Summary
Este trabajo describe un optimizado metil-CpG vinculante dominio de secuenciación de protocolo y una tubería computacional para identificar diferencial metilado CpG-ricos en regiones crónicas linfocítica leucemia (CLL) pacientes.
Abstract
El papel de los ARNs no codificantes largos (lncRNAs) en el cáncer está llegando a la vanguardia debido al interés creciente en la comprensión de sus funciones mecánicas durante el desarrollo y la progresión del cáncer. A pesar de ello, la regulación epigenética global de lncRNAs y secuencias repetitivas en el cáncer no ha sido bien investigado, en particular en la leucemia linfocítica crónica (CLL). Este estudio se centra en un enfoque único: la inmunoprecipitación de captura de doble hundidos, metilado ADN fragmentos utilizando metil-binding domain (MBD) proteínas, seguido por la próxima generación de secuenciación (MBD-seq). CLL muestras de pacientes pertenecientes a dos subgrupos de pronóstico (5 IGVH mutado muestras + 5 IGVH unmutated muestras) se utilizaron en este estudio. El análisis reveló 5.800 genes hipermetilados y 12.570 hipometilados CLL específicos diferencialmente metilados (cllDMGs) en comparación con los controles sanos normales. Es importante destacar que estos resultados identificaron varios LncRNA específicos CLL, diferencialmente metilados, reY los genes codificadores de proteínas con un posible valor pronóstico. Este trabajo esboza un protocolo detallado para un MBD seq y bioinformática pipeline desarrollado para el análisis exhaustivo de la metilación global perfiles en altamente CpG regiones ricas utilizando CLL muestras de pacientes. Por último, un gen de codificación de proteínas y un lncRNA fueron validados mediante pirosequencing, que es un método altamente cuantitativo para analizar los niveles de metilación CpG para corroborar aún más los hallazgos del protocolo MBD-seq.
Introduction
El uso de técnicas de secuenciación de próxima generación para analizar los perfiles globales de metilación del ADN ha sido cada vez más popular en los últimos años. Se desarrollaron ensayos de metilación en todo el genoma, incluyendo métodos basados en microarrays y no microarrays, basados en lo siguiente: la conversión de bisulfito de ADN genómico, digesiones de enzimas de restricción sensibles a la metilación y la inmunoprecipitación de ADN metilado usando anticuerpos específicos de metil CpG .
La metilación aberrante del ADN es una de las características de la leucemia y de los linfomas, incluida la leucemia linfocítica crónica (CLL). Anteriormente, varios grupos, incluidos los nuestros, caracterizaron los perfiles de metilación del ADN de diferentes subgrupos de pronóstico CLL y controles de células B normales y sanos utilizando la conversión de bisulfito de ADN genómico, seguido de métodos basados en micro-matriz o secuenciación de todo el genoma 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. La conversión de bisulfito de ADN genómico conduce a la desaminación de citosinas no modificadas a uracilo, dejando las citosinas metiladas modificadas en el genoma. Una vez convertido, el estado de metilación del ADN puede determinarse mediante amplificación y secuenciación por PCR utilizando diferentes métodos cuantitativos o cualitativos, tales como la secuenciación de bisulfito de todo el genoma o de micro-matriz o WGBS. Aunque los métodos basados en conversión de bisulfito tienen muchas ventajas y se usan ampliamente en diferentes tipos de cáncer para analizar los niveles de metilación del ADN, hay algunos inconvenientes asociados con esta técnica. La secuenciación WGBS permite una resolución de un par de bases con menores cantidades de ADN y es la mejor opción para analizar un gran número de muestras. Sin embargo, este método no logra diferenciar las modificaciones entre los niveles de 5 mC y 5 hmC en el genoma 5 , 6 . Además, los métodos basados en microarrays no ofrecen completas cExceso del genoma.
En un estudio reciente de nuestro laboratorio 7 , los métodos basados en la inmunoprecipitación, en lugar de la conversión de bisulfito, se utilizaron para identificar regiones altamente metiladas, ricas en CpG, a escala global en pacientes con CLL y controles sanos normales. Inmetil-CpG-dominio de unión (MBD) de próxima generación de secuenciación (MBD-seq), el enriquecimiento de doble hilado de ADN fragmentado depende del grado de metilación CpG. Este método puede superar los inconvenientes del método de conversión de bisulfito y también puede proporcionar cobertura genómica de la metilación de CpG de una manera imparcial y independiente de la PCR. Además, a diferencia de los métodos de microarrays basados en conversión de bisulfito, MBD-seq se puede utilizar para analizar el estado de metilación de elementos repetitivos, tales como elementos nucleares intercalados largos (LINEs), elementos nucleares intercalados cortos (SINEs), repeticiones terminales largas (LTRS) Etc. Sin embargo, en comparación con los métodos de conversión de bisulfito,Un protocolo MBD-seq requiere una cantidad relativamente grande de ADN de entrada. Además, la calidad de las lecturas de secuenciación y los datos dependen de la especificidad, afinidad y calidad de los anticuerpos utilizados.
El presente estudio explica un detallado MBD-seq protocolo para enriquecer el ADN metilado para la próxima generación de secuenciación. Utiliza un kit comercial de enriquecimiento de ADN metilado (listado en la Tabla de Materiales ), así como un oleoducto computacional para visualizar e interpretar los datos de secuenciación de metilación para identificar regiones hiper y hipometiladas específicas de CLL en comparación con los controles sanos normales. Básicamente, este método hace uso de la capacidad de la MBD de la interacción de la proteína MBD2 humana con CpGs metiladas para extraer el ADN enriquecido con CpGs metiladas, y esto es seguido por la secuenciación de alto rendimiento del ADN metilado.
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Protocol
La aprobación ética para la recolección de muestras CLL es del 2007-05-21, con el siguiente número de registro: EPN Gbg dnr 239/07. Todos los pacientes con CLL fueron diagnosticados de acuerdo con criterios recientemente revisados 8 , y las muestras fueron recolectadas en el momento del diagnóstico. Los pacientes en el estudio se incluyeron de diferentes departamentos de hematología en la parte occidental de Suecia, después de haber obtenido el consentimiento por escrito. Sólo se seleccionaron en este estudio muestras de células mononucleares de sangre periférica de CLL (PBMC) con un porcentaje tumoral de células leucémicas ≥ 70%.
1. Preparaciones
- Aísle las PBMCs para extracciones de ADN de CLL y muestras normales de sangre periférica sanas usando un kit de aislamiento comercial (consulte la Tabla de Materiales ), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Autoclave tubos de 1,5 ml. Descongelar todos los reactivos en el kit de unión al ADN metilado (véase la tabla de materiales ). <Li
- Utilice agua libre de DNasa para preparar 10 mL de tampón de lavado de 1x bead del tampón de lavado de reserva 5x proporcionado por el kit para lavar perlas y diluir la proteína MBD proporcionada por el kit.
- Obtener o preparar los siguientes elementos de antemano: acetato de sodio 3 M, etanol absoluto y etanol al 70% para la precipitación del ADN ( tabla de materiales ).
2. Extracción y Sonicación de ADN Genómico
- Utilizar un kit de extracción de ADN comercialmente disponible ( Tabla de Materiales ) para aislar ADN genómico de muestras de PBMC normales y de pacientes de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuantificar el ADN genómico utilizando un espectrofotómetro a 260 nm.
NOTA: La capacidad de la columna de extracción de ADN es de 5-6 millones de células, máximo; Por lo tanto, es importante utilizar más de una columna para muestras con más de 5 millones de células. Eluir el ADN dos veces en volúmenes iguales totalizando 100 μl de tampón Tris EDTA (TE) 10 mM. La proteína MBD-biotina utilizada en el metilMinero para la secuenciación MBD no se unirá a ADN de una sola hebra. Por lo tanto, es muy importante mantener el ADN eluido ya sea congelado o a 4ºC para preservar su naturaleza de doble hebra. - Diluir 5 μg de ADN genómico de cada muestra hasta un total de 200 μL usando tampón TE (pH 8), dando una concentración final de 25 ng / μl.
- Realizar la sonicación en tubos especialmente diseñados usando un sonicador ( Tabla de Materiales ) para un total de 30 ciclos (30 s en y 30 s apagado por ciclo, después de cada 5 ciclos, centrifugar brevemente los tubos para recoger las muestras a la parte inferior).
NOTA: Esto producirá ADN fragmentado que oscila entre 150 pb y 300 pb, lo cual es óptimo para este protocolo. - Compruebe el rango de sonicación de todas las muestras antes de continuar con el siguiente paso de MBD secuenciación mediante la ejecución de 1 μ l de las muestras de ADN fragmentado y una escala de ADN en un comercialmente disponible, pre-molde 2% de gel de agarosa utilizando ADN electroforesis equipo de imagen. VisualizarUtilizando un transiluminador UV estándar.
3. Preparación del cordón antes de la unión con la proteína MBD-biotina
- Resuspender las bolas de estreptavidina magnética del tubo de reserva proporcionado por el kit, pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión homogénea. No vórtice las perlas ni permita que se sequen.
- Coloque 50 μl de perlas (por cada 5 μg de muestra de ADN fragmentada) en tubos separados, limpios y marcados de 1,5 mL. Añadir 50 μl de tampón de lavado de perlas 1x para alcanzar el volumen final de 100 μl.
NOTA: Cuando se usan pequeñas bandas de reacción en cadena de polimerasa (PCR) de 0,5 ml para lavar perlas, se usan alrededor de 150-200 μl de tampón de lavado por tubo, como se menciona en el protocolo del kit. Sin embargo, en el caso de tubos de 1,5 ml, añada al menos 250 μL a 300 μl de tampón de lavado por tubo para el lavado con perlas. - Coloque los tubos sobre un soporte magnético durante un minuto para permitir que todas las bolas magnéticas se concentren en la pared interna del tuboFrente al imán. Retire el líquido, sin tocar las perlas, usando una pipeta de 200 μl.
- Retire los tubos del soporte magnético, agregue 250 μl de tampón de lavado de 1x bead y mezcle las perlas suavemente con una pipeta.
- Repita los pasos 3.3 y 3.4 al menos 4-5 veces para todas las muestras y finalmente resuspender en 250 μl de tampón de lavado de 1x bead. Mantenerlos en hielo.
4. Vinculación de la proteína MBD-biotina a los granos lavados
- Añadir 35 μL de la proteína MBD (7 μL para 1 μg de muestra de ADN) a tubos separados y llevar el volumen total hasta 250 μL utilizando un tampón de lavado de 1x bead.
- Añadir 250 μl de la proteína MBD diluida a 250 μL de perlas lavadas y dejarlas en rotación de extremo a extremo a temperatura ambiente durante 1 h.
- Después de mezclar las perlas y la proteína durante 1 h, lavar la proteína MBD biotina unida con perlas de estreptavidina magnética.
- Coloque los tubos en el soporte magnético durante 1 minuto yÉl líquido sin tocar las cuentas usando una pipeta. Añadir 250 μl de tampón de lavado de 1x perlas y colocar los tubos en un mezclador de rotación durante 5 min a temperatura ambiente.
- Repita el paso 4.3.1 dos veces más y finalmente resuspenda las perlas de MBD-biotina lavadas en 200 μl de tampón de lavado de perlas 1x, haciendo las perlas listas para la captura de ADN metilado.
NOTA: El lavado 2-3 veces de esta manera elimina todas las perlas de proteína de MBD no unidas de fondo y mejora la unión eficaz de las perlas acopladas a proteína MBD con ADN genómico fragmentado.
5. Encuadernación de perlas de MBD-biotina con ADN genómico fragmentado
- En un tubo limpio de 1,5 ml sin DNasa, añadir 100 μl de tampón de lavado de 5x cuentas y 180 μL del ADN genómico fragmentado (paso 2.3). Llevar el volumen final a 500 μL usando agua libre de DNasa.
- Añadir 380 μL de agua libre de DNasa a los 20 μL restantes del ADN genómico fragmentado y congelarlos. Utilice estas muestras como entrada DNA controla y precipita más tarde junto con las muestras de ADN metilado eluidas finales (véase el paso 7.1).
- Colocar los tubos que contienen MBD-biotina lavada perlas (paso 4.4) en un soporte magnético durante 1 min y retirar el líquido sin perturbar las perlas. Añadir 500 μl de ADN genómico fragmentado diluido en tampón de lavado de perlas.
- Sellar todos los tubos firmemente con película de parafina y dejarlos durante la noche a 4 ° C en un soporte de rotación de extremo a extremo a 8-10 rpm.
NOTA: El ADN y la reacción de unión a perlas de biotina pueden hacerse durante 1 hora a temperatura ambiente, pero dejarla a 4ºC durante la noche puede mejorar la recuperación del ADN metilado final.
6. Eliminación del ADN no unido y elución del ADN metilado de las perlas
- Después de la reacción de unión de ADN y MBD-perla, colocar los tubos en el estante magnético durante 1 minuto para concentrar todas las perlas en la pared interior del tubo.
- Retire el líquido sobrenadante con una pipeta sin tocarloLas perlas y guardar esta fracción de la muestra de ADN no unido en el hielo.
- Añadir 200 μl de tampón de lavado de 1x perlas a las perlas y colocar los tubos en el soporte giratorio durante 3 minutos a temperatura ambiente. Coloque los tubos en el soporte magnético y retire el líquido. Repita el lavado dos veces más para eliminar el ADN residual no unido.
- Después del lavado final, añadir 200 μl de tampón de elución con alto contenido de sal (NaCl 2000 mM), proporcionado en el kit para eluir el ADN.
- Colocar los tubos en el soporte giratorio durante 15 minutos a temperatura ambiente. Colóquelos en el soporte magnético durante 1 minuto y utilice una pipeta para transferir cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo limpio de 1,5 ml.
- Añadir 200 μl de tampón de elución con alto contenido de sal y repetir la elución haciendo girar los tubos a temperatura ambiente durante 15 minutos. Añadir el segundo eluido al mismo tubo que contiene los 200 μl del primer eluido.
NOTA: Los 400 μL finales de ADN eluído total están ahora listos para la precipitación con etanol para extraer la solución purificadaADN adecuado para la próxima generación de secuenciación.
7. Precipitación de etanol y el enriquecimiento de ADN metilado
- Añadir 1 μl de glucógeno (20 μg / μl, incluido en el kit); 40 μl de acetato sódico 3 M, pH 5,2; Y 800 μl de etanol absoluto helado a 400 μl de ADN eluido y también a 400 μl de muestras de ADN de entrada preparadas en el paso 5.2.
- Mezclar bien los tubos por vórtex e incubarlos a -80 ° C durante la noche.
- Centrifugar los tubos a 12.000 xg (velocidad máxima) y 4 ° C. Deseche el sobrenadante con cuidado, sin alterar el pellet, agregue 500 μl de etanol al 70%, y agite los tubos.
- Centrifugar nuevamente a velocidad máxima durante 15 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante cuidadosamente usando una pipeta. Centrifugar los tubos a velocidad máxima durante 1 min a temperatura ambiente y eliminar el etanol residual completamente usando una punta de pipeta.
- Secar al aire el pellet durante 5 min a temperatura ambienteRature Añadir 10 μL de agua exenta de DNasa a la pastilla de ADN. Proceder a la cuantificación del ADN metilado (etapa 7.6), la secuenciación de MBD (etapa 7.7) y el análisis (secciones 8 y 9).
- Cuantificar las muestras de ADN metilado recuperadas finales utilizando un kit de cuantificación fluorométrica comercialmente disponible (véase la Tabla de Materiales ), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Nota: Usando este protocolo, se recuperaron 30-50 ng de ADN final de cada muestra. Las muestras de ADN están listas para enviar en hielo seco para la construcción de la biblioteca posterior y la secuenciación MBD de alto rendimiento
- Realizar la construcción de la biblioteca de ADN y la secuenciación MBD de alto rendimiento utilizando una plataforma comercial ( Tabla de Materiales ), como se describe en la referencia 9 .
NOTA: Para el control de calidad inicial del ADN metilado final, realice preparaciones de la biblioteca usando secuenciación de 50 pares de pares de extremo para todas las muestras. Procesar los datos sin procesar para el control de calidad posterior a la secuenciación.S elaborado en el paso 8.1, y procesarlo posteriormente utilizando enfoques bioinformáticos y métodos estadísticos, como se describe a continuación (pasos 8.2-9.6).
8. Análisis de la bioinformática Método 1: Identificación de las regiones diferenciadamente metiladas asociadas a CLL (cllDMR)
- Limpie las lecturas obtenidas de 49 pb (formato FASTQ) para adaptadores utilizando herramientas de control de calidad disponibles, como Trimmomatic 10 o Cutadapt. Revise la calidad de las lecturas recortadas usando el kit de herramientas FastQC:
Java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP: adaptadores.fasta: 2: 30: 10 - Alinee los archivos FASTQ limpios con Bowtie de alineación del genoma de lectura corta con un genoma de referencia 11 . Especifique los parámetros como a continuación:
- Permitir hasta dos desajustes (parámetro Bowtie: -v 2).
- Limitar el informe a las seis mejores alineaciones por lectura (parámetro Bowtie: -m 6) para controlarPara leer varias cartas.
Bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq> SAMPLE.sam
NOTA: Convierta los archivos SAM generados para muestras individuales después de la alineación en BAM utilizando SAMtools.
Samtools vista -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam
- Utilizar el análisis basado en modelos de ChIP-Seq (MACS) pico de llamadas en muestras alineadas (BAM) para predecir enriquecido / metilado regiones de la CLL subgrupos [ 12] .
NOTA: Comparación I: Utilice la muestra de entrada como grupo de control y las muestras de pacientes normales y CLL como grupos de tratamiento. Este paso es recoger todos los picos negativos (picos enriquecidos en entrada / fondo). Comparación II: Utilice el grupo de muestra Normal como el grupo de control y el grupo de muestra de CLL como grupo de tratamiento. Los picos positivos obtenidos son regiones hipermetiladas de CLL, y los picos negativos son regiones hipometiladas de CLL sobre regiones normales o diferenciadamente metiladas (DMRs).
Macs14 -t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --formato BAM -g hs - Quitar los picos de fondo de la Comparación I de las regiones diferenciadamente metiladas (DMR) usando BEDtools 13 .
Bedtools subtract -a <CLL_enriched_regions> -b <Input_enriched_regions> - Predecir el porcentaje de elementos repetidos (SINE-Alu, LINE, etc. ) enriquecidos en DMRs.
- Utilice fastacmd para extraer la secuencia FASTA de DMRs por las coordenadas cromosómicas del genoma de referencia HG19.
Fastacmd -d HG19_genome.fa -s Cromosoma -L Inicio, Fin -l 50000> DMRs.fasta - Utilice la herramienta de línea de comandos de RepeatMasker para predecir el porcentaje de elementos de repetición presentes en la secuencia FASTA de DMR.
RepeatMasker -gc -gccalc -s -species human -html DMRs.fasta
- Utilice fastacmd para extraer la secuencia FASTA de DMRs por las coordenadas cromosómicas del genoma de referencia HG19.
- Anotar los DMR pronosticados usando Homer "annotatePeaks.pl" con el Ensembl disponible [PMC4919035] oR Gencode [PMID 22955987] transcripción anotación (codificación de proteínas y transcripciones no codificantes).
AnnotatePeaks.pl DMRs.bed <GENOME> -gtf <Ensembl o Gencode GTF>
NOTA: Esto proporciona información sobre la distribución de picos en diferentes regiones genicas ( es decir, promotor, exón, intrón, UTRs 3 'y UTR 5') y regiones intergénicas. Los transcritos o genes asociados con DMRs se llaman genes diferenciadamente metilados (DMGs). - Utilice la herramienta de enriquecimiento con la base de datos actualizada o funcional actual para encontrar las funciones enriquecidas por CLL DMGs (sólo los genes de codificación de proteínas) [ 14] .
NOTA: Gene Set Clustering basado en Anotaciones Funcionales (GeneSCF) 14 es una herramienta en tiempo real para el análisis de enriquecimiento funcional que utiliza KEGG actualizado y Gene Ontología como una base de datos de referencia.
9. Análisis de Bioinformática Método 2: Identificación de CLL asociada significativamente DiffRegiones altamente metiladas (cll sigDMR's)
- Siga los pasos 8.1-8.5 del método I (sección 8) y utilice el análisis de enriquecimiento diferencial basado en lectura-recuento utilizando las herramientas disponibles, como se explica en los pasos 9.2-9.6, para agregar un nivel más de estadísticas a la tubería de análisis.
- Cuantifique el número de lecturas asignadas a picos individuales o DMRs en muestras de pacientes normales y CLL usando "featureCounts" del paquete "Subread" 15 .
Subread / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam
NOTA: Se puede introducir un filtro de calidad de mapeo para evitar cuantificar lecturas de mala calidad ( por ejemplo, -Q 30). Para este paso, prepare archivos SAF para los DMR obtenidos. Para obtener más información sobre el formato de archivo SAF, utilice este enlace http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/. - Utilice una tabla RAW de lectura-conteo que contenga el número de lecturas para los picos individuales en Normal yD CLL grupo de muestra de pacientes en edgeR como la entrada 16 .
NOTA: Compare los grupos de muestra de pacientes normales versus CLL para encontrar sigDMRs. Para el análisis de enriquecimiento diferencial, siga la guía de edgeR para instrucciones detalladas paso a paso (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf). - Filtrar los sigDMRs utilizando la tasa de descubrimiento falso (FDR) y el cambio de log-fold predicho por edgeR 16 .
- Anote los pronosticados sigDMR usando Homer "annotatePeaks.pl" con la anotación de transcripción Ensembl o Gencode disponible (codificación de proteínas y transcripciones no codificantes).
AnnotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf <Ensembl o Gencode GTF> -CpG
NOTA: Esto proporciona información sobre la distribución de picos en diferentes regiones genicas ( es decir, promotor, exón, intrón, UTRs 3 'y UTR 5') y regiones intergénicas. Transcripciones o genes asociados con siLos gDMR se llaman sigDMGs. - Use una herramienta de enriquecimiento con la base de datos funcional actual o actualizada para encontrar funciones enriquecidas por CLL sigDMGs (sólo los genes codificadores de proteínas) [ 14] .
NOTA: GeneSCF, una de las herramientas en tiempo real para el análisis de enriquecimiento funcional, usa KEGG y Gene Ontology como bases de datos de referencia.
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Representative Results
MBD-seq se realizó recientemente en CLL pacientes y controles igualados, normales, sanos para identificar CLL específicos hipertensos y hypomethylated genes [ 7] . La tubería experimental y bioinformática utilizados para analizar los datos generados a partir de CLL y muestras sanas normales se muestran en la Figura 1A y 1B . Estos análisis identificaron varias regiones diferenciadamente metiladas CLL-específicas (cllDMRs), que fueron significativamente hiper / hipometilado de IGHV-mutado y IGHV-unmutated muestras en comparación con muestras de control, con un valor de p <0,00001. La Figura 2A muestra todos los cllDMRs obtenidos a partir de comparaciones de células B normales y normales de PMBC. Todos los cllDMRs se asignaron a diferentes clases de codificación de proteínas y genes no codificantes, como se muestra en la Figura 2B . Es importante destacar que, en este análisis, las comparaciones fueronMed independientemente entre las muestras de CLL pacientes, con dos controles normales diferentes, clasificados de células B y PMBCs. Curiosamente, el análisis dio lugar a una gran superposición de la CLL específicos específicos de los genes metilados diferencial (cllDMGs: 851 hypermethylated y 2.061 hypomethylated) cuando se compara con el control normal de células B y normal PBMC control muestras ( Figura 2C ], lo que sugiere que estos cllDMGs puede ser Posible CLL firma genes con funciones significativas en la patogénesis de la enfermedad. Para reforzar los datos analizados , se validaron varios sitios CpG situados en un gen codificante de proteína hipermetilado, SKOR1 , y un lncRNA no codificante hipometilado, AC012065.7 , usando un método de pirosequenciación, tal como se describe en publicaciones anteriores 7 , 17 , 18 ( Figura 3A Y B ). La Figura 4 muestra el ADN cortadoDespués del protocolo de sonicación. El ADN fragmentado oscila entre 150 y 300 pb, lo que lo hace ideal para fines de secuenciación.
Figura 1: Visión general del flujo de trabajo utilizado en este estudio. Esta figura, obtenida de nuestra reciente publicación 7 , muestra el diseño del análisis general utilizado para identificar las regiones diferenciadamente metiladas (DMR) en muestras de pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL). (A) Diseño experimental del enriquecimiento basado en MBD de ADN metilado. B ) El análisis bioinformático utilizado para identificar las regiones CLL-específicas diferenciadamente metiladas (cllDMRs). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: cllDMRs y cllDMGs hipermethylated y hipometilado de muestras de CLL pacientes comparado con normal, sano, clasificado B células 7 . (A) Todas las regiones diferenciadamente metiladas asociadas a leucemia linfocítica crónica (CLL) con valores p significativos (<0,00001) obtenidos comparando las muestras de CLL mutadas y no mutadas de IGHV con células B clasificadas normales (panel superior) y muestras normales de PBMC (Panel inferior). Los enriquecimientos mostrados en el mapa de calor estaban dentro de una ventana de ± 3 kb desde la región diferenciadamente metilada (DMRs). ( B ) Diagrama de Venn que muestra la superposición de genes metilados diferencialmente específicos de CLL (cllDMGs, hipermetilados e hipometilados) entre grupos mutados con IGHV y IGHV-no mutados. El gráfico circular representa el porcentaje de genes pertenecientes a diferentes clasificaciones, como la codificación de proteínas, ARN largo no codificante (lncRNA), pseudogenes, antisentido y otros ARN no codificantes. ( C ) Diagrama de Venn que muestra la superposición de genes comunes diferenciadamente metilados (IGHV-mutated y IGHV-unmutated prognostic groups) entre las células B y PBMC comparaciones. El panel izquierdo del diagrama de Venn muestra la superposición de los genes hipermetilados y el panel derecho para los genes hipometilados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Validación del estado de metilación de ADN para sitios individuales de CpG en los genes seleccionados selectivamente diferenciadamente metilo. Pyrosquencing datos para la cuantificación del porcentaje de metilación del ADN de dos genes seleccionados utilizando un linfocito crónico independiente(CLL) que contenía 54 muestras y 6 muestras de células B normales, sanas y de igual edad. ( A ) Los diagramas de caja representan el porcentaje de niveles de metilación para 3 sitios CpG individuales del gen SKOR1 hipermetilado usando pirosequenciación. ( B ) La gráfica de caja muestra el grado de metilación de 5 sitios CpG individuales del gen hipometilado AC012065.7 usando pirosequenciación. Las casillas indican el intervalo intercuartílico (25-75%), mientras que la línea horizontal interna indica el valor mediano. Los bigotes representan los valores mínimo y máximo. El valor p correspondiente al grado de metilación diferencial de las muestras de CLL sobre las células B normales se muestra en los diagramas de caja para cada sitio CpG individual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
MBD-seq es una técnica rentable basada en inmunoprecipitación que se puede utilizar para estudiar los patrones de metilación con una cobertura completa del genoma. Tanto MeDIP seq (inmunoprecipitación de ADN metilado seguido de secuenciación) como MBD-seq resultan en el enriquecimiento de ADN metilado rico en CpG. Sin embargo, MBD-seq muestra más afinidad hacia la unión a regiones altamente ricas en CpG cuando se compara con MeDIP seq 19 . Usando un kit de enriquecimiento de unión a metilo, se puede fraccionar el ADN en regiones ricas en CpG y CpG bajo eluyendo ADN con tampones de alto contenido en sal y bajo contenido de sal, respectivamente. En esta investigación, sólo se realizó una única elución de fracciones para capturar regiones ricas en CpG altamente enriquecidas que cubren la mayor parte de las islas CpG.
MBD-seq puede ser una poderosa alternativa a WGBS, que se utiliza comúnmente en la CLL y otras investigaciones de la leucemia. Aunque MBD-seq requiere una cantidad relativamente mayor de ADN de entrada en comparación con el bisulfitoBasados en la conversión, permite la investigación de los cambios de metilación global que son específicos sólo para modificaciones de 5 mC, sin ningún sesgo de amplificación de PCR creado después de la conversión. Por lo tanto, MBD-seq es un método ideal para abordar cllDMGs, que podría ser potencial epigenética basada CLL firma genes con valor pronóstico.
Los factores cruciales para llevar a cabo este método son la calidad y el intervalo de sonicación del ADN fragmentado utilizado antes de la reacción de unión. Todas las muestras mostraron rangos de fragmentos más cortos, entre 150 y 300 pb ( Figura 4 ), resultando en resultados de secuenciación de buena calidad, con alrededor de 25-33 millones de lecturas únicas para cada mapeo de muestra al genoma después del filtrado y limpieza de datos.
Finalmente, el estado de metilación de los cllDMGs hiper y hipometilados ha sido validado para pocos genes usando un método de pirosecuenciación en una cohorte de muestras independientes. Este métodoNtage de metilación del ADN, dependiendo de la relación de C a T en sitios CpG individuales basados en la cantidad de C y T incorporados durante la extensión de la secuencia. Los cllDMGs hipermetilados mostraron altos porcentajes de metilación en muestras de CLL en comparación con las muestras normales. Del mismo modo, los cllDMG hipometilados mostraron lo contrario. Pyrosequencing datos de dos cllDMGs se muestra en la Figura 3 .
En comparación con los métodos basados en matrices, este método permite el examen más amplio de las secuencias a través del genoma, incluyendo regiones previamente anotadas que abarcan regiones codificantes de proteínas y secuencias no anotadas que abarcan elementos repetitivos y lncRNAs. Por lo tanto, este enfoque en CLL pacientes identificados varios nuevos cllDMGs que abarcan lncRNAs y elementos repetitivos. Dado que estas investigaciones no se han llevado a cabo previamente en las muestras de pacientes CLL, este estudio sirve como un recurso valioso para la identificación CLL-asociada a las regiones diferenciadas methylated enDiferentes subgrupos pronósticos. Estos cllDMGs servirán como nuevos biomarcadores y objetivos para la terapia de fármacos epigenéticos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Consejo Sueco de Investigación, la Sociedad de Cáncer de Suecia, Knut y la Fundación Alice Wallenberg (KAW), y FoU VästraGötalandsregionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer pH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5 mL | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5 mL tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
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