Summary
Denne protokollen beskriver metoder for rensing, kvantifisering og karakterisering av ekstracellulære vesikler (EVs) / eksosomer fra ikke-adherent / mesenkymale brystepitelceller og for bruk av dem for å overføre brystkjerteldannende evne til luminale brystepitelceller. EVs / eksosomer avledet fra stamlignende brystepitelceller kan overføre denne celleegenskapen til celler som inntar EVs / eksosomer.
Abstract
Celler kan kommunisere via eksosomer, ~ 100 nm ekstracellulære vesikler (EVer) som inneholder proteiner, lipider og nukleinsyrer. Non-adherent / mesenchymal mammary epithelial cell (NAMEC) -deriverte ekstracellulære vesikler kan isoleres fra NAMEC medium via differensial ultracentrifugering. Basert på dens tetthet kan EVs renses via ultracentrifugering ved 110.000 x g. EV-preparatet fra ultracentrifugering kan separeres ytterligere under anvendelse av en kontinuerlig tetthetgradient for å forhindre forurensning med løselige proteiner. De rensede EV-stoffene kan deretter evalueres ytterligere ved hjelp av nanopartikkel-sporingsanalyse, som måler størrelsen og antall vesikler i preparatet. De ekstracellulære vesiklene med en størrelse som strekker seg fra 50 til 150 nm er eksosomer. De NAMEC-avledede EV / eksosomer kan inntas av brystepitelceller, som kan måles ved hjelp av flytcytometri og konfokal mikroskopi. Enkelte brystkreftegenskaper ( f.eks. Brystkreftdannende evne) kanOverføres fra stamme-lignende NAMECer til brystepitelceller via de NAMEC-avledede EV / eksosomer. Isolerte primære EpCAM hi / CD49f lo luminale brystepitelceller kan ikke danne brystkjertler etter transplantering i musfettputer, mens EpCAM lo / CD49f hi basale brystepitelceller danner brystkjertler etter transplantasjon. Opptak av NAMEC-avledede EV'er / eksosomer av EpCAM hi / CD49f lo luminale brystepitelceller gjør det mulig for dem å generere brystkjertler etter transplantering i fettputer. EV-ene / eksosomene avledet fra stamlignende brystepitelceller overfører brystkjerteldannende evne til EpCAM hi / CD49f luminale brystepitelceller.
Introduction
Eksosomer kan formidle cellulær kommunikasjon ved å overføre membran og cytosoliske proteiner, lipider og RNAer mellom celler 1 . Eksosomediert kommunikasjon har blitt vist å være involvert i mange fysiologiske og patologiske prosesser ( dvs. antigenpresentasjon, utvikling av toleranse 2 og tumorprogresjon 3 ). Eksosomer har ofte innhold som ligner på kildekildene som frigjør dem. Eksosomene kan således bære spesifikke celleegenskaper fra kildecellene og overføre disse egenskapene til cellene som inntar dem 4 .
Eksosomer er 50- til 150 nm dobbeltlags membranvesikler og nåværende spesifikke markører ( f.eks. CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix og TSG101). Eksosomer må derfor preges av ulike metoder for ulike aspekter. Overføringselektronmikroskopi kan brukes til å visualisere membranvesiklerSom eksosomer 4 , 5 . Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) og dynamisk lysspredningsanalyse (DLS) brukes til å måle størrelsen og antall rensede eksosomer 4 . Lipidmembraninnholdet i eksosomer kan verifiseres ved tetthetgradient. Eksosomale markører, slik som CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix og TSG101 6 , 7 , kan måles ved Western blotting.
Mammare basale celler har evnen til å generere brystkjertler når de implanteres i fettputer, mens luminale celler ikke kan 8 , 9 , 10 . Således refereres også basale celler i brystet til brystrepopulerende enheter. Ved bruk av modellen av basale og luminale celler i brom kan evnen til EV / eksosomer for å overføre celleegenskaper mellom forskjellige cellepopulasjoner undersøkes. Denne jobbenDemonstrerer metoden for å overføre kjerteldannende evne fra brystbasale epitelceller til mammale luminale epitelceller ved bruk av EVer / eksosomer avledet fra basale epithelialceller fra bryst. Luminale brystepitelceller kjøpte basalcelleegenskaper etter inntak av EV / eksosomer utskilt fra basale celler og kan deretter danne brystkjertler 4 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All forskning som involverte dyr fulgte protokoller godkjent av Institutt for dyrepleie.
1. Ekstracellulær vesikkel / exosomisolasjon og validering
- Kulturmammepitelbasale celler, NAMEC 4 , med friskt, serumfritt medium laget av 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM / F12 med natriumbikarbonat (0,2438%); EGF (5 ng / mL); Hydrokoriton (0,5 μg / ml); Insulin (5 μg / ml); Bovint hypofyse ekstrakt (BPE; 35 μg / ml); Og GW627368X (1 μg / mL) i 15 cm tallerkener.
- Etter å ha talt cellene med et hemocytometer, frø 1,2 x 106 celler i 12 ml medium per 15 cm rett på dag 0 i 4 dager 4 .
- Etter 4 dager i kultur, sentrifuger kulturmediet ved 300 xg i 5 minutter ved bruk av en toppcentrifuge. Overfør supernatanten til et konisk rør ( Figur 1 ).
- Sentrifuger supernatantenVed 2000 xg i 20 minutter i en bord-topp sentrifuge. Overfør supernatanten til et ultracentrifugerør og la de døde celler og celleavfall ( Figur 1 ).
- Sentrifuger supernatanten ved 10 000 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Overfør supernatanten til et nytt ultracentrifugerør ( Figur 1 ).
- Sentrifuger supernatanten ved 110 000 xg i 60 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender EV / exosom pellet i PBS ( Figur 1 ).
- Sentrifuger supernatanten ved 110 000 xg i 60 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten. Resuspender EV / exosom pellet i PBS ( Figur 1 ). Resuspender pelleten isolert fra 240-480 ml NAMEC-kondensert medium i 100 ul.
- Mål proteinkonsentrasjonen av EV-suspensjonen med BCA-proteinanalysen. Sørg for at konsentrasjonen er rundt 20-40 μg / 100 μL. Oppbevares ved -20 ° C forVidere analyse.
- Mål konsentrasjonen og størrelsen på evtene / eksosomene ved hjelp av nanopartikkelsporingsanalyse (NTA), som tidligere beskrevet av Gardiner et al. 11 . Fortynne EV / eksosomer (20 μg / 100 μL) med PBS til 10.000 ganger for NTA-analyse.
MERK: Resultatet av NTA-analyse gjenspeiler antallet og størrelsen på vesiklene som analyseres. - Bild evs / eksosomer med transmisjonselektronmikroskopi (TEM), som tidligere beskrevet av Lin et al. 4 .
2. Eksosomrensing ved hjelp av en tetthetgradient
- Resuspenge 110 000 g pellet fra trinn 1.7 i 40% (w / v) iodixanol i PBS (2 ml). Overfør blandingen i rekkefølge med alikvoter på 30%, 20%, 10% og 5% (w / v) iodixanol i PBS (2 ml hver) for å danne en tetthetgradient i et ultracentrifugerør.
- Sentrifuger blandingen ved 200 000 xg i 8 timer ved 4 ° C.
- Samle hver gradientfraksjon (10 fraktions; 1 ml / fraksjon) med en pipette fra toppen av røret.
- Analyser tilstedeværelsen av eksosomarkører ( f.eks. CD81, CD9, CD63 og Tsg101) i hver fraksjon ved SDS-PAGE 12 og Western blot. Last opp 50 μl suspensjoner av hver fraksjon på en 10% gel inneholdende 0,1% (vekt / volum) SDS og separer proteiner i fraksjoner med gelelektroforese.
- Overfør proteinene fra en gel til en PVDF-membran og inkuber membranen med antistoffer mot eksosomarkørene ( f.eks. CD81, CD9, CD63 og Tsg101) og husholdningsprotein GAPDH over natten ( tabell av materialer ) ved 4 ° C.
MERK: Resultatet identifiserer fraksjonen som inneholder eksosomer.
3. Ekstracellulær vesikkel / eksosommerking
- Suspendere EVs / eksosomer, oppnådd i trinn 1.7, i 10 μM karbokfluoresceinsuccinimidyldiacetatester (CFSE) ved 20 μg eksosomalt protein / 100 μl. Forbered en parallell prøve coBare å få CFSE og PBS, behandlet på samme måte som en negativ kontroll for de senere EV / eksosomopptaksanalysene. La blandingene være ved 37 ° C i 30 minutter.
- Suspensjonene av EVs / eksosomer i 50x volum PBS og sentrifugering av suspensjonen ved 110.000 xg i 60 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender EV / exosom pellet i PBS. Gjenta trinn 3.2 en gang.
- Suspendere evs / eksosomer i PBS ved en konsentrasjon på 20 μg eksosomalt protein / 100 μL og deretter filtrer EVs / eksosomer gjennom 0,22 μm membraner før tilsetning av EV / eksosomer til cellene.
4. Ekstracellulær Vesikel / Eksosomopptak Assay
- For å lage kulturmedium blandes 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM / F12 med natriumbikarbonat (0,2438%); EGF (5 ng / mL); Hydrokoriton (0,5 μg / ml); Insulin (5 μg / ml); Og BPE (35 μg / mL) 4 . Plater de humane brystepitheliale HMLE-cellene i 6-brønnsretter (1 x 10 6 </ Sup> celler / brønn) en dag før EV / eksosombehandling. Tilsett 2 μg / ml CFSE fluorescens-merket EVs / exosom, oppnådd i trinn 3.3, til dyrkningsmediet i HMLE-cellene i 2-6 timer. Behandle HMLE-cellene i den negative kontrollgruppen med parallellpreparasjonen, beskrevet i trinn 3.1.
- Etter 2- til 6-h inkuberingen vaskes cellene to ganger med 4 ml PBS ved romtemperatur.
- Løsne cellene med 0,25% trypsin i 10 minutter og suspendere cellene i PBS som inneholder 0,2% FBS. Mål EV / eksosomopptaket fra fluorescensintensiteten i cellene ved hjelp av en fluorescenscelleanalysator 4 . Bildene cellene behandles med EV / eksosomer eller den negative kontrollen ved hjelp av konfokal mikroskopi.
MERK: Den grønne fluorescensen i cellene skyldes EV / eksosomopptaket. Se legenden om figur 6 for mikroskopinnstillingene.
5. Isolering av primære mus mammary epitelceller
- Disseksér tallene 2, 3, 4 og 5 brystkjertler ( figur 2 ) fra 12 uker gamle jomfru C57BL / 6 mus med saks og kutt kjertlene i små biter (2 mm 2 ) ved hjelp av en barberhøvel.
- Videre dissosiere oppslemmingen av brystkjertler (fra 10 mus) i 60 minutter ved 37 ° C, 120 rpm omrøring med 50 ml DMEM / F12 inneholdende 0,2% kollagenase type IV, 0,2% trypsin, 5% FBS, 5 ug / ml gentamycin , Og 1x penn-strep.
- Pellet ned epithelialorganoidene fra blandingen ved sentrifugering ved 350 xg i 10 minutter.
- Suspendere epitelorganoider i 4 ml DMEM / F12 med 0,1 mg / ml DNase I i 5 minutter ved romtemperatur. Tilsett 6 ml DMEM / F12 til en sluttVolum på 10 ml.
- Sentrifuger suspensjonen ved 400 xg i 10 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten.
- Resuspender pelleten i 10 ml DMEM / F12. Sentrifuger fjæringen, men treffer bremsen når hastigheten når 400 x g. Kast supernatanten.
MERK: Ved å treffe bremsen blir epitelorganoider raskt pelletert, mens fibroblaster, som enkeltceller, fortsatt er i supernatanten. - Gjenta trinn 5.6 og 5.7 5-7 ganger. Legg til en dråpe av suspensjonen til et hemocytometer og kontroller deretter frigjøringen av fibroblaster fra organoidblandingen under mikroskopi etter hver sentrifugeringsrunde ( Figur 3 ).
- Plasser organoidene i den gelatinekapslede parabolen, oppnådd i trinn 5.1, i 48 timer med DMEM / F12 som inneholder 1x ITS, 5% FBS, 50 ug / ml gentamycin, 10 ng / ml EGF og 1x penstrikk.
- Etter 48 timer fjerner du flytende celler i kulturen ved å erstatte mediet med friskt dyrkningsmedium uten FBS (FBS)DMEM / F12 som inneholder 1x ITS, 50 μg / mL gentamycin, 10 ng / mL EGF og 1x pen-strep).
- Bekreft at et monolag av brystepitelceller migrerer og vokser ut fra de vedlagte epitelorganoider på 3 dager.
6. Separasjon av primære musbasale / luminale mamma-epitelceller
- Etter 3-dagers kulturen, løsne primære mamma-mus med en naturlig enzymblanding med proteolytisk og kollagenolytisk enzymaktivitet i 20 minutter. Nøytraliser enzymaktiviteten med 5% FBS i PBS.
- Sentrifuger suspensjonen ved 450 xg i 10 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten. Resuspender cellepellet i 5 mg / ml dispas i 20 minutter. Nøytraliser enzymaktiviteten med 5% FBS i PBS.
- Sentrifuger suspensjonen ved 450 xg i 10 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten.
- Resuspender cellene i 100 μl PBS med 0,2% FBS ved en konsentrasjon på 10 7 celler / ml med den fortynnedeAnti-CD49f og anti-EpCAM antistoffer på is i 1 time i mørket.
- Vask cellene med PBS og inkuber deretter cellene med fluorofore-konjugert sekundært antistoff på is i 30 minutter i mørket.
- Vask og re-suspendere cellene i PBS med 0,2% FBS.
- Sorter EpCAM hi / CD49f lo luminale brystepitelceller på en celle sorter 4 .
7. Ekstracellulær vesikkel / eksosbehandling
- Se den sorterte EpCAM hi / CD49f lo luminale brystepitelceller fra trinn 6.7 på gelatinebelagte 6-brønnsretter (2 x 10 5 celler / brønn) og behandle dem deretter med PBS eller 2 ug / ml NAMEC-avledede EV / eksosomer Oppnådd i trinn 1.7.
- For å sikre den biologiske effekten av evs / eksosomer i langvarig kulturbehandling, erstatte cellekulturmediet med friskt medium inneholdende PBS eller 2 ug / ml NAMEC-avledede EV'er / eksosomer hver annen dag. Ikke del musen primaRy luminale celler under 10-dagers behandling.
8. Fettpute-injeksjon av mammary epitelceller
- Bedøve en 3-ukers kvinnelig C57BL / 6-mus med isofluoran 2-3% inhaleringsmiddel.
- Plasser den bedøvede musen på ryggen. Ta av pelsen på midten av buken med en barberkniv / hårkrem og rengjør operasjonsstedet med tre alternerende sykluser av 70% alkohol og povidon-jod.
- Lag et 1,5 cm vertikalt snitt gjennom huden langs den ventrale thoracic-inguinal regionen med saks og deretter vekselvis eksponere høyre og venstre fjerde mamma fett pads.
- Fjern hver fettpute ved å fjerne kjertelparenchyma med saks. Finn lymfeknudepunktet i fettputen og fjern deretter hele kjertelparenchyma under lymfeknudepunktet.
MERK: To tredjedeler av fettputen skal forbli på plass. - Fjern cellene oppnådd fra trinn 7.2 med en naturlig enzymblanding (se Materialetabell ) med proteolytisk aNd kollagenolytisk enzymaktivitet i 10 minutter. Nøytraliser enzymaktiviteten med 5% FBS i PBS.
- Sentrifuger suspensjonen ved 450 xg i 10 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten. Telle cellene med et hemocytometer og suspendere cellene i PBS ved en konsentrasjon slik at 15 μl inneholder den ønskede celledosen (10 4 -10 2 celle / pute).
- Injiser 15 μl brystepitelcellesuspensjon i en fettpute ved bruk av en 100 μl glassprøyte festet til en 27G nål.
- Gjenta trinn 8.4-8.7 for fettputen på den andre siden.
- Lukk huden med sårklemmer.
9. Mammary Gland Whole Mount
- Euthaniser musen med CO 2 pluss cervikal dislokasjon ved 8 uker etter celleinjeksjonen (trinn 8.7).
- Lag et vertikalt snitt gjennom hudlaget fra thoracic regionen til inngangsregionen ved hjelp av saks og avslør deretter både høyre og venstre 4. mAmmary fat pads. Fjern de fjerde kjeftkjertlene ( figur 2 ).
- Spred fettputer på glassmikroskoprør og fest fettputer med Kahles fikseringsmiddel (4% formaldehyd, 30% EtOH og 2% iseddik) ved romtemperatur over natten.
Forsiktig: Kahles fikseringsmiddel er en irritasjon. Utfør dette trinnet i en kjemisk hette. - Vask fettputer i 250 ml 70% EtOH i 15 minutter og deretter i 250 ml dH20 i 5 minutter. Stain fett pads med karmin alun (1 g karmin og 2,5 g aluminium kaliumsulfat i 500 ml dH 2 O) ved romtemperatur over natten.
- Vask fettputer med 250 ml 70% EtOH i 15 minutter, 250 ml 95% EtOH i 15 minutter og 250 ml 100% EtOH i 15 minutter.
- Rengjør fettputer i xylen i flere dager og stopp xyleninkubasjonen når fettputer blir gjennomsiktige.
Forsiktig: Xylen er et irritasjonsmiddel. Utfør dette trinnet i en kjemisk hette. - Monter lysbildene wiMonteringsmedium og ta bilder (2400 dpi) av fettpadsene ved hjelp av en digital lysbildeskanner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Siden det har blitt vist at blokkering av PGE 2 / EP 4- signalering utløser EV / eksosomfrigivelse fra basallignende stamceller 4 av brom, presenterer dette arbeid en metode for å isolere de induserte EVs / eksosomer fra brystepitelbasisk celle (NAMEC) -kultur. Siden NAMECs dyrkes i serumfritt medium, er det ingen eksisterende EV / eksosomer avledet fra serum 13 . For celler som dyrkes i serumholdig medium, må eksisterende eksosomer i mediet forrenses ved ultracentrifugering ved 110 000 xg før mediet brukes til å dyrke kildecellene for samling av EVer / eksosomer 5 . EVs / eksosomer fra det 4 dagers induserte NAMEC-kondenserte medium kan isoleres fra 110 000 xg pellet ved differensial ultracentrifugering, som illustrert i figur 1 . Antallet og størrelsen på de isolerte vesiklene i 110.000 xg pellEt kan måles ved hjelp av nanopartikkelsporingsanalyse (NTA). Den 110.000 g pelletsfraksjon isolert ved differensial ultracentrifugering inneholder hovedsakelig ~ 100 nm vesikler ( figur 4A ); Dette tilsvarer størrelsen på eksosomer (50-150 nm) som er rapportert i litteraturen. I tillegg viste TEM-analyse at 110 000 g fraksjoner av NAMEC-kondensert medium inneholdt rikelig membranvesikler ( figur 4B ). Selv om differensial ultracentrifugering kan generere rimelig rene eksosomer, eliminerer følgende purifiseringstrinn ved bruk av en tetthetgradient ytterligere forurensninger ( f.eks. Proteinaggregater) 5 . I tetthetgradienten flyter eksosomer i gradienten på grunn av lipidinnholdet i vesiklet, mens proteinaggregatene, om noen, forblir i bunnen av gradienten. Hver del av gradienten oppsamles for deteksjon av eksosom beslutningstakere ( f.eks. CD81, CD63, CD9 og TSG101 , 7 ) ved Western blotting. Eksosomarkører kan detekteres i brøkdelen med ~ 20% iodixanol ( figur 5 ). Fraksjonen som inneholder eksosomer kan fortynnes med PBS og underkastes 200 000 xg ultracentrifugering for å isolere eksosomer. Den isolerte exosompellet vaskes en gang i PBS og resuspenderes deretter i PBS og lagres ved -20 ° C for videre analyse.
Før måling av opptak av NAMEC-avledede EV'er / eksosomer av den ikke-stamme-motparten av brystepitelceller-HMLE-celler, må EV / eksosomer merkes med et fluorescerende fargestoff ( f.eks. Karbokfluoresceinsuccinimidylester (CFSE)). En parallellprøve som bare inneholder CFSE, men ingen EV / eksosom, behandles i samme merkingsprosedyre. Denne prøven er en negativ kontroll som brukes i følgende EV / eksosomopptaksanalyse for å gjenspeile effekten av en spormengde av resterende fri CFSE fargestoff. HMLE-celler dyrkes med CFSE-merkede, NAMEC-avledede EV'er / eksosomer eller den negative kontroll i 2-6 timer og blir deretter utsatt for strømningscytometri. Sammenlignet med de ubehandlede HMLE-cellene, uttrykker HMLE-celler som dyrkes med den negative kontrollen et noe høyere nivå av CFSE-signal ( Figur 6A , rød linje versus oransje linje), som reflekterer bakgrunnsnivået for CFSE-signalering forårsaket av gjenværende fri CFSE, som er igjen fra EV / exosom merking prosess. I tillegg til, sammenlignet med de negative kontrollbehandlede HMLE-cellene, uttrykker HMLE-celler som er dyrket med CFSE-merkede, NAMEC-avledede eksosomer et 10-ganger høyere CFSE-signal ( Figur 6A , blå linje mot rød linje), som resulterer fra den spesifikke opptaket Av CFSE-merkede EV / eksosomer. Opptaket av CFSE-merkede, NAMEC-avledede EV'er / eksosomer av HMLE-celler kan også observeres ved konfokal mikroskopi. Mens de negative kontrollbehandlede HMLE-cellene ikke viser et CFSE-signal, vil opptaket av NAMEC-avledede EV / eksosomer av HMLE-celler kan observeres med CFSE-signalet under konfokalmikroskopet i CFSE-merkede EV / eksosombehandlede celler ( Figur 6B ).
For å evaluere om NAMEC-avledede EV'er / eksosomer kan overføre brystkjerteldannende evne fra stamlignende basalceller til brystkreft til luminale celler, blir først musemamma luminale celler isolert for å tillate analyse av brystkjerteldannelse hos mus. Musmammepitelceller er isolert fra 12 uker gamle mus. Brystkjertlene er kuttet i små stykker og dissocieres videre med kollagenase og trypsin. De dissocierte epitelorganoider og fibroblaster kan separeres ved differensial sentrifugering, som beskrevet i trinnene 5,7 og 5,8. I hver sentrifugeringsrunde bør pelleten nederst på rørene inneholde hovedsakelig epitelorganoider, og fibroblastene og enkeltcellene skal flyte i supernatanent. Sammenlignet med blandingen som inneholder både epitelorganoider og fibroblaster før differensialcentrifugeringen ( Figur 3 , øvre paneler) fjerner de seks sentrifugeringsrunder de fleste fibroblaster og enkeltceller i blandingen ( Figur 3 , bunnpanel).
Mammepitelceller ( Figur 7 ) av epitelorganoidene dissocieres videre ved anvendelse av en naturlig enzymblanding med proteolytisk og kollagenolytisk enzymaktivitet og dispaser for å danne enkeltceller i suspensjon. Sortering av encellesuspensjonen ved ekspresjon av celleoverflate CD49f og EpCAM kan separere brystluminale celler (EpCAM hi / CD49f lo ), basale basalceller (EpCAM lo / CD49f hi ) og ikke-epitelceller (EpCAM - ) ( Figur 8 ).
hi / CD49f lo luminale brystepitelceller dyrkes med NAMEC-avledede EV'er / eksosomer i 10 dager, og de friske EV / eksosomer og medium blir erstattet hver annen dag. Etter EV / eksosombehandling implanteres brystcellens luminale celler inn i den fjerde mammatfettpute ( figur 2 ) av mus. Etter 8 uker isoleres fettputer og farves for analyse av brystkjerteldannelse ( figur 9 ). Behandlingen med induserte NAMEC-avledede EV'er / eksosomer tillater luminale celler å tilegne seg brystkreftdannende evne 4 . De NAMEC-avledede, EV / eksosombehandlede luminale celler fra brystene danner brystkjertler i museklutputer ( Figur 9 ).
Figur 1: Illustrasjon av ExtracellulaR Vesikkel / Exosom Puri fi ceringsmetode fra Cell Culture Medium ved Differensial Ultracentrifugering. Hastigheten og lengden på hver sentrifugering er indikert. Etter hvert av de første tre sentrifugeringer holdes supernatanten til neste trinn. Etter 110.000 x g-sentrifugeringene holdes pelletsene og supernatantene kasseres. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mus Mammary Gland Anatomy. Mus har fem par brystkjertler, angitt med tallene 1-5, plassert i fettputer (rødt) rett under huden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av thEr figur.
Figur 3: Bilder av en blanding av epitelorganoider og celler av fettputer før og etter differensialt sentrifugering. Lysfiberbilder av de isolerte fettpute-celleblandingene før og etter differensial sentrifugering, tatt fra hemocytometeret. Arrowhead: epithelial organoids. Pil: fibroblaster og enkeltceller. Skalbjelke = 0,5 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Vesikkelstørrelse og konsentrasjonsanalyse av NAMEC110.000 xg pelletfraksjon. Den 110.000 g pelletsfraksjonen av NAMEC-mediet er kol Lectured og utsatt for ( A ) nano-partikkel sporingsanalyse (NTA) og ( B ) transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Skalbjelke = 1 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Påvisning av eksosomer i brøkdel av tetthetgradienten. Western blot-analyse av exosommarkører CD81, CD9, CD63 og Tsg101 og housekeeping-gen GAPDH avslører 20% iodixanolfraksjonen som inneholder eksosomer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
55736fig6.jpg "/>
Figur 6: Påvisning av ekstracellulær vesikkel / eksosopptak ved hjelp av flytcytometri og konfokal mikroskopi. EV / eksosomopptak ble målt i HMLE-celler. CFSE-merkede, NAMEC-avledede EV'er / eksosomer og negativ kontroll tilsettes til de angitte kulturer i 6 timer. Etter inkubasjonen blir cellene utsatt for ( A ) strømningscytometri og ( B ) konfokal mikroskopi. CFSE (grønn, eksitasjon / utslipp (nm): 492/517; mikroskoplaserlinje: 488) fl uorescensintensiteter gjenspeiler EV / exosomopptaket. Cellekjerner er farget med DAPI (blå; eksitasjon / utslipp (nm): 358/461; mikroskoplaserlinje: 405) og plasmamembranene er farget med plasmamembran flekk (rødt, eksitasjon / utslipp (nm): 649/666; Mikroskoplaserlinje: 633; se materialetabellen ). Konfokal objektiv: HCX PL APO 63x / 1.40-0.60 Olje. Skalbjelke = 20 μm.Ad / 55736 / 55736fig6large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Bilder av vedlagte epitelorganoider. Lysfiberbilder av brystepitelceller dannet av cellene som migrerer og vokser ut av de vedlagte epitelorganoider. Skalbjelke = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Sortering av primære mus mammary epitelceller ved overflate EpCAM og CD49f. Musmammepitelceller isolert fra fettputer av 12 uker gamle mus blir utsatt for cellesorting. Musmamma luminale celler er beriket i EpCAM hi / CD49f lo populasjonen, merket med den blå sirkelen; Basalceller ble beriket i EpCAM lo / CD49f hi populasjonen, merket med den røde sirkelen. Ikke-epitelceller er merket med den svarte boksen i plottet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Mammekjerteldannelse av primærmus-luminale mammarceller. De primære mus-EpCAM hi / CD49f lo luminale celler behandles med PBS eller de NAMEC-avledede EV / eksosomer i cellekultur i 10 dager og implanteres i de fjernede fettputer av 3 ukers gamle mus. Musene er euthanisert og okkupert etter 8 uker for å analysere brystkjertelformasjon. Skalbjelke = 0,75 cm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Prosentdel | MFI av EpCAM | MFI av CD49f | |
| Mamma luminale celle | 0,437 | 4,57 x 10 4 | 8183 |
| (EpCAM hi / CD49f lo ) | |||
| Basal celle i mamma | 0,09 | 5452 | 2,23 x 10 4 |
| (EpCAM lo / CD49f hi ) | |||
| Ikke-epitelialCelle (EpCAM - ) | 0,309 | 53 | 4619 |
Tabell 1: Prosentandel og middelfluorescensintensitet (MFI) av populasjonene beskrevet i figur 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksosomer har ofte egenskaper av cellene som frigjorde dem, og mengden av frigjorte eksosomer kan induseres av stimuli 4 . Kulturmediet fra celler kan samles og underkastes differensial ultracentrifugering for EV / eksosom samling ( Figur 1 ). Det er for øyeblikket ingen generell avtale om en ideell metode for å isolere EV / eksosomer. Den optimale fremgangsmåten som brukes her er blitt bestemt av nedstrømsapplikasjonen 14 . Ultracentrifugering er en relativt rask metode for isolering av EV / eksosomer, som kan bevare den biologiske aktiviteten til EV / eksosomer. Vesiklene isolert ved ultracentrifugering inneholder imidlertid vanligvis en blanding av EV, som inneholder eksosomer fremstilt via endosomale rom og / eller vesikler produsert via spirende fra cellemembranen.
Ved å analysere størrelsene av vesikler med NTA ( figur 4A 15 .
Selv om differensial ultracentrifugering kan brukes til å rense eksosomer, bør en tetthetgradient brukes for ytterligere å fjerne forurensningen av proteinaggregater fra eksosomvesikler i den isolerte 110 000 xg-fraksjonen 5 f.eks. CD81, CD63, CD9 og TSG101 6 , 7 ). Ved å analysere tilstedeværelsen av eksosomarkører i fraksjonene i tetthetgradienten, er det mulig å identifisere eksosomer i fraksjonen med ~ 20% iodixanol ( figur 5 ). Flere eksosomarkører bør undersøkes for å identifisere eksosomer i tetthetgradienten, da hver populasjon av eksosomer kan uttrykke forskjellige eksosomarkører 16 .
Opptaket av EVer / eksosomer av celler kan måles ved bruk av fluorescerende fargemerkede EV'er / eksosomer. Antall celler som inntar merkede EV'er / eksosomer kan måles ved hjelp av flytcytometri ( figur 6A ). For å bekrefte at fluoenRescens fra cellene skyldes opptaket av merkede EV'er / eksosomer, men ikke fra fritt farget, ble mønsteret av fluorescens undersøkt i cellene ved bruk av mikroskopi. Konfokalmikroskopi viser at mønsteret av fluorescens i de EV / exosombehandlede cellene er punktert ( Figur 6B høyre panel). Punktat-signalene skyldes sannsynligvis merket EVs / eksosomer, ikke fra fri fluorescens. De punkterte signalene i cellene kan analyseres ytterligere med strukturert belysning med superoppløsningsmikroskopi, som har den høyeste oppløsningen ved 85 nm 4 , 17 . Superoppløsningsmikroskopi kan bekrefte at punkteringssignalene er fra ~ 100 nm hule vesikler, som ligner eksosomer 4 . Disse resultatene antyder at NAMEC-avledede eksosomer kan inntas av brystepitelceller i kultur.
NAMEC-avledede EV'er / eksosomer bærer ofte molekyler ( f.eks. Proteiner og miRNAer) avgjørende for egenskapene til visse celler 1 . Dette antyder at NAMEC-avledede EVer / eksosomer kan overføre egenskapene til NAMEC ( f.eks . Kjerteldannende evne) til deres epitelcelle-kolleger. Siden humane brystepitelceller ikke kan danne brystkjertler xenogent i museklutputer 18 , 19 , kan overføringen av kjerteldannende evne undersøkes ved bruk av primære mamma-epitelceller fra mus. Mus primærbryst EpCAM hi / CD49f lo luminale celler, som ikke danner brystkjertler, kan isoleres fra 6 uker gamle mus ( figur 7 og figur 8 ). De isolerte cellene fra musfettputer kan deles inn i tre grupper ( dvs. EpCAM hi / CD49f lo luminale celler, EpCAM lo / CD49f hi basale celler og EpCAM - ikke-epitelceller) ved å undersøke leFlater av overflate EpCAM og CD49f ( figur 8 ). EpCAM lo / CD49f Hi basalceller kan danne brystkjertler i fettklemmer når de transplanteres i fettputer, men EpCAM hi / CD49f lo luminale celler kan ikke 4 . Dermed kan EpCAM hi / CD49f lo luminale cellepopulasjonen brukes til å undersøke evnen til induserte NAMEC-avledede EV'er / eksosomer for å overføre brystkjerteldannende evne. De isolerte EpCAM hi / CD49f lo luminale celler kan holdes i kultur i 7-10 dager for EV / exosombehandling 4 . Det bør bemerkes at å holde primære brystepitelceller in vitro lenger kan dempe cellers levedyktighet.
EV / exosombehandlede brystluminceller kan implanteres i rydde fettputer for å analysere brystkjerteldannende evne. De fete padsene av mus som brukes til implantasjon, må ryddes ved 3 uker. ENT 3 ukers alder, er brystepitelceller begrenset til regionen mellom brystvorten og lymfene på en fettpute. Mammarepitel i en fettpute kan ryddes ved å fjerne regionen mellom brystvorten og lymfene ved 3 ukers alder. Mammale luminale celler blir implantert like etter å ha fjernet fettpuden, og kjertelformasjonen av de implanterte cellene kan analyseres 8 uker etter implantasjonen. Effekten av NAMEC-avledede EV'er / eksosomer ved overføring av brystkjerteldannende evne til luminale celler fra lammene kan vurderes ved kjerteldannelse av luminale celler og EV / eksosombehandlede luminale celler ( Figur 9 ). De induserte EV-ene / eksosomene fra NAMEC har bæreegenskapen til basale epithelialceller i brystkreft - kjerteldannende evne - og luminale celler som inntar de inducerte EV / eksosomer fra NAMEC, kan kjøpe eiendommen fra NAMEC via EV / eksosomer. Dette arbeidet demonstrerer bevis som viser at molekyler som er ansvarlige for EV / eksosommedieneTed overføring av brystkjerteldannende evne er tilstede i lipidflåter av EVer / eksosomer 4 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Health Research Institutes (05A1-CSPP16-014, HJL) og fra departementet for vitenskap og teknologi (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | Thermo | 1250062 | |
| Optima L-100K ultracentrifuge | Beckman | 393253 | |
| SW28 Ti Rotor | Beckman | 342204 | |
| SW41 Rotor | Beckman | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | NANOSIGHT LM10 | for nanoparticle tracking analysis (NTA) |
| Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). |
| CD81 antibody | GeneTex | GTX101766 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CD9 antibody | GeneTex | GTX100912 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CD63 antibody | Abcam | Ab59479 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| TSG101 antibody | GeneTex | GTX118736 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1:6,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 °C, overnight |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | fluorescence cell analyzer | |
| collagenase Type IV | Thermo | 17104019 | |
| trypsin | Thermo | 27250018 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I3146 | a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite |
| accutase | ebioscience | 00-4555-56 | a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity |
| dispase | STEMCELL | 7913 | 5 mg/mL = 5 U/mL |
| anti-CD49f antibody | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| anti-EpCAM antibody | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | cell sorter | |
| carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs) | gifts from Dr. Robert Weinberg | ||
| permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-500 | |
| sodium bicarbonate | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| Hydrocoritisone | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE (bovine pituitary extract) | Hammod Cell Tech | 1078-NZ | |
| GW627368X | Cayman | 10009162 | |
| 15 cm culture dish | Falcon | 353025 | |
| table-top centrifuge | Eppendrof | Centrifuge 3415R | |
| ultracentrifuge tube | Beckman | 344058 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Corning | 46-013-CM | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | HT7700 | |
| gelatin | STEMCELL | 7903 | |
| 10 cm culture dish | Falcon | 353003 | |
| 6-well culture dish | Corning | 3516 | |
| female C57BL/6 mice | NLAC (National Laboratory Animal Center | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | BioWest | S01520 | |
| gentamycin | Thermo Fisher Scientific | 15710072 | |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| DNase I | 5PRIMER | 2500120 | |
| isofluorane | Halocarbon | NPC12164-002-25 | |
| formaldehyde | MACRON | H121-08 | |
| EtOH (Ethanol) | J.T. Baker | 800605 | |
| glacial acetic acid | Panreac | 131008.1611 | |
| aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | 12625 | |
| Xylene | Leica | 3803665 | |
| 0.22 μm membranes | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP Wound Clip Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask™ Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C10046 | plasma membrane stain |
References
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Boelens, M., et al. Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways. Cell. 159 (3), 499-507 (2014).
- Lin, M. C., et al. PGE2 /EP4 Signaling Controls the Transfer of the Mammary Stem Cell State by Lipid Rafts in Extracellular Vesicles. Stem Cells. , (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- György, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Olver, C., Vidal, M. Proteomic analysis of secreted exosomes. Subcell Biochem. 43, 99-131 (2007).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Prater, M. D., et al. Mammary stem cells have myoepithelial cell properties. Nat Cell Biol. 16 (10), 942-950 (2014).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Riches, A., Campbell, E., Borger, E., Powis, S. Regulation of exosome release from mammary epithelial and breast cancer cells - a new regulatory pathway. Eur J Cancer. 50 (5), 1025-1034 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), (2015).
- Outzen, H. C., Custer, R. P. Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. J Natl Cancer Inst. 55 (6), 1461-1466 (1975).
- Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. Int J Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).
