Summary
يصف هذا العمل بروتوكول ميثيل-كبينغ ملزم (مبد) الأمثل، وخط أنابيب حسابية لتحديد مناطق ميثيلد الغنية بغاز كبغ في مرضى سرطان الدم الليمفاوي المزمن (كل).
Abstract
دور رناس طويلة غير المشفرة (لكرناس) في السرطان يأتي إلى الصدارة بسبب الاهتمام المتزايد في فهم وظائفهم الميكانيكية خلال تطور السرطان والتقدم. وعلى الرغم من ذلك، لم يتم التحقيق جيدا في التنظيم الجيني العالمي من لكرناس والتسلسلات المتكررة في السرطان، ولا سيما في سرطان الدم الليمفاوي المزمن (كل). وتركز هذه الدراسة على نهج فريد من نوعه: القبض على المناعي القائم على المزدوج تقطعت بهم السبل، شظايا الحمض النووي ميثليته باستخدام الميثيل ملزم المجال (مبد) البروتينات، تليها تسلسل الجيل القادم (مبد-سيق). تم في هذه الدراسة استخدام عينات المريض التي تنتمي إلى المجموعتين الفرعيتين النذيرتين (5 عينات متحولة من إيغف + 5 عينات غير مقيسة من إيغف). وقد كشف التحليل عن وجود 5،800 فرط مثلي و 12،570 من الجينات المميثلة المفرومة (كلدمغس) ذات ال هايبومثيلات مقارنة بالضوابط الصحية الطبيعية. الأهم من ذلك، حددت هذه النتائج عدة كل محددة، ليكرناس ميثليته مختلفة، إعادةالعناصر الجينية، وجينات ترميز البروتين مع قيمة النذير المحتملة. ويحدد هذا العمل بروتوكولا مفصلا لخط أنابيب مب-أدق ومعلوماتية أحيائية تم تطويره لتحليل شامل لمحات الميثيل العالمية في المناطق الغنية ب كبغ باستخدام عينات المريض كل. وأخيرا، تم التحقق من الجينات ترميز البروتين و لكرنا باستخدام بايروسكنسينغ، وهو طريقة كمية للغاية لتحليل مستويات مثيلة كبغ لمزيد من إثبات النتائج من بروتوكول مبد-سيق.
Introduction
وكان استخدام تقنيات الجيل القادم من التسلسل لتحليل الملامح العالمية مثيلة الحمض النووي شعبية متزايدة خلال السنوات الأخيرة. وقد تم تطوير مقايسات مثيلة على نطاق الجينوم، بما في ذلك أساليب ميكروأري وغير ميكروأري على أساس ما يلي: تحويل ثنائي الكبريتات من الحمض النووي الجيني، حساس انزيم انزيم حساس تقييد، ومناعي من الحمض النووي ميثليته باستخدام الميثيل كبغ محددة الأجسام المضادة .
مشتقات الحمض النووي الشاذة هي واحدة من السمات المميزة لسرطان الدم والأورام اللمفاوية، بما في ذلك سرطان الدم الليمفاوي المزمن (كل). في وقت سابق، العديد من المجموعات بما في ذلك لدينا وصف ملامح الحمض النووي مثيلة من المجموعات الفرعية كل برونوستيك مختلفة والضوابط طبيعية، صحية B- الخلية باستخدام تحويل ثنائي السلفيت من الحمض النووي الجيني، تليها مجموعة صغيرة المستندة إلى أساليب أو تسلسل الجينوم كامل 1 ، 2 ، 3 ، <سوب كلاس = "كريف"> 4. تحويل ثنائي السلفيت من الحمض النووي الجيني يؤدي إلى ديميناتيون من السيتوزينات غير المعدلة ل أوراسيل، وترك السيتوزينات ميثليته المعدلة في الجينوم. وبمجرد تحويلها، يمكن تحديد حالة مثيلة من الحمض النووي عن طريق التضخيم ير وتسلسل باستخدام أساليب كمية أو نوعية مختلفة، مثل مجموعة الصفيف الجزئي أو الجينوم كامل تسلسل الكبريت (وغبس). على الرغم من أن الأساليب القائمة على تحويل ثنائي الكبريت لديها العديد من المزايا وتستخدم على نطاق واسع في أنواع السرطان المختلفة لتحليل مستويات مثيلة الحمض النووي، وهناك عدد قليل من السلبيات المرتبطة بهذه التقنية. ويسمح تسلسل وغبس بدراسة قاعدة أحادية القاعدة مع كميات أقل من الحمض النووي وهو أفضل خيار مناسب لتحليل عدد كبير من العينات. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة تفشل في التفريق بين التعديلات بين 5 ماك و 5 مستويات همك في الجينوم 5 ، 6 . بالإضافة إلى ذلك، الأساليب القائمة على ميكروأري لا تقدم كاملة جالإفراط في الجينوم.
في دراسة حديثة من مختبرنا 7 ، تم استخدام أساليب إمنوبوريسيبيتاتيون القائمة، بدلا من تحويل ثنائي الكبريت، لتحديد عالية كبغ الغنية، ومختلف ميثليته المناطق على نطاق عالمي في المرضى كل والضوابط الصحية العادية. إنميثيل-كبغ ملزم المجال (مبد) الجيل القادم التسلسل (مبد-سيق)، وإثراء الحمض النووي مجزأة المزدوج تقطعت بهم السبل يعتمد على درجة مثيلة كبغ. هذا الأسلوب يمكن التغلب على عيوب طريقة تحويل ثنائي السلفيت ويمكن أيضا توفير تغطية على نطاق الجينوم من كبغ مثيلة بطريقة غير منحازة و ير مستقلة. بالإضافة إلى ذلك، خلافا لأساليب ميكروأري ميكروأري التحويل القائم على ثنائي السلفيت، يمكن استخدام مبد-سيق لتحليل حالة مثيلة من العناصر المتكررة، مثل العناصر النووية المتخلل طويلة (السطور)، قصيرة العناصر النووية المتخلل (سينيس)، يكرر محطة طويلة (لترس) الخ . ومع ذلك، بالمقارنة مع أساليب التحويل ثنائي الكبريت،يتطلب بروتوكول مب-سيق، كمية كبيرة نسبيا من الحمض النووي المدخلات. أيضا، نوعية التسلسل يقرأ والبيانات تعتمد على خصوصية، تقارب، ونوعية الأجسام المضادة المستخدمة.
وتشرح الدراسة الحالية بروتوكول مبد-سيق مفصل لإثراء الحمض النووي ميثليته لتسلسل الجيل القادم. وهي تستخدم مجموعة من مواد التخصيب الملزمة من الحمض النووي الميثيلية (المدرجة في جدول المواد )، فضلا عن خط أنابيب حاسوبي لتصور وتفسير بيانات تسلسل مثيلة لتحديد كل-هايبر-هيبيوميلاتد مناطق محددة مقارنة مع الضوابط الصحية العادية. في الأساس، وهذا الأسلوب يجعل من الاستفادة من قدرة مبد من الإنسان التفاعل البروتين MDD2 مع كبغ الميثيلين لاستخراج الحمض النووي المخصب مع كبغ الميثيل، ويتبع ذلك تسلسل عالية الإنتاجية من الحمض النووي ميثليته.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الموافقة الأخلاقية لجمع عينات كل هي من 2007-05-21، مع رقم التسجيل التالي: إبن غبغ دنر 239/07. تم تشخيص جميع مرضى الكل وفقا للمعايير المعدلة مؤخرا 8 ، وتم جمع العينات في وقت التشخيص. تم تضمين المرضى في الدراسة من مختلف أقسام أمراض الدم في الجزء الغربي من السويد بعد الحصول على موافقة خطية. تم اختيار فقط كل الطرفية خلايا الدم وحيدات النوى (بمك) عينات مع نسبة الورم من خلايا اللوكيميا ≥70٪ في هذه الدراسة.
1 - الأعمال التحضيرية
- عزل بمكس لاستخراج الحمض النووي من كل والعادية، عينات الدم الطرفية صحية باستخدام مجموعة العزلة التجارية (انظر جدول المواد )، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- الأوتوكلاف 1.5 مل أنابيب. ذوبان الجليد جميع الكواشف في مجموعة ملزم دنا ملزم (انظر جدول المواد ). </ لى>
- استخدام المياه خالية من الدناز لإعداد 10 مل من 1X العازلة غسل حبة من المخزن المؤقت غسل الأسهم 5X التي تقدمها عدة لغسل الخرز وتمييع البروتين مبد التي تقدمها المجموعة.
- الحصول على أو إعداد العناصر التالية مقدما: 3 M خلات الصوديوم، والإيثانول المطلق، و 70٪ من الإيثانول لهطول الأمطار الحمض النووي ( جدول المواد ).
2. استخراج الحمض النووي الجيني والسونيكاتيون
- استخدام مجموعة استخراج الحمض النووي المتاحة تجاريا ( المواد الجدول ) لعزل الحمض النووي الجيني من المريض والعينات بمك العادية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تحديد الحمض النووي الجيني باستخدام مقياس الطيف في 260 نانومتر.
ملاحظة: قدرة عمود استخراج الحمض النووي هو 5-6 مليون خلية، والحد الأقصى. وبالتالي، فمن المهم استخدام أكثر من عمود واحد للعينات مع أكثر من 5 ملايين خلية. أزل الحمض النووي مرتين في أحجام متساوية يبلغ مجموعها 100 ميكرولتر من 10 ملي تريس إدتا (تي) العازلة. بروتين الميثان البيوتين - الميوتين المستخدم في الميثيلعدة مينر ل مبد تسلسل لن تلزم الحمض النووي واحد تقطعت بهم السبل. وبالتالي، فمن المهم جدا للحفاظ على الحمض النووي إلوتد إما المجمدة أو في 4 درجات مئوية للحفاظ على الطبيعة المزدوج تقطعت بهم السبل. - تمييع 5 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني من كل عينة إلى ما مجموعه 200 ميكرولتر باستخدام العازلة تي (الرقم الهيدروجيني 8)، وإعطاء تركيز النهائي من 25 نانوغرام / ميكرولتر.
- أداء سونيكاتيون في أنابيب مصممة خصيصا باستخدام سونيكاتور ( المواد الجدول ) لما مجموعه 30 دورات (30 ثانية على و 30 ثانية قبالة لكل دورة، بعد كل 5 دورات، تدور لفترة وجيزة الأنابيب لجمع العينات إلى أسفل).
ملاحظة: وهذا سوف ينتج الحمض النووي مجزأة تتراوح بين 150 نقطة أساس و 300 نقطة أساس، وهو الأمثل لهذا البروتوكول. - تحقق من مجموعة صوتنة لجميع العينات قبل الشروع في الخطوة التالية من التسلسل مبد عن طريق تشغيل 1 ميكرولتر من عينات الحمض النووي مجزأة وسلم حجم الحمض النووي على المتاحة تجاريا، قبل الزهر 2٪ الاغاروز هلام باستخدام معدات التصوير الكهربائي الحمض النووي. تصور tانه الحمض النووي باستخدام ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية القياسية.
3. إعداد حبة قبل ملزمة مع MBD- البيوتين البروتين
- ريسوسبيند الخرز ستريبتافيدين المغناطيسي من أنبوب الأسهم التي تقدمها عدة، بيبتينغ بلطف صعودا وهبوطا للحصول على تعليق متجانس. لا دوامة الخرز أو السماح لهم لتجف.
- وضع 50 ميكرولتر من الخرز (لكل 5 ميكروغرام من عينة الحمض النووي مجزأة) في منفصلة ونظيفة، وصفت أنابيب 1.5 مل. إضافة 50 ميكرولتر من 1X العازلة غسل حبة للوصول إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر.
ملاحظة: عند استخدام 0.5 مل صغير البوليميراز سلسلة من ردود الفعل (ير) المشارب لغسل الخرز، ويستخدم حوالي 150-200 ميكرولتر من غسل العازلة في أنبوب، كما هو مذكور في بروتوكول عدة. ومع ذلك، في حالة 1.5 مل أنابيب، إضافة ما لا يقل عن 250 ميكرولتر إلى 300 ميكرولتر من غسل العازلة في أنبوب لغسل حبة. - وضع الأنابيب على موقف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة للسماح لجميع الخرز المغناطيسي للتركيز على الجدار الداخلي للأنبوبالتي تواجه المغناطيس. إزالة السائل، دون لمس الخرز، وذلك باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
- إزالة الأنابيب من موقف المغناطيسي، إضافة 250 ميكرولتر من 1X العازلة غسل حبة، وتخلط الخرز بلطف مع ماصة.
- كرر الخطوات 3.3 و 3.4 على الأقل 4-5 مرات لجميع العينات وأخيرا ريسوسبيند في 250 ميكرولتر من 1X العازلة غسل حبة. الاحتفاظ بها على الجليد.
4. تجليد البروتين مبد-البيوتين إلى الخرز غسلها
- إضافة 35 ميكرولتر من البروتين برميل يوميا (7 ميكرولتر ل 1 ميكروغرام من عينة الحمض النووي) لفصل أنابيب وجلب الحجم الكلي يصل إلى 250 ميكرولتر باستخدام 1X العازلة غسل حبة.
- إضافة 250 ميكرولتر من البروتين المخفف مبد إلى 250 ميكرولتر من الخرز غسلها وتركها على دوران نهاية إلى نهاية في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- بعد خلط الخرز والبروتين لمدة 1 ساعة، وغسل البروتين بيوتين مليون برميل يوميا ملزمة مع الخرز ستريبتافيدين المغناطيسي.
- وضع الأنابيب على موقف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة وإزالة رانه السائل دون لمس الخرز باستخدام ماصة. إضافة 250 ميكرولتر من 1X العازلة غسل حبة ووضع أنابيب على خلاط التناوب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- كرر الخطوة 4.3.1 مرتين أخريين وأخيرا ريسوسبيند غسلها الخرز مبد البيوتين في 200 ميكرولتر من 1X العازلة غسل حبة، مما يجعل الخرز جاهزة لالتقاط الحمض النووي ميثليته.
ملاحظة: غسل 2-3 مرات في هذا الأسلوب يزيل كل الخلفية غير محدود بد البروتين الخرز ويحسن ملزمة فعالة من بد برميل البروتين الخرز مع دنا الجينومية المجزأة.
5. ملزمة مبد-البيوتين الخرز مع الحمض النووي الجينومي مجزأة
- في نظيفة 1.5 مل أنبوب الدناز خالية، إضافة 100 ميكرولتر من 5X العازلة غسل حبة و 180 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني المجزأة (الخطوة 2.3). جلب الحجم النهائي إلى 500 ميكرولتر باستخدام الدناز المياه الحرة.
- إضافة 380 ميكرولتر من المياه خالية من الدناز إلى 20 ميكرولتر المتبقية من الحمض النووي الجيني المجزأ وتجميدها. استخدم هذه العينات كمدخلات دنوهناك ضوابط وترسب لهم في وقت لاحق جنبا إلى جنب مع عينات الحمض النووي ميثيلاتد النهائية المزالة (انظر الخطوة 7.1).
- وضع أنابيب تحتوي على غسلها مبد-الخرز البيوتين (الخطوة 4.4) على موقف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة وإزالة السائل دون إزعاج الخرز. إضافة 500 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني المجزأ المخفف في حبة غسل العازلة.
- ختم جميع أنابيب بإحكام مع فيلم البارافين وتركها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على نهاية إلى نهاية موقف دوران في 8-10 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: يمكن إجراء الحمض النووي وبيوتين حبة رد فعل ملزم لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ولكن تركه في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها يمكن أن تحسن الانتعاش من الحمض النووي ميثليته النهائي.
6. إزالة الحمض النووي غير منضم وإلحاق الحمض النووي ميثيلاتد من الخرز
- بعد الحمض النووي و MBD- حبة رد فعل ملزمة، ضع الأنابيب على الرف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة لتركيز جميع الخرز على الجدار الداخلي للأنبوب.
- إزالة السائل طاف مع ماصة دون لمسوالخرز وحفظ هذا غير محدود جزء عينة الحمض النووي على الجليد.
- إضافة 200 ميكرولتر من 1X العازلة غسل حبة إلى الخرز ووضع الأنابيب على الوقوف الدورية لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وضع الأنابيب على موقف المغناطيسي وإزالة السائل. كرر غسل مرتين أخريين لإزالة الحمض النووي المتبقية غير منضم.
- بعد غسل النهائي، إضافة 200 ميكرولتر من عالية الملح شطف العازلة (2000 ملي كلوريد الصوديوم)، المنصوص عليها في عدة لأزل الحمض النووي.
- وضع الأنابيب على موقف الدورية لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وضعها على موقف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة واستخدام ماصة لنقل بعناية طاف إلى جديد، أنبوب نظيفة 1.5 مل.
- إضافة 200 ميكرولتر من الملح عالية شطف العازلة وتكرار شطف عن طريق تدوير الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. إضافة النوت الثاني إلى نفس أنبوب يحتوي على 200 ميكرولتر من أول النوت.
ملاحظة: النهائي 400 ميكرولتر من الحمض النووي إلوتد الكلي هو الآن على استعداد للإيثانول هطول الأمطار لاستخراج المنقىالحمض النووي مناسبة لتسلسل الجيل القادم.
7. الإيثانول هطول وإثراء الحمض النووي الميثيل
- إضافة 1 ميكرولتر من الجليكوجين (20 ميكروغرام / ميكرولتر؛ المدرجة في مجموعة)؛ 40 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5.2. و 800 ميكرولتر من الايثانول المطلق الجليد الباردة إلى 400 ميكرولتر من الحمض النووي إلوت وأيضا إلى 400 ميكرولتر من عينات الحمض النووي المدخلات أعدت في الخطوة 5.2.
- مزيج أنابيب جيدا من قبل فورتيكسينغ واحتضان لهم في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- أجهزة الطرد المركزي أنابيب في 12،000 زغ (السرعة القصوى) و 4 درجات مئوية. تجاهل طاف بعناية، دون إزعاج بيليه، إضافة 500 ميكرولتر من الايثانول 70٪، ودوامة الأنابيب.
- أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في أقصى سرعة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وإزالة طاف عن طريق استخدام بعناية ماصة.التسخين أنابيب في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وإزالة الايثانول المتبقية تماما باستخدام طرف ماصة.
- الهواء الجاف بيليه لمدة 5 دقائق في غرفة تيمبrature. إضافة 10 ميكرولتر من المياه الخالية من الدناز إلى بيليه الحمض النووي. المضي قدما في الكمي الحمض النووي ميثليته (الخطوة 7.6)، مبد التسلسل (الخطوة 7.7)، وتحليل (القسمين 8 و 9).
- تحديد عينات الحمض النووي الميثيلية المستردة النهائية باستخدام مجموعة الكميات الفلورومترية المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد )، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- ملاحظة: باستخدام هذا البروتوكول، تم استرداد 30-50 نانوغرام من الحمض النووي النهائي من كل عينة. عينات الحمض النووي على استعداد لإرسالها على الجليد الجاف لبناء مكتبة المصب وارتفاع الإنتاجية مبد التسلسل
- أداء البناء دنا مكتبة و الإنتاجية العالية التسلسل مب باستخدام منصة تجارية ( المواد الجدول )، كما هو موضح في المرجع 9 .
ملاحظة: لمراقبة الجودة الأولية من الحمض النووي الميثليته النهائي، تنفيذ الاستعدادات مكتبة باستخدام 50 بب الزوج نهاية تسلسل لجميع العينات. معالجة البيانات الخام لمراقبة الجودة بعد التسلسل، أ(8)، ومواصلة معالجتها باستخدام نهج المعلوماتية الحيوية والطرق الإحصائية، على النحو المبين أدناه (الخطوات 8-2-9-6).
8. التحليل المعلوماتية الحيوية الطريقة 1: تحديد المناطق المرتبطة بتفاضلية كل (كلدمرز)
- تنظيف الحصول على 49-بب يقرأ (شكل فاستق) للمهايئات باستخدام أدوات مراقبة الجودة المتاحة، مثل تريموماتيك 10 أو كوتادابت. كروسشيك نوعية القصص قلص باستخدام مجموعة أدوات فاستك:
جافا -jar trimmomatic.jar سي SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq إلوميناكليب: adaptators.fasta: 2: 30: 10 - محاذاة الملفات فاستق تنظيفها مع قراءة قصيرة الجينوم ألينر بوتي ضد الجينوم المرجعي 11 . حدد المعلمات على النحو التالي:
- السماح بحد أقصى من عدم التطابق (معلمة بوتي: -v 2).
- الحد من التقارير إلى ستة أفضل التحالفات في القراءة (بوتي المعلمة: -m 6) للسيطرةلرسم الخرائط متعددة يقرأ.
بوتي -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq> SAMPLE.sam
ملاحظة: تحويل ملفات سام التي تم إنشاؤها للعينات الفردية بعد المحاذاة في بام باستخدام سامتولس.
عرض سامتولس -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam
- استخدام التحليل القائم على النموذج من تشيب-سيق (ماكس) المتصل الذروة على عينات الانحياز (بام) للتنبؤ المناطق المخصب / ميثليته من المجموعات الفرعية كل 12 .
ملاحظة: المقارنة I: استخدام عينة الإدخال كمجموعة التحكم وكل من عينات المريض عادي و كل مجموعات العلاج. هذه الخطوة هي جمع كل القمم السلبية (قمم المخصب في الإدخال / الخلفية). المقارنة الثانية: استخدام مجموعة العينة العادية كمجموعة السيطرة ومجموعة عينة المريض كل كمجموعة العلاج. وقد تم الحصول على قمم إيجابية هي كل المناطق المفرطة ميثليتها، والقمم السلبية هي كل المناطق ذات الميثيل المفروم هايبوميثيلاتد على المناطق العادية أو تفاضلية ميثيلاتد (دمرس).
macs14 -t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --format بام -g هس - إزالة المقارنة I قمم الخلفية من مناطق ميثليتي التفاضلية (دمرس) باستخدام بدتولز 13 .
بيدتولز سبرتراكت -a <CLL_enriched_regions> -b <Input_enriched_regions> - توقع نسبة العناصر المتكررة (سين-ألو، لين، الخ ) المخصب في دمرس.
- استخدام فاستكمد لاستخراج تسلسل فاستا من دمرس من الإحداثيات الكروموسومات من مرجع الجينوم HG19.
فاستكمد -d HG19_genome.fa -s كروموسوم -L ستارت، إند -l 50000> DMRs.fasta - استخدام أداة سطر الأوامر ريبيتماسكر للتنبؤ نسبة تكرار العناصر الموجودة في تسلسل فاستا تيه من دمرس.
ريبيتماسكر -gc -gccalc -s -species الإنسان -html DMRs.fasta
- استخدام فاستكمد لاستخراج تسلسل فاستا من دمرس من الإحداثيات الكروموسومات من مرجع الجينوم HG19.
- علق دمرس المتوقعة باستخدام هوميروس "annotatePeaks.pl" مع إنزمبل المتاحة [PMC4919035] سr جينكود [بميد 22955987] نص التعليق (بروتين الترميز وغير مكود النصوص).
annotatePeaks.pl DMRs.bed <جينوم> -gtf <إنزمبل أو جينكود غف>
ملاحظة: يوفر هذا معلومات عن توزيع القمم فوق المناطق الجينية المختلفة ( أي المروج، اكسون، إنترون، 3 'أوترس، و 5' أوترس) والمناطق بين المناطق. وتسمى النصوص أو الجينات المرتبطة دمرس الجينات الميثيلات التفاضلية (دمغس). - استخدام أداة التخصيب مع قاعدة البيانات الوظيفية المحدثة أو الحالية للعثور على وظائف المخصب من قبل دمغس كل (فقط البروتين الجينات الترميز) 14 .
ملاحظة: مجموعة الجينات تجميع استنادا إلى الشرح الوظيفي (جينيسف) 14 هو أداة في الوقت الحقيقي لتحليل التخصيب الوظيفي الذي يستخدم كيغ تحديث و جين أونتولوغي كقاعدة بيانات مرجعية.
9. المعلوماتية الحيوية التحليل 2: تحديد كل المرتبطة المرتبطة بشكل كبيرإيثنتيالي ميثيلاتد ريجيونس (كل سيغمر's's)
- اتبع الخطوات 8،1-8،5 من الطريقة I (القسم 8) واستخدام تحليل التخصيب التفاضلي القائم على قراءة العد من خلال الاستفادة من الأدوات المتاحة، على النحو المبين في الخطوات 9.2-6.6، لإضافة مستوى واحد أكثر من الإحصاءات لخط أنابيب التحليل.
- تحديد عدد القراءات التي تم تعيينها إلى قمم فردية أو دمرس في عينات المريض عادي و كل باستخدام "فيتسكونتس" من حزمة "سوبريد" 15 .
سوبريد / بن / فيتوريسكونتس -Q 30 -F ساف -A دمرس.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam
مالحظة: يمكن إدخال مرشح جودة الخرائط لتفادي القياس الكمي للقراءات ذات الجودة السيئة) على سبيل المثال، -Q 30 (. لهذه الخطوة، وإعداد ملفات القوات المسلحة السودانية للحصول على دمرس التي تم الحصول عليها. لمزيد من المعلومات حول تنسيق ملف القوات المسلحة السودانية، يرجى استخدام هذا الرابط http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/. - استخدام جدول قراءة عدد راو يحتوي على عدد من القراءات للقمم الفردية في عادي أد مجموعات عينة المريض كل في حافة كما المدخلات 16 .
ملاحظة: مقارنة العادية مقابل كل عينة عينات المريض للعثور على سيغدمرس. لتحليل التخصيب التفاضلي، اتبع دليل من ريدر للحصول على تعليمات مفصلة خطوة بخطوة (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf). - تصفية سيغدمرس باستخدام معدل اكتشاف كاذبة (فدر) وتغيير سجل أضعاف تنبأ بها حافة 16 .
- علق سيغدمر المتوقع باستخدام هوميروس "annotatePeaks.pl" مع إنسمبل أو جينكود التعليق التوضيحي النص (بروتين الترميز وغير مكود النصوص).
annotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf <إنزمبل أو جينكود غف> -CpG
ملاحظة: يوفر هذا معلومات عن توزيع القمم فوق المناطق الجينية المختلفة ( أي المروج، اكسون، إنترون، 3 'أوترس، و 5' أوترس) والمناطق بين المناطق. النصوص أو الجينات المرتبطة سيويسمى غمرز سيغدمغس. - استخدام أداة تخصيب مع قاعدة بيانات وظيفية محدثة أو الحالية للعثور على وظائف المخصب بواسطة سيغدمغس كل (البروتين فقط ترميز الجينات) 14 .
ملاحظة: جينيسف، واحدة من الأدوات في الوقت الحقيقي لتحليل تخصيب وظيفي، يستخدم كيغ والجينات أونتولوغي كما قواعد البيانات المرجعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إجراء مبد-سيق مؤخرا على المرضى كل والضوابط مطابقة، طبيعية، صحية لتحديد كل محددة الجينات فرط و هيبوميثيلات محددة 7 . يتم عرض خط أنابيب التجريبية والبيوانفورماتيكية المستخدمة لتحليل البيانات الناتجة عن كل وعينات صحية طبيعية في الشكل 1A و 1 B. وحددت هذه التحاليل العديد من المناطق ذات الميثيل المخصب (كلدمرز)، والتي كانت مفرطة بشكل مفرط / هايبوميثيلد من عينات إيغف المتحولة و إيغف-أونموتاتد مقارنة بعينات السيطرة، مع قيمة P <0.00001. ويبين الشكل 2A جميع كلدرس التي تم الحصول عليها من كل من الخلايا B العادية ومقارنات بمبك العادية. تم تعيين كل كلدمرس إلى فئات مختلفة من البروتين الترميز والجينات غير الشفرة، كما هو مبين في الشكل 2B . الأهم من ذلك، في هذا التحليل، كانت المقارنات بيرفورميد بشكل مستقل بين عينات المريض كل، مع اثنين من الضوابط العادية المختلفة، فرز الخلايا B و بمبس. ومن المثير للاهتمام، أن التحليل أدى إلى تداخل كبير بين كل من الجينات المميثلية (كلدمغس)، و 851 هيبيرميلاتد و 2،061 هيبوميثيلاتد) بالمقارنة مع السيطرة على الخلايا B العادية والعينات السيطرة بمك العادية ( الشكل 2C )، مما يشير إلى أن هذه كلدمغس يمكن أن يكون ممكن الجينات التوقيع كل مع أدوار هامة في المرض المرضية. لتعزيز البيانات التي تم تحليلها، تم التحقق من صحة العديد من المواقع كبغ الموجود في واحد بروتين هيبيرميلاتد الترميز الجينات، SKOR1 ، واحد هيبوميثيلاتد طويلة لينكرنا غير المشفرة، AC012065.7 ، باستخدام طريقة بايروسكنسينغ، كما هو موضح في المنشورات السابقة 7 ، 17 ، 18 ( الشكل 3A و ب ). ويبين الشكل 4 الحمض النووي قص بعد بروتوكول سونيكيشن. وتتراوح الحمض النووي مجزأ بين 150 و 300 نقطة أساس، مما يجعلها مثالية لأغراض التسلسل.
الشكل 1: نظرة عامة على تدفق العمل المستخدمة في هذه الدراسة. هذا الرقم، الذي تم الحصول عليه من منشوراتنا الأخيرة 7 ، يظهر تصميم التحليل الشامل المستخدم لتحديد المناطق الميثيلية التفاضلية (دمرس) في عينات سرطان الدم الليمفاوي المزمن (كل). ( أ ) التصميم التجريبي للإثراء القائم على برميل الميثان من الحمض النووي الميثيلي. ( ب ) خط أنابيب تحليل المعلوماتية البيولوجية المستخدم لتحديد مناطق الميثيلد التفاضلية (كلدرس) ذات الاختلاف التفاضلي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
. في غضون الصفحات = "1"> 
الشكل 2: كلدرمز هيبيرميثيلد و هيبوميثيلد و كلدمغس من كل عينات المريض مقارنة طبيعية، صحية، فرزها خلايا B 7 . ( أ ) كل سرطان الدم الليمفاوي المزمن (كل) - يرتبط بالمناطق الميثيلية تفاضلية مع قيم P كبيرة (<0.00001) التي تم الحصول عليها من مقارنة إيغف-تحور عينات كل غير محسوبة إلى خلايا B فرزها العادي (اللوحة العليا) والعينات بمك العادية (اللوحة السفلى). وكانت التخصيب المبين في خريطة الحرارة ضمن نافذة ± 3 كيلوبايت من منطقة ميثليتي التفاضلية (دمرس). ( ب ) رسم بياني فين يبين تداخل الجينات المميثلة اختلافا من نوع كل (كلدمغس؛ هيبيرميثيلد و هايبوميثيلاتد) بين المجموعات إغف متحور و إيغف-أونموتاتد المجموعات. ويمثل المخطط الدائري النسبة المئوية للجينات التي تنتمي إلى تصنيف مختلف، مثل ترميز البروتين، رنا غير نكودينغ طويلة (لكرنا)، الجينات الخادعة، المضادات، وغيرها من الرنا غير المشفرة. ( ج ) رسم بياني فين يبين تداخل الجينات المشتركة المميثلة تفاضليا (المجموعات المتنبأ بها إيغف-إغف-أونموتاتد) بين مقارنات الخلية B و بمك. اللوحة اليسرى من الرسم البياني فين يظهر التداخل للجينات هيبيرميلاتد واللوح الأيمن للجينات هايبوميثيلاتد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التحقق من حالة ترشيح الحمض النووي لمواقع كبغ الفردية على الجينات المستهدفة المميتة بشكل تفاضلي كبير. بيانات بايروسكنسينغ لتحديد الكمي لنسبة مثيلة الحمض النووي لجينتين مختارة باستخدام اللمفاويات المزمنة مستقلةاللوكيميا (كل) عينة نموذجية تحتوي على 54 عينة و 6 طبيعية، صحية، تتطابق مع عينات الخلايا B. ( A ) تمثل بكسلوتس النسبة المئوية لمستويات مثيلة ل 3 مواقع كبغ الفردية من الجينات SKOR1 هيبيرميلاتد باستخدام بايروسكنسينغ. ( B ) و بوكسلوت يظهر درجة من مثيلة ل 5 مواقع كبغ الفردية من الجينات AC012065.7 هيبوميثيلاتد باستخدام بايروسكنسينغ. تشير الصناديق إلى المدى بين الربعين (25-75٪)، بينما يشير الخط الأفقي الداخلي إلى القيمة المتوسطة. تمثل شعيرات القيم الدنيا والقصوى. وتظهر قيمة p المقابلة لدرجة مثيلة التفاضلية من عينات كل على الخلايا B العادية في بوكسلوتس لكل موقع كبغ الفردية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مبد-سيق هو تقنية فعالة من حيث التكلفة، على أساس مناعي التي يمكن استخدامها لدراسة أنماط مثيلة مع تغطية كاملة على نطاق الجينوم. كل من ميديب سيق (ميثليته الحمض النووي مناعي تليها التسلسل) والنتيجة مبد-سيق في إثراء الحمض النووي ميثيلاتد كبغ الغنية. ومع ذلك، مب-سيق يظهر المزيد من التقارب نحو ملزم إلى المناطق الغنية كبغ بالمقارنة مع ميديب تساوي 19 . باستخدام مجموعة إثراء ملزم الميثيل، يمكن للمرء أن تجزئ الحمض النووي في المناطق عالية كبغ و منخفضة كبغ الغنية عن طريق التصفية الحمض النووي مع مخازن عالية الملح ومنخفضة الملح، على التوالي. في هذا التحقيق، تم تنفيذ شطف جزء واحد فقط لالتقاط المناطق الغنية للغاية كبغ الغنية التي تغطي معظم الجزر كبغ.
مبد-سيق يمكن أن يكون بديلا قويا ل وغبس، والذي يشيع استخدامه في كل وغيرها من التحقيقات اللوكيميا. على الرغم من مبد-سيق يتطلب كميات أعلى نسبيا من الحمض النووي المدخلات مقارنة مع ثنائي الكبريتالطرق القائمة على التحويل، فإنه يسمح للتحقيق في التغيرات مثيلة العالمية التي هي محددة فقط ل 5 تعديلات ميك، دون أي التحيز التضخيم ير إنشاؤها بعد التحويل. وبالتالي، مبد-سيق هو طريقة مثالية لمعالجة كلدمغس، والتي يمكن أن تكون الجينات توقيع كل الجينية القائمة على الجينية مع قيمة النذير.
العوامل الحاسمة لأداء هذا الأسلوب هي نوعية ونطاق صوتنة من الحمض النووي المجزأة المستخدمة قبل رد فعل ملزم. وأظهرت جميع العينات نطاقات شظية أقصر، بين 150 و 300 نقطة أساس ( الشكل 4 )، مما أدى إلى نتائج تسلسل ذات نوعية جيدة، مع حوالي 25-33 مليون يقرأ فريدة لكل عينة رسم الخرائط إلى الجينوم بعد تصفية البيانات والتنظيف.
وأخيرا، تم التحقق من صحة حالة مثيلة من كلدمغس فرط و هيبيوميثيلات لعدد قليل من الجينات باستخدام طريقة بايروسكنسينغ في أترابية عينة مستقلة. هذا الأسلوب يعطي بيرسناتج من مثيلة الحمض النووي، اعتمادا على نسبة من C إلى T في مواقع كبغ الفردية على أساس كمية C و T أدرجت خلال تمديد تسلسل. أظهرت كلدمغس هيبيرميلاتد نسبة عالية من مثيلة في عينات كل مقارنة العينات العادية. وبالمثل، أظهرت كلدمغس هيبوميثيلات عكس ذلك. وترد بيانات بيروسكنسينغ ل كلدمغس اثنين في الشكل 3 .
وبالمقارنة مع الأساليب المستندة إلى الصفيف، تسمح هذه الطريقة بإجراء فحص أوسع للتسلسل عبر الجينوم، بما في ذلك المناطق المشروحة سابقا التي تغطي مناطق ترميز البروتين والتسلسل غير المشروح الذي يشمل العناصر المتكررة و لكرناس. وهكذا، فإن هذا النهج على مرضى كل تحديد عدة كلدمغس رواية تمتد ل لنرنا والعناصر المتكررة. وبما أن هذه التحقيقات لم يتم إجراؤها سابقا في عينات المريض، فإن هذه الدراسة تعتبر مصدرا قيما لتحديد المناطق الميثيلية التفاضلية المرتبطة ب كلمختلف النذير المجموعات الفرعية. وسوف تكون هذه كلدمغس بمثابة المؤشرات الحيوية الجديدة والأهداف للعلاج الدوائي جينية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من قبل مجلس البحوث السويدي، والجمعية السويدية للسرطان، ومؤسسة كنوت وآليس والنبرغ (كاو)، وفو فاستراغوتالاندسريجيونين.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer pH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5 mL | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5 mL tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
- Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
- Cahill, N., et al. 450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments. Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).
- Kanduri, M., et al. Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles. Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).
- Kulis, M., et al. Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).
- Booth, M. J., et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science. 336 (6083), 934-937 (2012).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
- Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL. Clin Epigenetics. 8, 106 (2016).
- Hallek, M., et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).
- De Meyer, T., et al. Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing. PLoS One. 8 (3), e59068 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Subhash, S., Kanduri, C. GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms. BMC Bioinformatics. 17 (1), 365 (2016).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Martinelli, S., et al. ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).
- Kopparapu, P. K., et al. Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression. Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).
- Robinson, M. D., et al. Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation. Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).
