Summary
Detta arbete beskriver ett optimerat metyl-CpG-bindningsdomän (MBD) sekvenseringsprotokoll och en beräkningsrörledning för identifiering av differentiellt metylerade CpG-rika regioner hos patienter med kronisk lymfocytisk leukemi (CLL).
Abstract
Rollen av långa icke-kodande RNA (lncRNA) i cancer kommer fram i framkant på grund av ökat intresse för att förstå deras mekaniska funktioner under cancerutveckling och progression. Trots detta har den globala epigenetiska förordningen av lncRNA och repetitiva sekvenser i cancer inte undersökts väl, särskilt vid kronisk lymfocytisk leukemi (CLL). Denna studie fokuserar på ett unikt förhållningssätt: den immunprecipitationsbaserade infångningen av dubbelsträngade, metylerade DNA-fragment med användning av metyl-bindande domän (MBD) proteiner följt av nästa generations sekvensering (MBD-seq). CLL-patientprover som tillhörde två prognostiska undergrupper (5 IGVH-muterade prover + 5 IGVH-omuterade prover) användes i denna studie. Analys avslöjade 5 800 hypermetylerade och 12 570 hypometylerade CLL-specifika differentiellt metylerade gener (cllDMG) jämfört med normala friska kontroller. Viktigt är att dessa resultat identifierade flera CLL-specifika, differentiellt metylerade lncRNA, rePetitiva element och proteinkodande gener med potentiellt prognostiskt värde. I detta arbete beskrivs ett detaljerat protokoll för en MBD-seq- och bioinformatikpipeline som utvecklats för en omfattande analys av globala metyleringsprofiler i hög CpG-rika regioner med användning av CLL-patientprover. Slutligen validerades en proteinkodande gen och ett lncRNA med användning av pyro-sekvensering, vilket är en högt kvantitativ metod för att analysera CpG-metyleringsnivåer för att ytterligare bekräfta resultaten från MBD-seq-protokollet.
Introduction
Användningen av nästa generationens sekvenseringsteknik för att analysera globala DNA-metyleringsprofiler har blivit allt populärare under de senaste åren. Genomövergripande metyleringsanalyser, innefattande mikroarray- och icke-mikroarraybaserade metoder, utvecklades baserat på följande: bisulfitomvandlingen av genomiskt DNA, metyleringskänslig restriktionsenzym-digestioner och immunutfällningen av metylerat DNA med användning av metyl-CpG-specifika antikroppar .
Aberrant DNA-metylering är en av kännetecknen för leukemi och lymfom, inklusive kronisk lymfocytisk leukemi (CLL). Tidigare har flera grupper, inklusive våra, karakteriserat DNA-metyleringsprofilerna för olika CLL-prognostiska undergrupper och normala, hälsosamma B-cellkontroller med användning av bisulfitomvandlingen av genom-DNA, följt av mikrometrisbaserade metoder eller genom genomsekvenser 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. Bisulfitomvandlingen av genomiskt DNA leder till deaminering av omodifierade cytosiner till uracil, vilket lämnar de modifierade metylerade cytosinerna i genomet. När omvandlad kan DNA-metyleringsstatusen bestämmas genom PCR-amplifiering och sekvensering med användning av olika kvantitativa eller kvalitativa metoder, såsom mikrometrisbaserad eller helgenoms-bisulfit-sekvensering (WGBS). Även om bisulfitkonverteringsbaserade metoder har många fördelar och används ofta i olika cancertyper för att analysera DNA-metyleringsnivåer, finns det några nackdelar associerade med denna teknik. WGBS-sekvensering möjliggör enkelbasbaserad upplösning med lägre mängder DNA och är det bästa lämpliga alternativet för att analysera ett stort antal prover. Emellertid misslyckas denna metod att differentiera modifieringarna mellan 5 mC och 5 hmC-nivåerna i genomet 5 , 6 . Dessutom erbjuder microarray-baserade metoder inte komplett cOverage av genomet.
I en nyligen genomförd studie från vårt laboratorium 7 användes immunprecipitationsbaserade metoder, snarare än bisulfitkonvertering, för att identifiera högt CpG-rika, differentiellt metylerade regioner i global skala hos CLL-patienter och normala friska kontroller. Inmetyl-CpG-bindande domän (MBD) nästa generations-sekvensering (MBD-seq) beror anrikningen av dubbelsträngat fragmenterat DNA på graden av CpG-metylering. Denna metod kan övervinna nackdelarna med bisulfitomvandlingsmetoden och kan även tillhandahålla genomomsättning av CpG-metylering på ett opartiskt och PCR-oberoende sätt. Dessutom kan MBD-seq, till skillnad från bisulfitkonverteringsbaserade mikroarraymetoder, användas för att analysera metyleringsstatus för repetitiva element, såsom långa interspersed-kärnämnen (LINE), korta interspersed-kärnämnen (SINE), långa terminala upprepningar (LTRS), Etc. Emellertid, jämfört med bisulfitomvandlingsmetoder,Ett MBD-seq-protokoll kräver en relativt stor mängd inmatnings-DNA. Kvaliteten på sekvenseringen läser också och data beror på specificiteten, affiniteten och kvaliteten på antikropparna som används.
Den aktuella studien förklarar ett detaljerat MBD-seq-protokoll för berikning av metylerat DNA för nästa generations sekvensering. Den använder ett kommersiellt metylerat DNA-bindande anriknings kit (listat i materialtabellen ), liksom en beräkningsrörledning för att visualisera och tolka metyleringssekvenseringsdata för att identifiera CLL-specifika hyper- och hypometylerade regioner jämfört med normala friska kontroller. I grund och botten utnyttjar denna metod förmågan hos MBD för humant MBD2-proteininteraktion med metylerade CpGs för att extrahera DNA som är berikat med metylerade CpG, och detta följs av hög genomströmnings-sekvensering av metylerat DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det etiska godkännandet för att samla CLL-proverna är från 2007-05-21, med följande registreringsnummer: EPN Gbg dnr 239/07. Alla CLL-patienter diagnostiserades enligt nyligen reviderade kriterier 8 och proven samlades vid diagnosstidpunkten. Patienterna i studien inkluderades från olika hematologiska avdelningar i västra delen av Sverige efter skriftligt samtycke. Endast prover av CLL perifert blodmononukleär cell (PBMC) med en tumörprocent av leukemiceller ≥70% valdes i denna studie.
1. Förberedelser
- Isolera PBMC för DNA-extraktioner från CLL och normala, friska perifera blodprover med ett kommersiellt isoleringspaket (se materialtabellen ) enligt tillverkarens instruktioner.
- Autoklav 1,5 ml rör. Tina alla reagens i det metylerade DNA-bindningssatsen (se materialtabellen ). </ Li>
- Använd DNase-fri vatten för att framställa 10 ml 1x pärlvattensbuffert från 5x lagervasbufferten som tillhandahålls av satsen för att tvätta pärlor och späd MBD-proteinet som tillhandahålls av satsen.
- Hämta eller förbereda följande föremål i förväg: 3 M natriumacetat, absolut etanol och 70% etanol för DNA-utfällning ( materialtabell ).
2. Genomisk DNA-extraktion och sonikering
- Använd ett kommersiellt tillgängligt DNA-extraktionskit ( Materialtabell ) för att isolera genomiskt DNA från patient- och normala PBMC-prover enligt tillverkarens protokoll. Kvantifiera genom-DNA med användning av en spektrofotometer vid 260 nm.
OBS: DNA-extraktionskolonnens kapacitet är 5-6 miljoner celler, maximalt; Därför är det viktigt att använda mer än en kolonn för prover med mer än 5 miljoner celler. Eliminera DNA två gånger i lika stora volymer som totalt 100 μl 10 mM Tris EDTA (TE) -buffert. Det MBD-biotinprotein som används i metylenMiner-kit för MBD-sekvensering kommer inte att binda till enkelsträngat DNA. Det är sålunda väldigt viktigt att hålla det eluerade DNAet antingen fruset eller vid 4 ° C för att bevara sin dubbelsträngade natur. - Späd 5 μg genomiskt DNA från varje prov till totalt 200 μl med användning av TE-buffert (pH 8), vilket ger en slutlig koncentration av 25 ng / μl.
- Utför ljudbehandling i specialdesignade rör med hjälp av en sonikator ( materialbord ) i sammanlagt 30 cykler (30 s på och 30 s av varje cykel, vart kort efter varje 5 cykler rören för att samla proven till botten).
OBS: Detta kommer att producera fragmenterat DNA som sträcker sig mellan 150 bp och 300 bp, vilket är optimalt för detta protokoll. - Kontrollera sonikeringsområdet för alla prover innan du går vidare till nästa steg för MBD-sekvensering genom att köra 1 jil av de fragmenterade DNA-proverna och en DNA-storleksstege på en kommersiellt tillgänglig, förgjuten 2% agarosgel med användning av DNA-elektroforesbildningsutrustning. Visualisera tHan DNA använder en standard UV-transilluminator.
3. Beadberedning före bindning med MBD-biotinprotein
- Resuspendera de magnetiska streptavidinpärlorna från stamröret som tillhandahålls av satsen, pipettera försiktigt upp och ner för att erhålla en homogen suspension. Vortexa inte pärlorna eller låt dem torka.
- Placera 50 μl pärlor (för varje 5 pg fragmenterat DNA-prov) i separata, rena och märkta 1,5 ml rör. Tillsätt 50 μl 1x pärlvattenspuffer för att nå den slutliga volymen 100 | il.
ANMÄRKNING: Vid användning av små 0,5 ml polymeras kedjereaktionsremsor (PCR) för tvättning av pärlor används omkring 150-200 pi tvättbuffert per rör, vilket nämns i kit-protokollet. När det gäller 1,5 ml rör tillsätt emellertid åtminstone 250 μl till 300 μl tvättbuffert per rör för pärlvattnet. - Placera rören på ett magnetiskt stativ i en minut för att låta alla magnetiska pärlor koncentrera sig på rörets innerväggVänd mot magneten. Avlägsna vätskan, utan att röra pärlorna, med en 200 μL pipett.
- Ta bort rören från magnetstativet, tillsätt 250 μL 1x pärlvattenbuffert och blanda pärlorna försiktigt med en pipett.
- Upprepa steg 3.3 och 3.4 minst 4-5 gånger för alla prover och resuspendera till slut i 250 μl 1x pärlvattenspuffbuffert. Håll dem på is.
4. Bindning av MBD-biotinproteinet till de tvättade pärlorna
- Tillsätt 35 μl MBD protein (7 μl för 1 μg DNA-prov) för att separera rören och bringa den totala volymen upp till 250 μl med användning av 1x pärlvattenbuffert.
- Tillsätt 250 μl utspätt MBD-protein till 250 μl tvättade pärlor och lämna dem på änd-till-ände rotation vid rumstemperatur under 1 h.
- Efter blandning av pärlorna och proteinet i 1 h, tvätta MBD-proteinbiotinet bunden med magnetiska streptavidinpärlor.
- Placera rören på magnetstativet i 1 min och ta bort tHan vätska utan att röra pärlorna med hjälp av en pipett. Tillsätt 250 μl 1x pärlsvampbuffert och placera rören på en rotationsblandare i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Upprepa steg 4.3.1 två gånger och resuspendera slutligen de tvättade MBD-biotinpärlorna i 200 μl 1x pärlvattensbuffert, vilket gör pärlorna redo för metylerad DNA-infångning.
ANMÄRKNING: Tvättning 2-3 gånger på detta sätt avlägsnar hela bakgrunden obundna MBD-proteinpärlor och förbättrar effektiv bindning av MBD-proteinkopplade pärlor med fragmenterat genomiskt DNA.
5. Bindande MBD-biotinpärlor med fragmenterat genomiskt DNA
- I ett rent 1,5 ml DNase-fritt rör tillsättes 100 μl 5x pärlvätskebuffert och 180 pi av det fragmenterade genomiska DNA-värdet (steg 2.3). Ta den slutliga volymen till 500 | il med användning av DNase-fritt vatten.
- Tillsätt 380 μL DNase-fri vatten till de återstående 20 | il av det fragmenterade genomiska DNA och frysa dem. Använd dessa prov som input DNEn kontroller och fällning dem senare tillsammans med de slutliga eluerade metylerade DNA-proverna (se steg 7.1).
- Placera rören som innehåller tvättade MBD-biotinkulor (steg 4.4) på ett magnetiskt stativ i 1 min och avlägsna vätskan utan att störa pärlorna. Tillsätt 500 μl fragmentat genomiskt DNA utspätt i pärlvätskebuffert.
- Täta alla rören tätt med paraffinfilm och lämna dem över natten vid 4 ° C på en rotationsläge vid 8-10 varv per minut.
OBS: DNA- och biotin-bindningsbindningsreaktionen kan göras i 1 timme vid rumstemperatur, men lämnar den vid 4 ° C över natten kan förbättra återvinningen av det slutliga metylerade DNA.
6. Avlägsna det obundna DNA: n och avlägsna det metylerade DNA från pärlorna
- Efter DNA- och MBD-pärlbindningsreaktionen, placera rören på magnetstativet i 1 min för att koncentrera alla pärlorna på rörets innervägg.
- Ta bort supernatantvätskan med en pipett utan att röraPärlorna och spara den obundna DNA-provfraktionen på is.
- Tillsätt 200 μl 1x pärlsvampbuffert till pärlorna och placera rören på roterande stativ i 3 minuter vid rumstemperatur. Placera rören på magnetstativet och ta bort vätskan. Upprepa tvätten ytterligare två gånger för att avlägsna resterande obundet DNA.
- Efter den slutliga tvätten tillsätt 200 μL högsalt elueringsbuffert (2000 mM NaCl), som tillhandahålls i satsen för att eluera DNA: t.
- Placera rören på roterande stativ i 15 minuter vid rumstemperatur. Placera dem på magnetstativet i 1 minut och använd en pipett för att försiktigt överföra supernatanten till ett nytt, rent 1,5 ml rör.
- Tillsätt 200 μl högsalt elueringsbuffert och upprepa elueringen genom att rotera rören vid rumstemperatur i 15 minuter. Tillsätt den andra elueringen till samma rör innehållande 200 pl av den första elueringen.
OBS! Den slutliga 400 | il av totalt eluerat DNA är nu klart för etanolutfällning för att extrahera det renadeDNA lämpligt för sekvensering av nästa generation.
7. Etanolutfällning och berikning av metylerad DNA
- Tillsätt 1 μl glykogen (20 μg / μl; ingår i satsen); 40 | il av 3 M natriumacetat, pH 5,2; Och 800 | il iskall absolut etanol till 400 | il eluerat DNA och även till 400 | il IN-DNA-prover framställda i steg 5.2.
- Blanda rören väl med vortex och inkubera dem vid -80 ° C över natten.
- Centrifugera rören vid 12 000 xg (maximal hastighet) och 4 ° C. Kassera supernatanten försiktigt, utan att störa pelleten, tillsätt 500 μL 70% etanol och vortexa rören.
- Centrifugera igen vid maximal hastighet i 15 minuter vid 4 ° C och avlägsna supernatanten genom att försiktigt använda en pipett. Centrifugera rören med maximal hastighet i 1 min vid rumstemperatur och avlägsna resterande etanol fullständigt med en pipettspets.
- Lufttorka pelleten i 5 minuter vid rumstemperaturenrature. Tillsätt 10 μl DNase-fri vatten till DNA-pelleten. Fortsätt till den metylerade DNA-kvantifieringen (steg 7.6), MBD-sekvensering (steg 7.7) och analys (sektionerna 8 och 9).
- Kvantifiera de slutliga återvunna metylerade DNA-proverna med användning av ett kommersiellt tillgängligt fluorometriskt kvantifieringspaket (se materialtabellen ) enligt tillverkarens instruktioner.
- Anmärkning: Användning av detta protokoll utvanns 30-50 ng slutligt DNA från varje prov. DNA-prover är klara att sända på torris för nedströms bibliotekskonstruktion och hög genomströmning MBD-sekvensering
- Utför DNA-bibliotekskonstruktion och hög genomströmning MBD-sekvensering med användning av en kommersiell plattform ( Materialbord ), såsom beskrivs i referens 9 .
ANMÄRKNING: För den ursprungliga kvalitetskontrollen av det slutliga metylerade DNA, utföra bibliotekspreparationer med användning av 50-bp par-änds-sekvensering för alla prover. Bearbeta rådata för kvalitetskontroll efter sekvensering, aS utarbetas i steg 8.1 och vidare bearbetar det med hjälp av bioinformatikmetoder och statistiska metoder, som beskrivs nedan (steg 8.2-9.6).
8. Bioinformatikanalys Metod 1: Identifiering av CLL-associerade differentiellt metylerade regioner (cllDMRs)
- Rengör de erhållna 49-bp-läsningarna (FASTQ-format) för adaptrar som använder tillgängliga kvalitetsstyrningsverktyg, till exempel Trimmomatic 10 eller Cutadapt. Crosscheck kvaliteten på den trimmade läsningen med hjälp av FastQC-verktygssatsen:
Java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP: adapters.fasta: 2: 30: 10 - Justera de rengjorda FASTQ-filerna med kortläsningsgenomjusterare Bowtie mot ett referensgenom 11 . Ange parametrarna nedan:
- Tillåt upp till två felaktigheter (Bowtie parameter: -v 2).
- Begränsa rapporteringen till de sex bästa anpassningarna per läsning (Bowtie parameter: -m 6) för att styraFör multi-mapping läser.
Bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq> SAMPLE.sam
OBS! Konvertera SAM-filerna som genereras för enskilda prover efter anpassning till BAM med hjälp av SAMTools.
Samtools visa -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam
- Använd den modellbaserade analysen av ChIP-Seq (MACS) toppsamtalare på inriktade prov (BAM) för att förutsäga berikade / metylerade regioner från CLL-undergrupperna 12 .
OBS: Jämförelse I: Använd Input-provet som kontrollgrupp och både Normal- och CLL-patientproverna som behandlingsgrupper. Detta steg är att samla alla negativa toppar (toppar berikade i Input / Background). Jämförelse II: Använd den normala provgruppen som kontrollgrupp och CLL-patientprovgruppen som behandlingsgrupp. Erhållna positiva toppar är CLL-hypermetylerade regioner, och negativa toppar är CLL-hypometylerade regioner över normala eller differentiellt metylerade regioner (DMR).
macs14-t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --format BAM -g hs - Ta bort Jämförelse I bakgrundstoppar från differentiellt metylerade områden (DMR) med BEDtools 13 .
Bedtools subtrahera -a <CLL_enriched_regions> -b <Input_enriched_regions> - Förutse procentdelen av upprepade element (SINE-Alu, LINE, etc. ) berikad i DMR.
- Använd fastacmd för att extrahera FASTA-sekvensen av DMR genom de kromosomala koordinaterna från referensgenomet HG19.
Fastakmd -d HG19_genome.fa -s Kromosom -L Start, Slut -l 50000> DMRs.fasta - Använd kommandoradsverktyget RepeatMasker för att förutsäga procentandelen av upprepade element som finns i FASTA-sekvensen av DMR.
RepeatMasker -gc -gccalc -s -species human -html DMRs.fasta
- Använd fastacmd för att extrahera FASTA-sekvensen av DMR genom de kromosomala koordinaterna från referensgenomet HG19.
- Anteckna de förutspådda DMR: erna genom att använda Homer "annotatePeaks.pl" med tillgänglig ensembl [PMC4919035] oR Gencode [PMID 22955987] transkriptanotation (proteinkodning och icke-kodande transkript).
AnnotatePeaks.pl DMRs.bed <GENOME> -gtf <Ensembl eller Gencode GTF>
OBS: Detta ger information om fördelningen av toppar över olika genområden ( dvs. promotor, exon, intron, 3 'UTR och 5' UTR) och intergena regioner. Transkript eller gener associerade med DMR kallas differentiellt metylerade gener (DMG). - Använd anrikningsverktyget med den uppdaterade eller aktuella funktionella databasen för att hitta funktioner som berikas av CLL DMGs (endast proteinkodande gener) 14 .
OBS: Gene Set Clustering baserat på Functional Annotation (GeneSCF) 14 är ett realtidsbaserat verktyg för funktionell berikningsanalys som använder uppdaterad KEGG och Gene Ontology som referensdatabas.
9. Bioinformatikanalys Metod 2: Identifiera CLL-associerad signifikant diffI huvudsak metylerade regioner (cll sigDMR s)
- Följ steg 8.1-8.5 från metod I (avsnitt 8) och använd läsberäkningsbaserad differentiell berikningsanalys genom att använda de tillgängliga verktygen, som utarbetats i steg 9.2 - 9.6, för att lägga till ytterligare en nivå av statistik till analyspipeln.
- Kvantifiera antalet läser kortlagda till enskilda toppar eller DMR i Normal och CLL patientprover med hjälp av "featureCounts" från "Subread" -paketet 15 .
Subread / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam
OBS! Ett kartläggningskvalitetfilter kan introduceras för att undvika att kvantifiera läsning av dålig kvalitet ( t ex -Q 30). För detta steg, förbereda SAF-filer för de erhållna DMR-erna. För mer information om SAF-filformat, använd den här länken http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/. - Använd en RAW-läsräkningstabell som innehåller antalet läser för de enskilda toppar i Normal anD CLL patientprovagrupper i kantR som ingång 16 .
ANMÄRKNING: Jämför normala klienter för CLL-patientgrupper för att hitta sigDMRs. För differentialanalysanalys, följ guiden från edgeR för detaljerade stegvisa instruktioner (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf). - Filtrera sigDMRs med hjälp av den falska upptäcktshastigheten (FDR) och log-fold-ändringen förutsatt av edgeR 16 .
- Anteckna de förutspådda sigDMR: erna genom att använda Homer "annotatePeaks.pl" med den tillgängliga ensembl- eller genkodstranscriptanotationen (proteinkodning och icke-kodande transkript).
AnnotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf <Ensembl eller Gencode GTF> -CpG
OBS: Detta ger information om fördelningen av toppar över olika genområden ( dvs. promotor, exon, intron, 3 'UTR och 5' UTR) och intergena regioner. Transkript eller gener associerade med siGDMRs kallas sigDMGs. - Använd ett anrikningsverktyg med den uppdaterade eller aktuella funktionella databasen för att hitta funktioner berikade av CLL sigDMGs (endast proteinkodande gener) 14 .
OBS! GeneSCF, ett av realtidsverktygen för funktionell berikningsanalys, använder KEGG och Gene Ontology som referensdatabaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MBD-seq utfördes nyligen på CLL-patienter och matchade, normala, friska kontroller för att identifiera CLL-specifika differentiellt hyper- och hypometylerade gener 7 . Den experimentella och bioinformatiska rörledningen som användes för att analysera data genererad från CLL och normala friska prover visas i Figur 1A och 1B . Dessa analyser identifierade flera CLL-specifika differentiellt metylerade regioner (cllDMRs), vilka var signifikant hyper / hypometylerade från IGHV-muterade och IGHV-omuterade prover jämfört med kontrollprover, med ett p-värde <0.00001. Figur 2A visar alla cllDMR erhållna från både normala B-cell- och normala PMBC-jämförelser. Alla cllDMRs mappades till olika klasser av proteinkodande och icke-kodande gener, såsom visas i figur 2B . Betydande, i denna analys var jämförelserna perforMed oberoende mellan CLL-patientproverna, med två olika normala kontroller, sorterade B-celler och PMBC. Intressant resulterade analysen i en stor överlappning av vanliga CLL-specifika differentiellt metylerade gener (cllDMGs, 851 hypermetylerad och 2,061 hypometylerad) jämfört med normal B-cellkontroll och normala PBMC-kontrollprover ( Figur 2C ), vilket tyder på att dessa cllDMG kan vara Möjliga CLL signaturgener med signifikanta roller i sjukdomspatogenes. För att stärka den analyserade data validerades flera CpG-ställen som lokaliserades i en hypermetylerad proteinkodande gen, SKOR1 och en hypometylerad lång icke-kodande lncRNA, AC012065.7 , med användning av en pyrosequensionsmetod, såsom beskrivits i tidigare publikationer 7 , 17 , 18 ( Figur 3A Och B ). Figur 4 visar skjuvad DNAEfter sonication protokollet. Det fragmenterade DNA-området ligger mellan 150 och 300 bp, vilket gör det idealiskt för sekvenseringsändamål.
Figur 1: Översikt över arbetsflödet som används i denna studie. Denna figur, som erhållits från vår senaste publikation 7 , visar utformningen av den övergripande analysen som användes för att identifiera de differentiellt metylerade regionerna (DMR) i patientprover med kronisk lymfocytisk leukemi (CLL). ( A ) Experimentell design av den MBD-baserade anrikningen av metylerat DNA. ( B ) Analys pipeline för bioinformatik användes för att identifiera CLL-specifika differentiellt metylerade regioner (cllDMRs). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Hypermetylerade och hypometylerade cllDMRs och cllDMGs av CLL-patientprover jämfört med normala, friska, sorterade B-celler 7 . ( A ) Alla kroniska lymfocytiska leukemi (CLL) -associerade differentiellt metylerade regioner med signifikanta p-värden (<0,001001) erhållna genom att jämföra de IGHV-muterade och -mututerade CLL-proverna till normalt sorterade B-celler (övre panelen) och normala PBMC-prover (Nedre panelen). De anrikningar som visas i värmekartan var inom ett ± 3-kb fönster från differentiellt metylerad region (DMR). ( B ) Venndiagram som visar överlappningen av CLL-specifika differentiellt metylerade gener (cllDMGs, hypermetylerade och hypometylerade) mellan IGHV-muterade och IGHV-omättade grupper. Sirkeldiagrammet representerar andelen gener som tillhör olika klassificeringar, såsom proteinkodning, Lång icke-kodande RNA (lncRNA), pseudogener, antisense och andra icke-kodande RNA. ( C ) Venndiagram som visar överlappningen av vanliga differentiellt metylerade gener (IGHV-muterade och IGHV-omuterade prognostiska grupper) mellan B-cell- och PBMC-jämförelser. Vänsterpanelen på Venn-diagrammet visar överlappningen för hypermetylerade gener och den högra panelen för hypometylerade gener. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Validering av DNA-metyleringsstatusen för individuella CpG-ställen på de markerade signifikant differentiellt metylerade målgenen. Pyrosekvenseringsdata för kvantifiering av procentandelen av DNA-metylering för två valda gener med användning av en oberoende kronisk lymfocytIC-leukemi (CLL) provkohort innehållande 54 prover och 6 normala, hälsosamma, ålders-matchade B-cellprover. ( A ) Boxplots representerar procentandelen metyleringsnivåer för 3 individuella CpG-ställen i den hypermetylerade SKOR1- genen med användning av pyrosequensering. ( B ) Boxplot visar graden av metylering för 5 individuella CpG-ställen av hypometylerad AC012065.7- gen med användning av pyrosequencing. Lådorna indikerar interkvartilområdet (25-75%), medan den inre horisontella linjen indikerar medianvärdet. Whiskers representerar minimi- och maximivärdena. P-värdet som motsvarar graden av differentiell metylering av CLL-prover över normala B-celler visas i rutplottorna för varje enskild CpG-plats. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MBD-seq är en kostnadseffektiv, immunutfällningsbaserad teknik som kan användas för att studera metyleringsmönster med fullständig genomomsättning. Både MeDIP-seq (metylerad DNA-immunutfällning följt av sekvensering) och MBD-seq resulterar i anrikning av CpG-rik metylerad DNA. Emellertid visar MBD-seq mer affinitet mot bindning till starkt CpG-riksområden när man jämfört med MeDIP-sekvens 19 . Med användning av ett metylbindande anriknings-kit kan man fraktionera DNA-en till hög CpG- och låg-CpG-rika regioner genom eluering av DNA med hög-salt- respektive lågsaltbuffertar. Vid denna undersökning utfördes endast en enda fraktion eluering för att fånga högberikade CpG-rika regioner som täckte de flesta av CpG-öarna.
MBD-seq kan vara ett kraftfullt alternativ till WGBS, som vanligen används i CLL och andra leukemiska undersökningar. Även om MBD-seq kräver relativt högre mängder inmatat DNA jämfört med bisulfitenOmvandlingsbaserade metoder, tillåter det undersökning av globala metyleringsändringar som är specifika endast för 5 mC modifieringar utan någon PCR-amplifieringsbias skapad efter omvandlingen. Således är MBD-seq en idealisk metod för att adressera cllDMG, vilket kan vara potentiella epigenetiska baserade CLL signaturgener med prognostiskt värde.
De avgörande faktorerna för att utföra denna metod är kvaliteten och sonikeringsområdet för det fragmenterade DNA som användes före bindningsreaktionen. Alla prover visade kortare fragmentintervall, mellan 150 och 300 bp ( Figur 4 ), vilket resulterade i resultat av god kvalitet, med ungefär 25-33 miljoner unika läser för varje provkartläggning till genomet efter datafiltrering och rengöring.
Slutligen har metyleringsstatusen för hyper- och hypometylerade cllDMGs validerats för få gener med användning av en pyrosequensionsmetod i en oberoende provkohort. Denna metod ger uppfattningenBeroende på förhållandet mellan C-till-T vid enskilda CpG-ställen baserat på mängden C och T inkorporerad under sekvensförlängningen. De hypermetylerade cllDMG: erna visade höga procentandelar metylering i CLL-prover jämfört med de normala proven. På samma sätt visade de hypometylerade cllDMGerna motsatsen. Pyrosequencing-data för två cllDMGs visas i figur 3 .
Jämfört med matrisbaserade metoder tillåter denna metod en bredare undersökning av sekvenser över genomet, innefattande tidigare annoterade regioner som spänner över proteinkodande regioner och icke-annoterade sekvenser som spänner över repetitiva element och lncRNA. Således identifierade detta tillvägagångssätt på CLL-patienter flera nya cllDMG som spände över lncRNA och repetitiva element. Eftersom dessa undersökningar inte har utförts tidigare i CLL-patientprover, tjänar denna studie som en värdefull resurs för identifiering av CLL-associerade differentialmetylerade regioner iOlika prognostiska undergrupper. Dessa cllDMG kommer att fungera som nya biomarkörer och mål för epigenetisk läkemedelsterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Studien stöddes av Vetenskapsrådet, Kräftsamhället, Knut- och Alice Wallenbergstiftelsen (KAW) och Västra Götalandsregionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer pH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5 mL | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5 mL tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
- Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
- Cahill, N., et al. 450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments. Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).
- Kanduri, M., et al. Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles. Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).
- Kulis, M., et al. Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).
- Booth, M. J., et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science. 336 (6083), 934-937 (2012).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
- Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL. Clin Epigenetics. 8, 106 (2016).
- Hallek, M., et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).
- De Meyer, T., et al. Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing. PLoS One. 8 (3), e59068 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Subhash, S., Kanduri, C. GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms. BMC Bioinformatics. 17 (1), 365 (2016).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Martinelli, S., et al. ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).
- Kopparapu, P. K., et al. Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression. Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).
- Robinson, M. D., et al. Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation. Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).
