Summary
Este trabalho descreve um protocolo optimizado de sequenciação de domínio de ligação de metil-CpG (MBD) e uma tubagem computacional para identificar regiões ricas em CpG diferencialmente metiladas em pacientes com leucemia linfocítica crônica (CLL).
Abstract
O papel de ARNs não codificados longos (lncRNAs) em câncer está chegando à vanguarda devido ao crescente interesse em entender suas funções mecanicistas durante o desenvolvimento e progressão do câncer. Apesar disso, a regulação epigenética global dos ARNnc e as seqüências repetitivas no câncer não foi bem investigada, particularmente na leucemia linfocítica crônica (CLL). Este estudo centra-se em uma abordagem única: a captação baseada em imunoprecipitação de fragmentos de DNA metilados de cadeia dupla usando proteínas de domínio de ligação a metilo (MBD), seguido de sequenciação de próxima geração (MBD-seq). As amostras de pacientes CLL pertencentes a dois subgrupos prognósticos (5 amostras mutadas de IGVH + 5 amostras não mutadas IGVH) foram utilizadas neste estudo. A análise revelou 5.800 hipermetilados e 12.570 genes metilados diferencialmente específicos de CLL específicos de CLL (cllDMGs) em comparação com controles saudáveis normais. Importante, esses resultados identificaram vários ARNnc específicos de CLL, diferencialmente metilados, reElementos petitivos e genes codificadores de proteínas com potencial valor prognóstico. Este trabalho descreve um protocolo detalhado para um pipeline MBD-seq e bioinformática desenvolvido para a análise abrangente de perfis globais de metilação em regiões altamente ricas em CpG usando amostras de pacientes CLL. Finalmente, um gene codificador de proteína e um ARNnc foram validados usando pirosequenciamento, que é um método altamente quantitativo para analisar os níveis de metilação CpG para corroborar ainda mais os achados do protocolo MBD-seq.
Introduction
O uso de técnicas de sequenciação da próxima geração para analisar os perfis globais de metilação do DNA tem sido cada vez mais popular nos últimos anos. Os ensaios de metilação em todo o genoma, incluindo métodos baseados em microarray e não microarray, foram desenvolvidos com base no seguinte: conversão de bisulfito de DNA genômico, digestão de enzimas de restrição sensíveis à metilação e imunoprecipitação de DNA metilado usando anticorpos específicos de CpG de metilo .
A metilação aberrante do DNA é uma das características da leucemia e linfomas, incluindo a leucemia linfocítica crónica (CLL). Anteriormente, vários grupos, incluindo o nosso, caracterizaram os perfis de metilação do DNA de diferentes subgrupos prognósticos de CLL e controles de células B normais e saudáveis usando a conversão de bisulfito de DNA genômico, seguidos de métodos baseados em micro-matriz ou seqüenciamento de todo o genoma 1 , 2 , 3 <Sup class = "xref"> 4. A conversão de bisulfito de DNA genômico leva à desaminação de citosinas não modificadas para uracilo, deixando as citosinas metiladas modificadas no genoma. Uma vez convertido, o estado de metilação do DNA pode ser determinado por amplificação e sequenciação de PCR usando diferentes métodos quantitativos ou qualitativos, como a seqüenciamento de bisulfito de microorganismos ou todo o genoma (WGBS). Embora os métodos baseados em conversão de bisulfito tenham muitas vantagens e sejam amplamente utilizados em diferentes tipos de câncer para analisar os níveis de metilação do DNA, existem algumas desvantagens associadas a esta técnica. O seqüenciamento do WGBS permite a resolução de pares de bases únicas com menores quantidades de DNA e é a melhor opção para analisar um grande número de amostras. No entanto, este método não diferencia as modificações entre os níveis de 5 mC e 5 hmC no genoma 5 , 6 . Além disso, os métodos baseados em microarray não oferecem completo cSuperação do genoma.
Em um estudo recente de nosso laboratório 7 , os métodos baseados em imunoprecipitação, em vez de conversão de bisulfito, foram utilizados para identificar regiões altamente diferenciadas e diferenciadas de CpG em escala global em pacientes com CLL e controles saudáveis normais. Secerto de próxima geração de domínio de ligação de inmetil-CpG (MBD) (MBD-seq), o enriquecimento de DNA fragmentado de cadeia dupla depende do grau de metilação de CpG. Este método pode superar as desvantagens do método de conversão de bisulfito e também pode proporcionar cobertura genômica de metilação de CpG de maneira independente e independente de PCR. Além disso, ao contrário dos métodos de microarray baseados em conversão de bisulfito, MBD-seq pode ser usado para analisar o estado de metilação de elementos repetitivos, como longos elementos nucleares intercalados (LINEs), elementos nucleares intercalados curtos (SINEs), repetições terminais longas (LTRS) Etc. No entanto, em comparação com os métodos de conversão de bisulfito,Um protocolo MBD-seq requer uma quantidade relativamente grande de DNA de entrada. Além disso, a qualidade das leituras de seqüências e os dados dependem da especificidade, afinidade e qualidade dos anticorpos utilizados.
O presente estudo explica um protocolo MBD-seq detalhado para enriquecer DNA metilado para sequenciação da próxima geração. Ele usa um kit comercial de enriquecimento de ligação de DNA metilado (listado na Tabela de Materiais ), bem como uma tubulação computacional para visualizar e interpretar dados de seqüenciamento de metilação para identificar regiões hiper e hipometiladas específicas de CLL em comparação com controles saudáveis normais. Basicamente, este método faz uso da capacidade do MBD da interação da proteína MBD2 humana com CpGs metilados para extrair DNA enriquecido com CpGs metilados, e isso é seguido pelo seqüenciamento de alto rendimento do DNA metilado.
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Protocol
A aprovação ética para coletar as amostras CLL é de 2007-05-21, com o seguinte número de registro: EPN Gbg dnr 239/07. Todos os pacientes com CLL foram diagnosticados de acordo com os critérios recentemente revisados 8 , e as amostras foram coletadas no momento do diagnóstico. Os pacientes do estudo foram incluídos em diferentes departamentos de hematologia na parte ocidental da Suécia, após o consentimento por escrito ter sido obtido. Somente amostras de células mononucleares de sangue periférico de CLL (PBMC) com uma porcentagem de tumor de células leucêmicas ≥ 70% foram selecionadas neste estudo.
1. Preparações
- Isolar PBMCs para extrações de DNA de CLL e amostras de sangue periférico saudáveis normais usando um kit de isolamento comercial (veja a Tabela de Materiais ), de acordo com as instruções do fabricante.
- Autoclave tubos de 1,5 mL. Decongela todos os reagentes no kit de ligação de DNA metilado (veja a Tabela de Materiais ). </ Li>
- Use água livre de DNase para preparar 10 mL de tampão de lavagem de pérola 1x a partir do buffer de lavagem 5x fornecido pelo kit para lavar esferas e diluir a proteína MBD fornecida pelo kit.
- Obtenha ou prepare os seguintes itens com antecedência: acetato de sódio 3 M, etanol absoluto e etanol a 70% para precipitação de DNA ( Tabela de Materiais ).
2. Extração de DNA genômico e sonicação
- Use um kit de extração de DNA comercialmente disponível ( Tabela de Materiais ) para isolar DNA genômico de amostras de PBMC pacientes e normais de acordo com o protocolo do fabricante. Quantificar o DNA genômico usando um espectrofotômetro a 260 nm.
NOTA: A capacidade da coluna de extração de DNA é 5-6 milhões de células, máximo; Portanto, é importante usar mais de uma coluna para amostras com mais de 5 milhões de células. Eluir o ADN duas vezes em volumes iguais totalizando 100 μL de tampão Tris EDTA (TE) 10 mM. A proteína MBD-biotina utilizada no metiloKit de mineração para sequenciação de MBD não se liga ao DNA de cadeia simples. Assim, é muito importante manter o DNA eluído congelado ou a 4 ° C para preservar a sua natureza de cadeia dupla. - Diluir 5 μg de DNA genômico de cada amostra para um total de 200 μL usando tampão TE (pH 8), dando uma concentração final de 25 ng / μL.
- Execute sonicação em tubos especialmente projetados usando um sonicator ( Tabela de Materiais ) por um total de 30 ciclos (30 segundos e 30 segundos por ciclo, depois de cada 5 ciclos, gire rapidamente os tubos para coletar as amostras para a parte inferior).
NOTA: Isso produzirá DNA fragmentado variando entre 150 pb e 300 pb, o que é ótimo para este protocolo. - Verifique o intervalo de sonicação para todas as amostras antes de prosseguir para a próxima etapa de sequenciação de MBD executando 1 μL das amostras de DNA fragmentadas e uma escada de tamanho de DNA em um gel de agarose 2% pré-moldado comercialmente disponível usando equipamento de imagem de eletroforese de DNA. Visualize tEle usou um transiluminador UV padrão.
3. Preparação de grânulos antes da ligação com proteína MBD-biotina
- Ressuspenda os grânulos de estreptavidina magnética do tubo de estoque fornecido pelo kit, fazendo pipetas suavemente para cima e para baixo para obter uma suspensão homogênea. Não vorteie as contas ou deixe secar.
- Coloque 50 μL de pérolas (para cada 5 μg de amostra de DNA fragmentada) em tubos de 1,5 mL separados, limpos e rotulados. Adicione 50 μL de 1x tampão de lavagem de contas para atingir o volume final de 100 μL.
NOTA: Ao usar pequenas marcas de reação em cadeia de polimerase de 0,5 mL (PCR) para a lavagem de esferas, é usado cerca de 150-200 μL de tampão de lavagem por tubo, conforme mencionado no protocolo do kit. No entanto, no caso de tubos de 1,5 mL, adicione pelo menos 250 μL a 300 μL de tampão de lavagem por tubo para a lavagem de contas. - Coloque os tubos em um suporte magnético por um minuto para permitir que todas as pérolas magnéticas se concentrem na parede interna do tuboDe frente para o ímã. Remova o líquido, sem tocar as contas, usando uma pipeta de 200 μL.
- Remova os tubos do suporte magnético, adicione 250 μL de tampão de lavagem de bead 1x e misture as contas suavemente com uma pipeta.
- Repita as etapas 3.3 e 3.4 pelo menos 4-5 vezes para todas as amostras e finalmente ressuspenda em 250 μL de 1x tampão de lavagem de contas. Mantenha-os no gelo.
4. Vinculando a proteína MBD-biotina às contas lavadas
- Adicione 35 μL de proteína MBD (7 μL para 1 μg de amostra de DNA) para separar os tubos e levar o volume total até 250 μL usando 1x tampão de lavagem de contas.
- Adicione 250 μL de proteína MBD diluída aos 250 μL de pérolas lavadas e deixe-as na rotação de ponta a ponta à temperatura ambiente durante 1 h.
- Depois de misturar as contas e as proteínas durante 1 h, lave a biotina de proteína MBD ligada com esferas magnéticas de estreptavidina.
- Coloque os tubos no suporte magnético por 1 min e remova tEle liquido sem tocar as contas usando uma pipeta. Adicione 250 μL de 1x tampão de lavagem de talão e coloque os tubos em um misturador de rotação durante 5 minutos à temperatura ambiente.
- Repita a etapa 4.3.1 mais duas vezes e, finalmente, ressuspenda as pérolas MBD-biotina lavadas em 200 μL de 1x tampão de lavagem de contas, tornando as contas prontas para a captura de DNA metilado.
NOTA: Lavar 2-3 vezes desta maneira remove todas as contas de proteína MBD não ligadas ao fundo e melhora a ligação eficiente de pérolas de proteína MBD acopladas com DNA genômico fragmentado.
5. Binding MBD-biotin Beads with Fragmented Genomic DNA
- Em um tubo limpo de 1,5 mL sem DNase, adicione 100 μL de tampão de lavagem 5x e 180 μL do DNA genômico fragmentado (passo 2.3). Traga o volume final para 500 μL usando água livre de DNase.
- Adicione 380 μL de água livre de DNase aos 20 μL restantes do DNA genômico fragmentado e congelá-los. Use essas amostras como DN de entradaA controla e precipita-os mais tarde, juntamente com as amostras de DNA metiladas eluídas finais (ver passo 7.1).
- Coloque os tubos contendo pérolas MBD-biotina lavadas (passo 4.4) em um suporte magnético por 1 min e retire o líquido sem perturbar as esferas. Adicionar 500 μL de DNA genômico fragmentado diluído no tampão de lavagem de grânulos.
- Selar todos os tubos firmemente com filme de parafina e deixá-los durante a noite a 4 ° C em um suporte de rotação de ponta a ponta a 8-10 rpm.
NOTA: A reacção de ligação ao ADN e à biotina-pérola pode ser feita durante 1 h à temperatura ambiente, mas deixar a 4 ° C durante a noite pode melhorar a recuperação do ADN metilado final.
6. Removendo o ADN não ligado e Elutando o DNA Metilado das Beads
- Após a reacção de ligação ADN e MBD-bead, coloque os tubos no suporte magnético durante 1 minuto para concentrar todas as contas na parede interior do tubo.
- Remova o líquido sobrenadante com uma pipeta sem tocarAs contas e salve esta fração de amostra de DNA não ligada no gelo.
- Adicione 200 μL de 1x tampão de lavagem de talão às pérolas e coloque os tubos no suporte giratório durante 3 min à temperatura ambiente. Coloque os tubos no suporte magnético e remova o líquido. Repita a lavagem outra duas vezes para remover o DNA residual não ligado.
- Após a lavagem final, adicione 200 μL de tampão de eluição com alto teor de sal (NaCl 2,000 mM), fornecido no kit para eluir o DNA.
- Coloque os tubos no suporte giratório durante 15 minutos à temperatura ambiente. Coloque-os no suporte magnético por 1 min e use uma pipeta para transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo novo e limpo de 1,5 mL.
- Adicionar 200 μL de tampão de eluição com alto teor de sal e repetir a eluição por rotação dos tubos à temperatura ambiente durante 15 min. Adicione o segundo eluído ao mesmo tubo contendo os 200 μL do primeiro eluído.
NOTA: Os 400 μL finais de DNA eluído total estão agora prontos para a precipitação de etanol para extrair o purificadoDNA adequado para sequenciação da próxima geração.
7. Precipitação de etanol e o enriquecimento de DNA metilado
- Adicionar 1 μL de glicogênio (20 μg / μL, incluído no kit); 40 μL de acetato de sódio 3 M, pH 5,2; E 800 μL de etanol absoluto gelado para 400 μL de ADN eluído e também para os 400 μL de amostras de DNA de entrada preparadas no passo 5.2.
- Misture bem os tubos por vortex e incuba-os a -80 ° C durante a noite.
- Centrifugue os tubos a 12.000 xg (velocidade máxima) e 4 ° C. Descarte o sobrenadante com cuidado, sem perturbar o sedimento, adicione 500 μL de etanol a 70% e vorteie os tubos.
- Centrifugue novamente à velocidade máxima durante 15 min a 4 ° C e remova o sobrenadante usando cuidadosamente uma pipeta. Recupere os tubos na velocidade máxima durante 1 min à temperatura ambiente e remova completamente o etanol residual usando uma ponta de pipeta.
- Secar ao ar a pastilha por 5 min no quarto tempeRature. Adicione 10 μL de água isenta de DNase ao grânulo de DNA. Proceda à quantificação de DNA metilado (passo 7.6), sequenciação de MBD (passo 7.7) e análise (seções 8 e 9).
- Quantifique as amostras de DNA metiladas recuperadas final usando um kit de quantificação fluorométrica comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais ), de acordo com as instruções do fabricante.
- Nota: Utilizando este protocolo, recuperaram-se 30-50 ng de DNA final de cada amostra. Amostras de DNA estão prontas para enviar em gelo seco para construção de biblioteca a jusante e sequenciação MBD de alto rendimento
- Execute a construção da biblioteca de DNA e a seqüenciamento MBD de alto rendimento usando uma plataforma comercial ( Tabela de Materiais ), conforme descrito na referência 9 .
NOTA: Para o controle de qualidade inicial do DNA metilado final, execute preparações de biblioteca usando sequenciação de pares de pares de 50 pb para todas as amostras. Processar os dados brutos para controle de qualidade pós-sequenciação, umS elaborado no passo 8.1 e processá-lo posteriormente usando abordagens de bioinformática e métodos estatísticos, conforme descrito abaixo (etapas 8.2-9.6).
8. Método de análise de bioinformática 1: identificação de regiões diferencialmente metiladas associadas a CLL (cllDMRs)
- Limpe as leituras obtidas de 49 pb (formato FASTQ) para adaptadores usando ferramentas de controle de qualidade disponíveis, como Trimmomatic 10 ou Cutadapt. Crosscheck a qualidade das leituras ajustadas usando o FastQC toolkit:
Java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP: adaptadores.fasta: 2: 30: 10 - Alinhe os arquivos FASTQ limpos com alinhador de genoma de leitura curta Bowtie contra um genoma de referência 11 . Especifique os parâmetros abaixo:
- Permitir até dois desajustes (parâmetro Bowtie: -v 2).
- Limite o relatório aos seis melhores alinhamentos por leitura (parâmetro Bowtie: -m 6) para controlarPara leituras multi-mapeamento.
Bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq> SAMPLE.sam
NOTA: Converta os arquivos SAM gerados para amostras individuais após o alinhamento em BAM usando SAMtools.
Visão de samtools -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam
- Use a análise baseada em modelo do identificador de pico CHIP-Seq (MACS) em amostras alinhadas (BAM) para prever regiões enriquecidas / metiladas dos subgrupos CLL 12 .
NOTA: Comparação I: use a amostra de entrada como o grupo controle e as amostras do paciente normal e CLL como grupos de tratamento. Este passo é coletar todos os picos negativos (picos enriquecidos em Entrada / fundo). Comparação II: Use o grupo de amostra Normal como o grupo controle e o grupo de amostra do paciente CLL como grupo de tratamento. Os picos positivos obtidos são regiões hiper-metiladas de CLL e os picos negativos são regiões hipometiladas de CLL em regiões normais ou diferencialmente metiladas (DMRs).
Macs14 -t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --format BAM -g hs - Remova os picos de fundo da Comparação I de regiões diferencialmente metiladas (DMRs) usando BEDtools 13 .
Bedtools subtrair -a <CLL_enriched_regions> -b <Input_enriched_regions> - Prever a porcentagem de elementos repetidos (SINE-Alu, LINE, etc. ) enriquecidos em DMRs.
- Use fastacmd para extrair a sequência FASTA de DMRs pelas coordenadas cromossômicas do genoma de referência HG19.
Fastacmd -d HG19_genome.fa -s Chromosome -L Start, End -l 50000> DMRs.fasta - Use a ferramenta de linha de comando RepeatMasker para prever a porcentagem de elementos de repetição presentes na seqüência FASTA de DMRs.
RepeatMasker -gc -gccalc -s -species human -html DMRs.fasta
- Use fastacmd para extrair a sequência FASTA de DMRs pelas coordenadas cromossômicas do genoma de referência HG19.
- Anote os DMRs previstos usando Homer "annotatePeaks.pl" com o Ensembl disponível [PMC4919035] oR Gencode [PMID 22955987] anotação de transcrição (transcrição de codificação de proteína e não codificação).
AnnotatePeaks.pl DMRs.bed <GENOME> -gtf <Ensembl ou Gencode GTF>
NOTA: Isso fornece informações sobre a distribuição de picos em diferentes regiões genic ( ie, promotor, exão, intrão, 3 'UTRs e 5' UTRs) e regiões intergênicas. Transcritos ou genes associados a DMRs são chamados de genes metilados diferencialmente (DMGs). - Use a ferramenta de enriquecimento com o banco de dados funcional atualizado ou atual para encontrar funções enriquecidas pelos DMG CLL (somente genes codificadores de proteínas) 14 .
NOTA: O agrupamento de conjuntos de genes com base na anotação funcional (GeneSCF) 14 é uma ferramenta baseada em tempo real para análise de enriquecimento funcional que usa KEGG atualizado e Ontologia de genes como banco de dados de referência.
9. Método de Análise de Bioinformática 2: Identificando significativamente o DCL associado a CLLRegionalmente regiões metiladas (sigDMR cll)
- Siga as etapas 8.1-8.5 a partir do método I (seção 8) e use a análise de enriquecimento diferencial baseada em leitura, utilizando as ferramentas disponíveis, conforme elaborado nas etapas 9.2 a 9.6, para adicionar mais um nível de estatísticas ao pipeline de análise.
- Quantifique o número de leituras mapeadas para picos individuais ou DMRs em amostras de pacientes normais e CLL usando "featureCounts" no pacote "Subread" 15 .
Subread / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam
NOTA: Um filtro de qualidade de mapeamento pode ser introduzido para evitar a quantificação de leituras de qualidade ruim ( por exemplo, -Q 30). Para esta etapa, prepare arquivos SAF para os DMRs obtidos. Para obter mais informações sobre o formato de arquivo SAF, use este link http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/. - Use uma tabela de leitura de leitura RAW contendo o número de leituras para os picos individuais em Normal eD CLL grupos de amostra do paciente em edgeR como a entrada 16 .
NOTA: Compare os grupos de amostras de pacientes normais versus CLL para encontrar sigDMRs. Para análises de enriquecimento diferencial, siga o guia da edgeR para instruções detalhadas passo a passo (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf). - Filtre os sigDMRs usando a taxa de descoberta falsa (FDR) e a mudança de dobra de registro prevista pelo edgeR 16 .
- Anotar os sigDMRs previstos usando Homer "annotatePeaks.pl" com a anotação de transcrição Ensembl ou Gencode disponível (transcrição de codificação de proteína e não codificação).
AnnotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf <Ensembl ou Gencode GTF> -CpG
NOTA: Isso fornece informações sobre a distribuição de picos em diferentes regiões genic ( ie, promotor, exão, intrão, 3 'UTRs e 5' UTRs) e regiões intergênicas. Transcrições ou genes associados a siOs gDMRs são chamados de sigDMGs. - Use uma ferramenta de enriquecimento com o banco de dados funcional atualizado ou atual para encontrar funções enriquecidas por sigDMG CLL (somente genes codificadores de proteínas) 14 .
NOTA: GeneSCF, uma das ferramentas em tempo real para análise de enriquecimento funcional, usa KEGG e Ontologia de genes como bancos de dados de referência.
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Representative Results
O MBD-seq foi recentemente realizado em pacientes com CLL e controles compatíveis, normais e saudáveis para identificar genes especificamente hiper e hipometilados CLL específicos 7 . O pipeline experimental e bioinformático utilizado para analisar os dados gerados a partir de CLL e amostras saudáveis normais são mostrados na Figura 1A e 1B . Essas análises identificaram várias regiões diferencialmente metiladas específicas de CLL (cllDMRs), que foram significativamente hiper / hipometiladas a partir de amostras mutadas IGHV e IGHV não mutadas em comparação com amostras de controle, com um valor p <0,00001. A Figura 2A mostra todos os cllDMRs obtidos a partir de comparações normais de células B e PMBC normais. Todos os cllDMRs foram mapeados para diferentes classes de genes de codificação de proteínas e não codificados, como mostrado na Figura 2B . Importante, nesta análise, as comparações foram desempenhoMed independentemente entre as amostras do paciente com CLL, com dois controles normais diferentes, células B selecionadas e PMBCs. Curiosamente, a análise resultou em uma grande sobreposição de genes diferenciados diferencialmente específicos de CLL específicos (cllDMGs, 851 hipermetilados e 2.061 hipometilados) quando comparados ao controle normal de células B e amostras normais de controle de PBMC ( Figura 2C ), sugerindo que esses cllDMGs podem ser Possíveis genes de assinatura CLL com papéis significativos na patogênese da doença. Para fortalecer os dados analisados, vários sites de CpG localizados em um gene de codificação de proteína hipermetilada, SKOR1 e um lncRNA não codificado longo, não codificado , AC012065.7 , foram validados usando um método de pirosequenciamento, conforme descrito nas publicações anteriores 7 , 17 , 18 ( Figura 3A E B ). A Figura 4 mostra DNA cortadoApós o protocolo de sonicação. O DNA fragmentado varia entre 150 e 300 pb, tornando-o ideal para fins de seqüenciamento.
Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho usado neste estudo. Este número, obtido em nossa publicação recente 7 , mostra o projeto da análise geral utilizada para identificar as regiões diferencialmente metiladas (DMRs) nas amostras de pacientes com leucemia linfocítica crônica (CLL). (A) Desenho experimental do enriquecimento baseado em MBD de DNA metilado. ( B ) O pipeline de análise de bioinformática usado para identificar regiões metiladas diferencialmente específicas de CLL (cllDMRs). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: CllDMRs e cllDMGs hipermetilados e hipometilados de amostras de pacientes CLL em comparação com células B normais, saudáveis 7 . (A) Todas as regiões metiladas diferencialmente associadas com leucemia linfocítica crônica (CLL) com valores significativos de p (<0.00001) obtidos através da comparação das amostras de CLL mutadas com IGHV e não mutadas com células B ordenadas normais (painel superior) e amostras de PBMC normais (Painel inferior). Os enriquecimentos mostrados no mapa de calor estavam dentro de uma janela de ± 3 kb de região metilada diferencial (DMRs). ( B ) Diagrama de Venn que mostra a sobreposição de genes metilados diferencialmente específicos de CLL (cllDMGs, hipermetilados e hipometilados) entre grupos mutados IGHV e IGHV-não mutados. O gráfico de torta representa a porcentagem de genes pertencentes a diferentes classificações, como a codificação de proteínas, ARN não codificado longo (ARNnc), pseudogenes, antisentido e outros ARNs não codificados. ( C ) Diagrama de Venn que mostra a sobreposição de genes metilados diferencialmente comuns (grupos prognósticos não mutados IGHV-mutados e IGHV) entre comparações de células B e PBMC. O painel esquerdo do diagrama de Venn mostra a sobreposição para genes hipermetilados e o painel direito para genes hipometilados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Validação do estado de metilação de DNA para sites CpG individuais nos genes alvo preferencialmente diferencialmente metilados. Dados de pirrosquência para a quantificação da porcentagem de metilação do DNA para dois genes selecionados usando um linfócito crônico independenteCoorte de amostra de leucemia de IC (CLL) contendo 54 amostras e 6 amostras de células B normais, saudáveis e com idade. ( A ) Os blocos de caixa representam a porcentagem de níveis de metilação para 3 locais CpG individuais do gene SKOR1 hipermetilado usando pirosequenciamento. ( B ) O boxplot mostra o grau de metilação para 5 locais CpG individuais do gene AC012065.7 hipometilado usando pirosequenciamento. As caixas indicam a faixa intercuartil (25-75%), enquanto a linha horizontal interna indica o valor médio. Os bigodes representam os valores mínimo e máximo. O p-valor correspondente ao grau de metilação diferencial das amostras de CLL em células B normais é mostrado nos pontos de caixa para cada site CpG individual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O MBD-seq é uma técnica baseada em imunoprecipitação baseada em custos, que pode ser usada para estudar padrões de metilação com cobertura completa do genoma. Ambos MeDIP seq (imunoprecipitação de DNA metilado seguido de seqüenciamento) e MBD-seq resultam no enriquecimento de DNA metilado rico em CpG. No entanto, MBD-seq mostra mais afinidade para a ligação a regiões altamente ricas em CpG quando comparadas com MeDIP seq 19 . Usando um kit de enriquecimento de ligação de metilo, pode-se fragmentar o DNA em regiões ricas em CpG e com baixo teor de CpG, eliminando DNA com tampões de alto sal e baixo teor de sal, respectivamente. Nesta investigação, apenas uma eluição de uma única fração foi realizada para capturar regiões ricas em CpG altamente enriquecidas que abrangem a maioria das ilhas CpG.
MBD-seq pode ser uma alternativa poderosa ao WGBS, que é comumente usado em CLL e outras investigações sobre leucemia. Mesmo que MBD-seq requer uma quantidade relativamente maior de DNA de entrada em comparação com o bisulfitoMétodos baseados em conversão, permite a investigação de alterações de metilação globais que são específicas apenas para modificações de 5 mC, sem qualquer viés de amplificação por PCR criado após a conversão. Assim, MBD-seq é um método ideal para abordar cllDMGs, que poderiam ser genes de assinatura de CLL com base em epigenética com valor prognóstico.
Os fatores cruciais para a realização deste método são a qualidade e o intervalo de sonicação do DNA fragmentado usado antes da reação de ligação. Todas as amostras apresentaram faixas de fragmentos mais curtas, entre 150 e 300 pb ( Figura 4 ), resultando em resultados de seqüência de boa qualidade, com cerca de 25 a 33 milhões de leituras únicas para cada mapeamento de amostra para o genoma após filtragem e limpeza de dados.
Finalmente, o estado de metilação de cllDMGs hiper e hipometilados foi validado para alguns genes usando um método de pirosequenciamento em uma coorte de amostra independente. Este método dá o perceFalta de metilação do DNA, dependendo da proporção de C-para-T em locais CpG individuais com base na quantidade de C e T incorporada durante a extensão da seqüência. Os cllDMGs hipermetilados apresentaram altas porcentagens de metilação em amostras de CLL em comparação com as amostras normais. Da mesma forma, os cllDMGs hipometilados mostraram o contrário. Os dados de Pyrosequencing para dois cllDMGs são mostrados na Figura 3 .
Comparado com métodos baseados em matriz, este método permite o exame mais amplo de seqüências em todo o genoma, incluindo regiões previamente anotadas que abrangem regiões codificadoras de proteínas e seqüências não anotadas que abrangem elementos repetitivos e ARNnc. Assim, esta abordagem em pacientes com CLL identificou vários novos cllDMGs abrangendo ARNnc e elementos repetitivos. Uma vez que essas investigações não foram realizadas anteriormente em amostras de pacientes CLL, este estudo serve como um recurso valioso para identificar regiões metiladas diferenciadas associadas a CLL emDiferentes subgrupos prognósticos. Esses cllDMGs servirão como novos biomarcadores e alvos para a terapia de drogas epigenéticas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa Sueco, a Sociedade Sueca do Câncer, a Fundação Knut e Alice Wallenberg (KAW) e FoU VästraGötalandsregionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer pH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5 mL | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5 mL tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
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