paneel). De punctate signalen komen waarschijnlijk voort uit geëtiketteerde EV's / exosomen, niet van vrije fluorescentie. De punctate signalen in de cellen kunnen verder worden geanalyseerd met gestructureerde verlichting superresolutie microscopie, die de hoogste resolutie heeft op 85 nm 4 , 17 . Super-resolutie microscopie kan bevestigen dat de punctate signalen zijn van ~ 100 nm holle blaasjes, die op exosomen 4 lijken. Deze resultaten suggereren dat NAMEC-afgeleide exosomen kunnen worden ingenomen door mammale epitheelcellen in cultuur.
NAMEC-afgeleide EV's / exosomen dragen vaak moleculen ( bijv. Eiwitten en miRNA's) essentieel voor de kenmerken van bepaalde cellen 1 . Dit suggereert dat NAMEC-afgeleide EV's / exosomen de eigenschappen van NAMEC's ( bv. Borstkankervormende vermogen) kunnen overdragen aan hun epitheliale cel tegenhangers. Aangezien menselijke epitheelcellen van de mens niet xenogeen kunnen vormen in muizenvetpads 18 , 19 , kan de overdracht van kliervormend vermogen worden onderzocht met gebruikmaking van muizen primaire mammary epitheelcellen. Muis primaire mammatoire EpCAM hi / CD49f lo luminale cellen, die geen mammale klieren vormen, kunnen geïsoleerd worden uit 6 weken oude muizen ( Figuur 7 en Figuur 8 ). De geïsoleerde cellen uit muisvetpads kunnen worden verdeeld in drie groepen ( dwz EpCAM hi / CD49f lo luminale cellen, EpCAM lo / CD49f hi basale cellen en EpCAM - niet-epitheelcellen) door de leVellen van het oppervlak EpCAM en CD49f ( Figuur 8 ). EpCAM lo / CD49f Hi basale cellen kunnen dikke klieren in vetvlekken vormen wanneer ze in vetpads worden getransplanteerd, maar EpCAM hi / CD49f lo luminale cellen kunnen niet 4 . Zo kan de EpCAM hi / CD49f lo luminale celpopulatie gebruikt worden om het vermogen van geïnduceerde NAMEC-afgeleide EV's / exosomen te onderzoeken om het vermogen van de moederkliervorming te overdragen. De geïsoleerde EpCAM hi / CD49f lo luminale cellen kunnen gedurende 7-10 dagen in de cultuur gehouden worden voor de EV / exosome behandeling 4 . Opgemerkt moet worden dat het in stand houden van primaire mammale epitheelcellen langer in vitro de levensvatbaarheid van de cellen kan verzwakken.
De EV / exosoombehandelde luminale cellen van de mammoet kunnen geïmplanteerd worden in gewiste vetpadsjes om het membraanvormende vermogen te analyseren. De dikke pads van muizen die gebruikt worden voor implantatie moeten op 3 weken oud worden verwijderd. EENT 3 weken oud, zijn epitheelcellen van de mammieren beperkt tot het gebied tussen de tepel en de lymf van een vetpaneel. Mammary epithelium in een vetblok kan worden gewist door het gebied tussen de tepel en de lymf bij 3 weken oud te verwijderen. Mammary luminale cellen worden onmiddellijk geïmplanteerd nadat het vetpaneel is gewist en de kliervorming door de geïmplanteerde cellen kan 8 weken na de implantatie worden geanalyseerd. Het effect van NAMEC-afgeleide EV's / exosomen bij het overdragen van de borstkankervormende vermogen van mammary luminale cellen kan worden geëvalueerd door de kliervorming van luminale cellen en EV / exosoombehandelde luminale cellen ( Figuur 9 ). De geïnduceerde EV's / exosomen van NAMEC's dragen de eigenschap van basale epitheelcellen van de basen - kiemvormende vermogen - en de luminale cellen die de geïnduceerde EV's / exosomen van NAMEC's innemen, kunnen het eigendom van NAMEC's via EV's / exosomen verwerven. Dit werk demonstreert bewijs dat moleculen verantwoordelijk zijn voor de EV / exosome mediaTed overdracht van de vorming van de borstkanker is aanwezig in lipidevlotten van EV's / exosomen 4 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Health Research Institutes (05A1-CSPP16-014, HJL) en van het Ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | Thermo | 1250062 | |
| Optima L-100K ultracentrifuge | Beckman | 393253 | |
| SW28 Ti Rotor | Beckman | 342204 | |
| SW41 Rotor | Beckman | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | NANOSIGHT LM10 | for nanoparticle tracking analysis (NTA) |
| Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). |
| CD81 antibody | GeneTex | GTX101766 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CD9 antibody | GeneTex | GTX100912 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CD63 antibody | Abcam | Ab59479 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| TSG101 antibody | GeneTex | GTX118736 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1:6,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | fluorescence cell analyzer | |
| collagenase Type IV | Thermo | 17104019 | |
| trypsin | Thermo | 27250018 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I3146 | a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite |
| accutase | ebioscience | 00-4555-56 | a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity |
| dispase | STEMCELL | 7913 | 5 mg/mL = 5 U/mL |
| anti-CD49f antibody | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| anti-EpCAM antibody | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | cell sorter | |
| carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs) | gifts from Dr. Robert Weinberg | ||
| permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-500 | |
| sodium bicarbonate | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| Hydrocoritisone | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE (bovine pituitary extract) | Hammod Cell Tech | 1078-NZ | |
| GW627368X | Cayman | 10009162 | |
| 15 cm culture dish | Falcon | 353025 | |
| table-top centrifuge | Eppendrof | Centrifuge 3415R | |
| ultracentrifuge tube | Beckman | 344058 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Corning | 46-013-CM | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | HT7700 | |
| gelatin | STEMCELL | 7903 | |
| 10 cm culture dish | Falcon | 353003 | |
| 6-well culture dish | Corning | 3516 | |
| female C57BL/6 mice | NLAC (National Laboratory Animal Center | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | BioWest | S01520 | |
| gentamycin | Thermo Fisher Scientific | 15710072 | |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| DNase I | 5PRIMER | 2500120 | |
| isofluorane | Halocarbon | NPC12164-002-25 | |
| formaldehyde | MACRON | H121-08 | |
| EtOH (Ethanol) | J.T. Baker | 800605 | |
| glacial acetic acid | Panreac | 131008.1611 | |
| aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | 12625 | |
| Xylene | Leica | 3803665 | |
| 0.22 μm membranes | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP Wound Clip Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask™ Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C10046 | plasma membrane stain |
References
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Boelens, M., et al. Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways. Cell. 159 (3), 499-507 (2014).
- Lin, M. C., et al. PGE2 /EP4 Signaling Controls the Transfer of the Mammary Stem Cell State by Lipid Rafts in Extracellular Vesicles. Stem Cells. , (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- György, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Olver, C., Vidal, M. Proteomic analysis of secreted exosomes. Subcell Biochem. 43, 99-131 (2007).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Prater, M. D., et al. Mammary stem cells have myoepithelial cell properties. Nat Cell Biol. 16 (10), 942-950 (2014).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Riches, A., Campbell, E., Borger, E., Powis, S. Regulation of exosome release from mammary epithelial and breast cancer cells - a new regulatory pathway. Eur J Cancer. 50 (5), 1025-1034 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), (2015).
- Outzen, H. C., Custer, R. P. Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. J Natl Cancer Inst. 55 (6), 1461-1466 (1975).
- Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. Int J Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).
