Summary
Bu çalışma, kronik lenfositik lösemi (KL) hastalarında farklı şekilde metilasyona uğramış CpG bakımından zengin bölgelerin tanımlanması için optimize edilmiş bir metil-CpG-bağlanma alanı (MBD) sıralama protokolünü ve bir hesaplama hattını açıklamaktadır.
Abstract
Kansere karşı uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNA'lar) rolü, kanser gelişiminde ve ilerlemesinde mekanik işlevlerinin anlaşılmasına olan artan ilgiden ötürü ön plana çıkmaktadır. Buna rağmen, lncRNA'ların global epigenetik düzenlenmesi ve kanserdeki tekrarlayıcı sekanslar, özellikle kronik lenfositik lösemi (CLL) 'de iyi araştırılmamıştır. Bu çalışma, benzersiz bir yaklaşım üzerinde yoğunlaşmaktadır: metil bağlanma alanı (MBD) proteinleri kullanılarak çift sarmallı, metillenmiş DNA fragmanlarının immüno çökeltme bazlı yakalanması, bunu takiben yeni nesil sıralama (MBD-seq). Bu çalışmada iki prognostik alt gruba (5 IGVH mutasyonlu numuneye + 5 IGVH mutasyona uğramamış örnek) ait CLL hasta örnekleri kullanılmıştır. Analiz, normal sağlıklı kontrollerle karşılaştırıldığında 5,800 hipermetilatlı ve 12,570 hipometillenmiş CLL-spesifik diferansiyel metillenmiş geni (cllDMGs) ortaya çıkarmıştır. Daha da önemlisi, bu sonuçlar farklı CLL'ye spesifik, farklı şekilde metillenmiş lncRNA'ları tanımladı.Petitive elementleri ve potansiyel prognostik değeri olan protein kodlayan genleri içerir. Bu çalışma, CLL hasta numunelerini kullanarak CpG bakımından zengin bölgelerde küresel metilasyon profillerinin kapsamlı analizi için geliştirilen bir MBD-seq ve biyoinformatik boru hattı için ayrıntılı bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Son olarak, bir protein kodlayıcı gen ve bir lncRNA, MBD-seq protokolünden elde edilen bulguları daha da desteklemek için CpG metilasyon seviyelerini analiz etmek için oldukça nicel bir yöntem olan pirozleme kullanılarak doğrulandı.
Introduction
Küresel DNA metilasyon profillerini analiz etmek için yeni nesil sıralama tekniklerinin kullanılması son yıllarda giderek daha fazla popüler olmuştur. Genetik DNA'nın bisülfit dönüşümü, metilasyona duyarlı kısıtlama enzimi sindirimleri ve metil CpG'ye spesifik antikorlar kullanılarak metilatlanmış DNA'nın immüno-çökeltilmesi, mikroarray ve mikroarray esaslı olmayan yöntemler de dahil olmak üzere genom çapında metilasyon tahlilleri geliştirildi .
Vahşi DNA metilasyonu, lösemi ve lenfomaların, kronik lenfositik lösemi (CLL) de dahil olmak üzere en belirgin özelliklerinden biridir. Daha önceleri, bizimkileri de içeren birkaç grup, farklı CLL prognostik alt gruplarının DNA metilasyon profillerini ve genomik DNA'nın bisülfit dönüşümünü kullanan normal, sağlıklı B-hücresi kontrollerini, bunu takiben mikro dizi tabanlı metotlar veya tüm genom dizilişi 1 , 2 , 3 ile karakterize edildi. , <Sup class = "xref"> 4. Genomik DNA'nın bisülfit dönüşümü, değiştirilmemiş sitozinlerin urasile deamine edilmesine ve değiştirilmiş metillenmiş sitozinlerin genomda kalmasına neden olur. Dönüştürüldükten sonra, DNA'nın metilasyon durumu, PCR amplifikasyonu ve mikro dizi tabanlı veya bütün genom bisülfit sıralama (WGBS) gibi farklı nicel veya nitel yöntemler kullanılarak sıralama ile belirlenebilir. Bisülfit dönüşüm esaslı yöntemlerin birçok avantajı olmasına ve DNA metilasyon düzeylerini analiz etmek için farklı kanser türlerinde yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bu teknikle ilgili birkaç sakınca vardır. WGBS sıralama, daha düşük DNA miktarlarıyla tekli baz çiftli çözünürlüğe izin verir ve çok sayıda numuneyi analiz etmek için en uygun seçenektir. Bununla birlikte, bu yöntem genomda 5 mC ve 5 hmC seviyeleri arasındaki modifikasyonları ayırt etmeyi başaramamaktadır 5 , 6 . Ek olarak, mikro-dizi tabanlı yöntemler tam cGenomun fazlalığı.
Laboratuvarımızda yapılan yeni bir çalışmada, KLL'li hastalarda ve normal sağlıklı kontrollerde yüksek oranda CpG açısından zengin, diferansiyel olarak metillenmiş bölgelerin global ölçekte tanımlanması için bisülfit dönüşümünden ziyade immüno-çökeltiye dayalı yöntemler kullanılmıştır. Inmethyl-CpG-binding domain (MBD) yeni nesil sıralama (MBD-seq), çift sarmallı parçalanmış DNA'nın zenginleştirilmesi CpG metilasyon derecesine bağlıdır. Bu yöntem, bisülfit dönüştürme yönteminin dezavantajlarının üstesinden gelebilir ve aynı zamanda, PCR ve bağımsız bir şekilde biseksüel ve PCR ile bağımsız olarak CpG metilasyonunu kapsar. Bisülfit dönüşümlü mikroarray yöntemlerinden farklı olarak, MBD-seq, uzun serpiştirilmiş nükleer elementler (LINEs), kısa serpilmiş nükleer elementler (SINE'lar), uzun terminal tekrarları (LTRS) gibi tekrarlayan elementlerin metilasyon durumunu analiz etmek için kullanılabilir. Vb . Bununla birlikte, bisülfit dönüşüm yöntemlerine kıyasla,Bir MBD-seq protokolü nispeten büyük miktarda giriş DNA'sı gerektirir. Ayrıca, sekanslama kalitesini okur ve veriler, kullanılan antikorların özgüllüğüne, afinitesine ve kalitesine bağlıdır.
Mevcut çalışma, yeni nesil sıralama için metillenmiş DNA'yı zenginleştirmek için ayrıntılı bir MBD-seq protokolünü açıklıyor. Normal sağlıklı kontrollerle karşılaştırıldığında CLL'ye özgü hiper-ve hipometillenmiş bölgeleri tanımlamak için metilasyon dizilimi verilerini görselleştirmek ve yorumlamak için hesaplanmış bir boru hattı yanında ticari bir metillenmiş DNA bağlayıcı zenginleştirme kiti (Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir) kullanır. Temel olarak, bu metot, metillenmiş CpG'ler ile zenginleştirilmiş DNA'yı çıkarmak için metilleştirilen CpG'ler ile insan MBD2 proteini etkileşiminin MBD'sinin kabiliyetini kullanır ve bunu metilasyon DNA'sının yüksek verimli sekanslama izler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
CLL örneklerini toplamak için etik onay, 2007-05-21 arasında aşağıdaki kayıt numarası ile verilmiştir: EPN Gbg dnr 239/07. Tüm KLL hastalarına yakın zamanda gözden geçirilmiş kriterlere göre tanı konuldu ve örnekler tanı anında toplandı. Çalışmaya katılan hastalar, yazılı izin alındığında İsveç'in batı kesimindeki farklı hematoloji departmanlarından alındı. Bu çalışmada, lümenli hücrelerin yüzdesi ≥% 70 olan sadece CLL periferik kan mononükleer hücre (PBMC) örnekleri seçilmiştir.
1. Preparatlar
- Üreticinin talimatlarına göre, ticari bir izolasyon kiti (Malzeme Tablosu'na bakın) kullanarak CLL ve normal, sağlıklı periferik kan örneklerinden DNA ekstraksiyonu için PBMC'leri izole edin.
- Otoklav 1.5 mL tüpler. Metilize DNA bağlama kiti içindeki tüm reaktifleri çözünüz ( Malzeme Tablosuna bakınız). </ Li>
- Boncukları yıkamak ve kit tarafından sağlanan MBD proteinini sulandırmak için kit tarafından sağlanan 5x stok yıkama tamponundan 10 mL 1x'lik boncuk yıkama tamponu hazırlamak için DNaz içermeyen su kullanın.
- Aşağıdaki maddeleri önceden elde edin veya hazırlayın: DNA çökelmesi için 3 M sodyum asetat, mutlak etanol ve% 70 etanol ( Malzeme Tablosu ).
2. Genomik DNA Ekstraksiyonu ve Sonication
- Üreticinin protokolüne göre hasta ve normal PBMC örneklerinden genomik DNA'yı izole etmek için piyasada bulunan bir DNA ekstraksiyon kitini ( Malzeme Tablosu ) kullanın. 260 nm'de bir spektrofotometre kullanarak genomik DNA'yı nicelleştirin.
NOT: DNA ekstraksiyon kolonu kapasitesi maksimum 5-6 milyon hücre; Bu nedenle, 5 milyondan fazla hücre bulunan numuneler için birden fazla sütun kullanmak önemlidir. DNA'yı iki kez eşit hacimlerde 100 mcL 10 mM Tris EDTA (TE) tamponu ile elute edin. Metinde kullanılan MBD-biyotin proteiniMBD dizilimi için madencilik kiti, tek sarmallı DNA'ya bağlanmaz. Dolayısıyla, çift telli yapısını korumak için ayrılan DNA'yı dondurulmuş veya 4 ° C'de tutmak çok önemlidir. - Her örnekten 5 μg genomik DNA'yı 25 ng / μL son konsantrasyonda veren TE tamponu (pH 8) kullanarak toplam 200 μL'ye seyreltin.
- Toplam 30 döngü için bir sonikatör ( Malzeme Tablosu ) kullanarak sonikasyon işlemini gerçekleştirin (döngü başına 30 saniye açık ve 30 saniye sonra, her 5 döngüden sonra, örnekleri altına toplamak için tüpleri kısaca döndürün ).
NOT: Bu, 150 bp ile 300 bp arasında değişen, bu protokol için en uygun parçalanmış DNA üretecektir. - DNA elektroforez görüntüleme ekipmanı kullanarak, önceden piyasaya sürülen% 2'lik agaroz jelinde parçalanmış DNA örneklerinden 1 ml ve bir DNA boyut merdiveni çalıştırılarak, MBD dizilemesinin bir sonraki adımına geçmeden önce, tüm numunelerin sonikasyon aralığını kontrol edin. Görselleştirme tDNA'ya standart bir UV transilluminatörü kullanıyor.
3. MBD-biotin Protein ile Bağlanmadan Önce Boncuk Hazırlama
- Kitin sağladığı stok tüpünden manyetik streptavidin boncuklarını tekrar süspanse edin, homojen bir süspansiyon elde etmek için hafifçe pipetleme ve yukarıya pipetleme yapın. Boncukları vorteks etmeyin veya kurutmalarına izin vermeyin.
- Ayrı, temiz ve etiketlenmiş 1.5 mL tüplere 50 μL boncuk yerleştirin (her 5 μg parçalanmış DNA örneği için). 100 μL'lik son hacme ulaşmak için 50 μL'lik 1x boncuk yıkama tamponu ekleyin.
NOT: Boncukların yıkanması için küçük 0.5 mL polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) şeritleri kullanıldığında, kit protokolünde belirtildiği gibi tüp başına yaklaşık 150-200 μL yıkama tamponu kullanılır. Bununla birlikte, 1.5 mL tüpler durumunda, boncuk yıkaması için tüp başına en az 250 μL ila 300 μL yıkama tamponu ekleyin. - Tüm manyetik boncukların tüpün iç duvarına konsantre olmasını sağlamak için tüpleri bir dakika süreyle bir manyetik tezgah üzerine yerleştirinMıknatısa bakacak şekilde. 200 μL pipet kullanarak, boncuklara dokunmadan sıvıyı alın.
- Tüpleri manyetik standtan çıkarın, 250 μL 1x boncuk yıkama tamponu ilave edin ve boncukları bir pipetle nazikçe karıştırın.
- Tüm numuneler için 3.3 ve 3.4 adımlarını en az 4-5 kez tekrarlayın ve sonuçta 250 μL 1x boncuk yıkama tamponunu tekrar süspansiyon haline getirin. Onları buzda tutun.
4. MBD-biotin Proteini Yıkanmış Boncuklara Bağlama
- Tüpleri ayırmak için 35 μL MBD proteini (1 μg DNA örneği için 7 μL) ekleyin ve 1x boncuk yıkama tamponu kullanarak toplam hacmi 250 μL'ye getirin.
- 250 μL yıkanmış boncuk 250 μL seyreltilmiş MBD proteini ekleyin ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında uçtan uca rotasyonda bırakın.
- Boncukları ve proteini 1 saat karıştırdıktan sonra, manyetik streptavidin boncuklarla bağlanan MBD protein biyotini yıkayın.
- Tüpleri manyetik tezgahın üzerine 1 dakika boyunca yerleştirin ve tBir pipet kullanarak boncuklara dokunmadan sıvı halde. 250 μL 1x boncuk yıkama tamponu ekleyin ve tüpleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir rotasyon mikserine yerleştirin.
- Adım 4.3.1'i iki kez daha tekrarlayın ve yıkanmış MBD-biotin boncuklarını, 200 μL 1x boncuk yıkama tamponunda tekrar süspansiyon haline getirerek boncukları metillenmiş DNA yakalamaya hazır hale getirin.
NOT: Bu şekilde 2-3 kez yıkama, arka planda bağlanmamış MBD protein boncuklarının tümünü kaldırır ve parçalanmış genomik DNA ile MBD proteinine bağlı boncukların verimli bir şekilde bağlanmasını geliştirir.
5. Parçalanmış Genomik DNA ile MBD-biotin Boncukları Bağlama
- Temiz bir 1.5 mL DNaz içermeyen tüp içinde 100 μL 5x boncuk yıkama tamponu ve 180 μL parçalanmış genomik DNA ekleyin (adım 2.3). DNaz içermeyen su kullanarak son hacmi 500 μL'ye getirin.
- Kalan 20 μL parçalanmış genomik DNA'ya 380 μL DNaz içermeyen su ekleyin ve dondurun. Bu örnekleri giriş DN'si olarak kullanınA, kontrolleri tamamlar ve daha sonra nihai yıkanmış metillenmiş DNA numuneleri ile birlikte çöker (bkz. Adım 7.1).
- Yıkanmış MBD-biotin boncukları (adım 4.4) içeren tüpleri 1 dakika için manyetik bir tezgah üzerine yerleştirin ve boncukları rahatsız etmeden sıvıyı alın. Boncuk yıkama tamponunda seyreltilmiş 500 μL parçalanmış genomik DNA ekleyin.
- Tüm tüpleri parafin film ile sıkıca sızdırmaz hale getirin ve 8-10 rpm'de uçtan uca dönme standında gece boyunca 4 ° C'de bırakın.
NOT: DNA ve biotin-boncuk bağlama reaksiyonu, oda sıcaklığında 1 saat yapılabilir, ancak gece boyunca 4 ° C'de bırakıldığında, nihai metilasyon DNA'sının düzelmesini artırabilir.
Bağlanmamış DNA'nın Çıkarılması ve Metilatlanmış DNA'nın Boncuklardan Elüte Edilmesi
- DNA ve MBD-boncuk bağlama reaksiyonundan sonra tüpün iç duvarına tüm boncukları konsantre hale getirmek için tüpleri manyetik rafa 1 dakika boyunca yerleştirin.
- Yüzeydeki sıvıyı dokunmadan bir pipetle çıkarınBoncuklar ve bu bağlanmamış DNA örnek fraksiyonunu buzda muhafaza edin.
- Boncuklara 200 uL 1x boncuk yıkama tamponu ilave edin ve tüpleri oda sıcaklığında 3 dakika dönen standa yerleştirin. Tüpleri manyetik standa yerleştirin ve sıvıyı çıkarın. Artık kalan bağlanmamış DNA'yı çıkarmak için yıkamayı iki kez tekrarlayın.
- Son yıkamadan sonra, DNA'yı ayırmak için kitte verilen 200 μL yüksek tuzlu elüsyon tamponu (2,000 mM NaCl) ekleyin.
- Tüpleri oda sıcaklığında 15 dakika dönen standa yerleştirin. 1 dakika süreyle manyetik tezgah üzerine yerleştirin ve süpernatanı yeni, temiz bir 1.5 mL tüp içine dikkatlice aktarmak için bir pipet kullanın.
- 200 μL yüksek tuzlu elüsyon tamponu ilave edin ve tüpleri oda sıcaklığında 15 dakika döndürerek yıkama işlemini tekrarlayın. İkinci elute'u 200 uL ilk elute içeren tüpün içine ekleyin.
NOT: Toplam elüe edilen DNA'nın son 400 μL'si artık etanolün çökeltilmesi için saflaştırılmışDNA, yeni nesil sıralama için uygundur.
7. Etanol Çökeltme ve Metillenmiş DNA'nın Zenginleştirilmesi
- 1 μL glikojen ekleyin (kitte bulunan 20 μg / μL); 40 uL 3 M sodyum asetat, pH 5.2; Ve 800 μL buzla soğutulmuş mutlak etanol ile elüe edilen DNA'nın 400 μL'ına ve adım 5.2'de hazırlanan 400 μL giriş DNA örneklerine uygulandı.
- Vorteksleyerek tüpleri iyice karıştırın ve gece boyunca -80 ° C'de inkübe edin.
- Tüpleri 12,000 xg (maksimum hız) ve 4 ° C'de santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice atın, 500 μL% 70 etanol ilave edin ve tüpleri vorteksleyin.
- 4 ° C'de 15 dakika maksimum hızda tekrar santrifüjleyin ve oda sıcaklığında 1 dakika süre ile maksimum hızda tüpleri bir pipetle santrifüj ederek süpernatantı çıkarın ve bir pipet ucu kullanarak artık etanolü tamamen çıkarın.
- Pelteyi oda sıcaklığında 5 dakika hava ile kurutunrature. DNA peletine 10 μL DNaz içermeyen su ekleyin. Metilize DNA kantifikasyonuna (basamak 7.6), MBD sekanslamaya (basamak 7.7'ye) ve analizine devam edin (bölüm 8 ve 9).
- Üreticinin talimatlarına göre, piyasada bulunan flüorometrik bir niceleme kiti (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak, elde edilen son metillenmiş DNA numunelerini nicelendirin.
- Not: Bu protokolü kullanarak, her bir numuneden 30-50 ng nihai DNA elde edildi. DNA örnekleri, kütüphane inşası ve yüksek verimli MBD dizilimi için kuru buz üzerinde göndermeye hazır
- Referans 9'da tarif edildiği gibi, ticari bir platform ( Malzeme Tablosu ) kullanarak DNA kütüphanesi yapımı ve yüksek verimli MBD dizilimi uygulayın.
NOT: Nihai metilasyon DNA'sının başlangıçtaki kalite kontrolü için, tüm numuneler için 50 bp çifti sonlandırma dizilimi kullanarak kütüphane hazırlıklarını gerçekleştirin. Ardışık sıralama kontrolü için ham verileri işleyin;Adım 8.1'de detaylandırılmış ve aşağıda tarif edildiği gibi biyoinformatik yaklaşımlar ve istatistiksel yöntemler (adım 8.2-9.6) kullanılarak daha ileri proses.
8. Biyoinformatik Analiz Yöntemi 1: CLL ile ilişkili Farklılaştınlmış Metillenmiş Bölgelerin Belirlenmesi (cllDMR'ler)
- Elde edilen 49-bp'lik okumaları (FASTQ formatı) Trimmomatic 10 veya Cutadapt gibi mevcut kalite kontrol araçlarını kullanarak temizleyin. FastQC araç setini kullanarak kesilmiş okumaların kalitesini çapraz kontrol edin:
Java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP: adapters.fasta: 2: 30: 10 - Temizlenmiş FASTQ dosyalarını bir referans genomu ile karşılaştırmak için kısa okunmuş genom aligner Bowtie ile hizalayın 11 . Parametreleri aşağıdaki gibi belirtin:
- İki uyumsuzluğa kadar izin verin (Bowtie parametresi: -v 2).
- Raporlamayı, okunan her altı en iyi hizaya getirme (Bowtie parametresi: -m 6) ile sınırlandırınÇok eşlemeli okumalar için.
Bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq> ÖRNEK.sam
Not: SAMtools kullanarak BAM hizalamasından sonra tek tek örnekler için oluşturulan SAM dosyalarını dönüştürün.
Samtools görünümü -bS -o SAMPLE.bAM ÖRNEK.sam
- CLL alt gruplarından 12 zenginleştirilmiş / metillenmiş bölgeleri öngörmek için hizalı numunelerde (BAM) ChIP-Seq (MACS) tepe arayanın modele dayalı analizini kullanın.
NOT: Karşılaştırma I: Giriş grubunu kontrol grubu olarak kullanın ve normal ve CLL hasta örneklerini tedavi grupları olarak kullanın. Bu adım, tüm negatif zirveleri toplamaktır (girişler / arka planda zenginleştirilmiş zirvelere). Karşılaştırma II: Normal örneklem grubunu kontrol grubu, CLL hasta örneklem grubunu tedavi grubu olarak kullanın. Elde edilen pozitif tepe noktaları CLL hiper-metillenmiş bölgelerdir ve negatif tepeler, normal veya farklı şekilde metillenmiş bölgeler (DMR) üzerinde CLL hipometillenmiş bölgelerdir.
macs14 -t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --format BAM -g hs - BEDtools 13 kullanarak Farklılaştınlmış Metillenmiş Bölgelerden (DMR) Arka Plan Dağılımlarını Karşılaştırma Çıkarın.
Bedtools çıkarma -a <CLL_enriched_regions> -b <Giriş_enriched_regions> - DMR'lerde zenginleştirilmiş tekrar elementlerin yüzdesini (SINE-Alu, LINE, vb. ) Tahmin edin.
- Referans genom HG19'dan alınan kromozomal koordinatlar ile DMR'lerin FASTA dizisini çıkarmak için fastacmd kullanın.
Fastacmd -d HG19_genome.fa -s Kromozom -L Başlat, Bitir-l 50000> DMRs.fasta - DMR'lerin FASTA dizisindeki tekrar elementlerin yüzdesini tahmin etmek için RepeatMasker komut satırı aracını kullanın.
Tekrarlama Maskeri -gc -gccalc -s -özellikle insan -html DMRs.fasta
- Referans genom HG19'dan alınan kromozomal koordinatlar ile DMR'lerin FASTA dizisini çıkarmak için fastacmd kullanın.
- Tahmini DMR'leri mevcut Ensembl'le [PMC4919035] Homer "annotatePeaks.pl" kullanarak açıklama yapın oR Gencode [PMID 22955987] transkript açıklaması (protein kodlaması ve kodlamayan transkriptler).
AnnotatePeaks.pl DMRs.bed <GENOME> -gtf <Ensembl veya Gencode GTF>
NOT: Bu, zirvelerin farklı genetik bölgeleri ( yani, promoter, ekson, intron, 3 'UTR'ler ve 5' UTR'ler) ve intergenik bölgelere dağılımı hakkında bilgi sağlar. Transkriptler veya DMR'lerle ilişkili genlere, farklı olarak metillenmiş genler (DMG'ler) denir. - CLL DMG'ler tarafından zenginleştirilmiş fonksiyonları (sadece protein kodlayıcı genler) bulmak için güncellenmiş veya mevcut fonksiyonel veritabanı ile zenginleştirme aracını kullanın 14 .
NOT: Fonksiyonel Ek Açıklamaya (GeneSCF) 14 dayalı Gen Seti Kümeleme, güncellenmiş KEGG ve Gen Ontolojisi referans veri tabanı olarak kullanılan işlevsel zenginleştirme analizi için gerçek zamanlı bir araçtır.
9. Biyoinformatik Analiz Yöntemi 2: KLL ile Anlamlı Farklılıkların BelirlenmesiMethylated Bölgeler (cll sigDMR's)
- Yöntem I'den (bölüm 8) 8.1-8.5 arası adımları izleyin ve analiz boru hattına bir daha fazla istatistik seviyesi eklemek için adım 9.2 - 9.6'da ayrıntılı olarak hazırlanan mevcut araçları kullanarak okuma sayısına dayalı farklılaştırılmış zenginleştirme analizini kullanın.
- "Alt Okunak" paketinden "featureCounts" ı kullanarak Normal ve CLL hasta örneklerinde bireysel zirve noktalarına veya DMR'lere eşlenen okuma sayısını nicelendirin 15 .
Altread / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam
NOT: Kötü kaliteli okumaların miktarını belirlemekten kaçınmak için haritalama kalitesi filtresi kullanılabilir ( örn. -Q 30). Bu adım için, elde edilen DMR'ler için SAF dosyaları hazırlayın. SAF dosya biçimi hakkında daha fazla bilgi için lütfen http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/ bağlantısını kullanın. - Normal ve son sıralardaki tek tek tepeler için okuma sayısını içeren bir RAW okuma sayacı tablosu kullanınD CLL hasta örneklem gruplarını edgeR olarak girdi olarak 16 .
NOT: sigDMR'leri bulmak için normal ve CLL hasta örnek gruplarını karşılaştırın. Ayrıntılı zenginleştirme analizi için ayrıntılı adım adım talimatlar için edgeR rehberini takip edin (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf). - SigDMR'leri, sahte keşif oranı (FDR) ve kenar R 16 ile tahmin edilen günlük katlama değişimi kullanarak filtreleyin.
- Tahmini sigDMR'leri Homer "annotatePeaks.pl" kullanarak mevcut Ensembl veya Gencode transkript açıklaması (protein kodlaması ve kodlamasız transkript) ile açıklayın.
AnnotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf <Ensembl veya Gencode GTF> -CpG
NOT: Bu, zirvelerin farklı genetik bölgeleri ( yani, promoter, ekson, intron, 3 'UTR'ler ve 5' UTR'ler) ve intergenik bölgelere dağılımı hakkında bilgi sağlar. Si ile ilişkili transkriptler veya genlerGDMR'lere sigDMG denir. - CLL sigDMG'ler tarafından zenginleştirilmiş fonksiyonları (sadece protein kodlayıcı genler) bulmak için güncellenmiş veya mevcut fonksiyonel veritabanına sahip bir zenginleştirme aracı kullanın 14 .
NOT: Fonksiyonel zenginleştirme analizinin gerçek zamanlı araçlarından biri olan GeneSCF, referans veri tabanları olarak KEGG ve Gen Ontolojisi kullanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MBD-seq son zamanlarda CLL hastalarına ve CLL'ye özgü farklı hiper ve metil amilasyonlu genleri tanımlamak için eşleştirilmiş, normal, sağlıklı kontrollere uygulandı. CLL ve normal sağlıklı örneklerden elde edilen verileri analiz etmek için kullanılan deneysel ve biyoenformatik boru hatları Şekil 1A ve 1B'de gösterilmektedir. Bu analizler, kontrol numuneleri ile karşılaştırıldığında IGHV mutasyona uğramış ve IGHV ile değiştirilmemiş örneklerden önemli derecede hiper / düşük metilasyona tâbi tutulan, <0.00001 p-değere sahip çeşitli CLL spesifik diferansiyel metilasyon bölgeleri (cllDMR'ler) tanımladı. Şekil 2A normal B-hücresi ve normal PMBC karşılaştırmalarından elde edilen tüm CllDMR'leri göstermektedir. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, tüm cllDMR'ler, protein kodlayan ve kodlamayan genlerin farklı sınıflarına eşlendi. Daha da önemlisi, bu analizde karşılaştırmalar perforBağımsız olarak CLL hasta numuneleri arasında, iki farklı normal kontrol ile, sıralı B-hücresi ve PMBC'ler. İlginç olarak, analiz, normal B hücresi kontrolü ve normal PBMC kontrol numuneleri ile karşılaştırıldığında ( Şekil 2C ), ortak ClL spesifik diferansiyel metilasyon genlerinin (cllDMGs; 851 hipermetilatlı ve 2.061 hipometillenmiş) büyük bir örtüşme ile sonuçlandı ve bu, bu CllDMG'lerin Hastalık patogenezinde önemli rolleri olan olası CLL imza genlerini. Analiz edilen veriyi güçlendirmek için, bir hipermetilatlanmış protein kodlama geni SKOR1'de bulunan birkaç CpG bölgesi ve bir hipometillenmiş uzun kodlamayan lncRNA AC012065.7, daha önce yayın 7 , 17 , 18'de ( Şekil 3A'da tarif edildiği gibi) bir piroçeşme yöntemi kullanılarak doğrulandı Ve B ). Şekil 4 , kesilmiş DNA'yı göstermektedirSonication protokolünden sonra. Parçalanmış DNA, 150 ila 300 bp aralığında bulunur ve bu da sekanslama amacıyla idealdir.
Şekil 1: Bu Çalışmada Kullanılan İş Akışına Genel Bakış. Son yayınımız 7'den elde edilen bu rakam, kronik lenfositik lösemi (KLL) hasta numunelerindeki farklı şekilde metillenmiş bölgelerin (DMR) tanımlanması için kullanılan genel analizin tasarımını göstermektedir. ( A ) Metillenmiş DNA'nın MBD'ye dayalı zenginleşmesinin deneysel tasarımı. ( B ) CLL'ye spesifik farklılaşmış metillenmiş bölgeleri (cllDMR'ler) tanımlamak için kullanılan biyoinformatik analiz hattı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Normal, Sağlıklı, Sınıflandırılmış B Hücrelerine kıyasla CLL Hasta Örneklerinin Hipermetilatlı ve Hiprometilleştirilmiş CllDMR'leri ve CllDMG'leri 7 . ( A ) IGHV ile mutasyona uğramış ve değiştirilmemiş CLL numunelerinin normal sıralı B hücrelerine (üst panel) ve normal PBMC numuneleriyle karşılaştırıldığında elde edilen anlamlı p-değerleri (<0.00001) ile tüm kronik lenfositik lösemi (CLL) ilişkili farklılaşmış metillenmiş bölgeler (Alt panel). Isı haritasında gösterilen zenginleştirme değerleri, diferansiyel olarak metillenmiş bölgeden (DMR'ler) ± 3 kb'lik bir pencere içeriyordu. ( B ) IGHV-mutasyonlu ve IGHV-mutasyona uğramamış gruplar arasındaki CLL-spesifik diferansiyel metilasyon genlerinin (cllDMG'lerin, hipermetilatlı ve hipometillenmiş) çakıştığını gösteren Venn şeması. Pasta grafiği, protein kodlaması gibi farklı sınıflandırmaya ait genlerin yüzdesini temsil eder, Uzun kodlamayan RNA (lncRNA), sözde genler, antisens ve diğer kodlamayan RNA'lar. ( C ) B hücresi ve PBMC karşılaştırmaları arasında yaygın olarak diferansiyel olarak metillenmiş genlerin (IGHV mutasyona uğramış ve IGHV-bozulmamış prognostik grupların) çakışmasını gösteren Venn şeması. Venn şemasının sol paneli, hipometillenmiş genler ve hipometilasyona tabi tutulmuş genler için sağ paneldeki örtüşmeyi gösterir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Seçilen önemli ölçüde metilleştirilen Hedeflenen Genlerde Bireysel CpG Siteleri İçin DNA Metilasyon Durumunun Doğrulanması. Bağımsız bir kronik lenfosit kullanarak seçilen iki gen için DNA metilasyon yüzdesinin nicelleştirilmesi için pyrosquencing verileriLl lökemi (CLL) örneklem kohortunda 54 örnek ve 6 normal, sağlıklı, yaşa uygun B hücresi örneği alındı. ( A ) Kasa grafiği, piro sekanslama kullanarak hipermetilatlanmış SKOR1 geninin 3 ayrı CpG bölgesine metilasyon seviyelerinin yüzdesini temsil etmektedir. ( B ) kutu çizelgesi , pirometrik sıralama kullanarak , hipometillenmiş AC012065.7 geninin 5 ayrı CpG mevkisinin metilasyon derecesini gösterir. Kutular, çeyreklerarası aralığı (% 25-75) gösterirken, iç yatay çizgi medyan değerini göstermektedir. Bıyıklar minimum ve maksimum değerleri temsil eder. CLL numunelerinin normal B hücreleri üzerindeki diferansiyel metilasyon derecesine tekabül eden p-değeri her bir CpG bölgesi için kutu çizimlerinde gösterilmektedir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MBD-seq, genom çapında kapsamlı kapsama alanı ile metilasyon modellerini incelemek için kullanılabilecek, maliyet etkin, immüno çökeltme tabanlı bir tekniktir. Hem MeDIP sekansı (metilleştirilen DNA immüno çökeltme, ardından dizilim) ve MBD-seq, CpG bakımından zengin metillenmiş DNA'yı zenginleştirir. Bununla birlikte, MBD-seq, MeDIP sekansı 19 ile karşılaştırıldığında yüksek CpG-zengin bölgelerine bağlanma yönünde daha fazla afinite göstermektedir. Bir metil bağlayıcı zenginleştirme kiti kullanarak, sırasıyla DNA'yı yüksek tuzlu ve düşük tuzlu tamponlarla yıkayarak DNA'yı yüksek CpG ve düşük CpG bakımından zengin bölgelere bölebilirsiniz. Bu araştırmada, CpG adalarının çoğunu kapsayan çok zenginleştirilmiş CpG bakımından zengin bölgelerin yakalanması için yalnızca bir bölüm elüsyon gerçekleştirildi.
MBD-seq, CLL ve diğer lösemi araştırmalarında yaygın olarak kullanılan WGBS'ye güçlü bir alternatif olabilir. MBD-seq, bisülfite kıyasla nispeten daha yüksek miktarlarda giriş DNA'sı gerektirse deDönüştürme esaslı yöntemler ile dönüştürüldükten sonra PCR amplifikasyon önyargıları oluşturulmadan yalnızca 5 mC modifikasyon için spesifik genel metilasyon değişikliklerinin araştırılmasına izin verir. Bu nedenle, MBD-seq, prognostik değeri olan potansiyel epigenetik tabanlı CLL imza genleri olabilen cllDMG'leri hedeflemek için ideal bir yöntemdir.
Bu yöntemi uygulamak için önemli faktörler, bağlama reaksiyonundan önce kullanılan parçalanmış DNA'nın kalitesi ve sonikasyon aralığıdır. Tüm numuneler, 150 ve 300 bp arasında daha kısa fragman aralıkları gösterdi ( Şekil 4 ), böylece, veri filtreleme ve temizlendikten sonra genoma her numune haritalaması için yaklaşık 25-33 milyon eşsiz okuma ile, iyi kalitede sıralama sonuçları elde edildi.
Son olarak, hiper- ve hipometillenmiş CllDMG'lerin metilasyon durumu, bağımsız bir örneklem kohortunda piroekspresyon yöntemi kullanılarak az sayıda gen için geçerlilik kazanmıştır. Bu yöntem,Sekans uzantısı esnasında dahil edilen C ve T miktarına dayanılarak, bireysel CpG bölgelerinde C ila to T oranına bağlı olarak, DNA metilasyonunun yavaşlamasını ifade eder. Hipermetilasyonlu CllDMG'ler, normal numunelere kıyasla CLL numunelerinde yüksek metilasyon yüzdeleri gösterdi. Benzer şekilde, hipometillenmiş CllDMG'lerin tersi gösterilmiştir. İki cllDMG için pirolizleme verileri Şekil 3'te gösterilmektedir.
Dizi tabanlı yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem, protein kodlayıcı bölgeleri kapsayan daha önce açıklanan bölgeler ve tekrar eden elemanlar ve lncRNA'ları kapsayan açıklanmamış diziler de dahil genomdaki dizilerin daha geniş incelemesine olanak tanır. Bu nedenle, KLL hastaları üzerindeki bu yaklaşım, lncRNA'ları ve tekrarlayan elementleri kapsayan birkaç yeni CLLDMG'yi tanımladı. Bu araştırmalar CLL hasta örneklerinde daha önce yapılmadığından, bu çalışma, CLL ile ilişkili diferansiyel metilasyon bölgelerinin belirlenmesinde değerli bir kaynak olarak hizmet etmektedir.Farklı prognostik alt gruplar. Bu cllDMG'ler, epigenetik ilaç tedavisi için yeni biyolojik belirteçler ve hedefler olarak hizmet edecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, İsveç Araştırma Konseyi, İsveç Kanser Topluluğu, Knut ve Alice Wallenberg Vakfı (KAW) ve FoU VästraGötalandsregionen tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer pH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5 mL | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5 mL tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
- Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
- Cahill, N., et al. 450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments. Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).
- Kanduri, M., et al. Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles. Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).
- Kulis, M., et al. Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).
- Booth, M. J., et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science. 336 (6083), 934-937 (2012).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
- Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL. Clin Epigenetics. 8, 106 (2016).
- Hallek, M., et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).
- De Meyer, T., et al. Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing. PLoS One. 8 (3), e59068 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Subhash, S., Kanduri, C. GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms. BMC Bioinformatics. 17 (1), 365 (2016).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Martinelli, S., et al. ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).
- Kopparapu, P. K., et al. Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression. Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).
- Robinson, M. D., et al. Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation. Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).
