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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Zebrafish भ्रूण जर्दी सेल में AFM और Microrheology

Published: November 29, 2017 doi: 10.3791/56224
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 2, 1
1Instituto de Biología Molecular de Barcelona, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, 2Institute for Bioengineering of Catalonia, Universitat de Barcelona and CIBER Enfermedades Respiratorias

Summary

सामग्री गुण और vivo में तनावपूर्ण मापदंडों को मापने के लिए उपकरणों की कमी विकास के दौरान उनकी भूमिकाओं को मान्य रोकता है. हम परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) और nanoparticle-ट्रैकिंग epiboly के दौरान बरकरार zebrafish भ्रूण जर्दी सेल पर यांत्रिक सुविधाओं यों तो कार्यरत हैं । इन तरीकों विश्वसनीय और व्यापक रूप से घुसपैठ हस्तक्षेप से परहेज लागू कर रहे हैं ।

Abstract

Elucidating कारकों है कि प्रत्यक्ष ऊतकों को विकसित करने का spatio-लौकिक संगठन के विकास के अध्ययन में प्राथमिक प्रयोजनों में से एक है । विभिंन प्रस्ताव विभिंन विकासात्मक और morphogenetic प्रक्रियाओं में उनके spatiotemporal संगठन में कोशिकाओं और ऊतकों के यांत्रिक गुणों की समझ के लिए महत्वपूर्ण योगदान किया गया है का दावा है । हालांकि, vivo मेंसामग्री गुण और तनावपूर्ण मापदंडों को मापने के लिए विश्वसनीय और सुलभ उपकरणों की कमी के कारण, इन परिकल्पनाओं को मांय करना कठिन हो गया है । यहां हम वर्तमान परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) और कण epiboly के दौरान बरकरार zebrafish भ्रूण की जर्दी कोशिका के यांत्रिक गुणों को बढ़ाता है के उद्देश्य के साथ ट्रैकिंग काम करने के तरीके । Epiboly एक प्रारंभिक संरक्षण विकास प्रक्रिया है जिसका अध्ययन भ्रूण की पारदर्शिता के द्वारा सुविधा है । इन तरीकों को लागू करने के लिए सरल कर रहे हैं, विश्वसनीय, और व्यापक रूप से लागू करने के बाद से वे घुसपैठ हस्तक्षेप है कि ऊतक यांत्रिकी को प्रभावित कर सकता पर काबू पाने । एक सरल रणनीति नमूनों के बढ़ते, AFM रिकॉर्डिंग, और nanoparticle इंजेक्शन और ट्रैकिंग के लिए लागू किया गया था । यह दृष्टिकोण इन तरीकों को आसानी से अंय विकास के समय या जीवों के लिए अनुकूलनीय बनाता है ।

Introduction

भौतिक morphogenetic प्रक्रियाओं के यांत्रिक नियंत्रण अंतर्निहित सिद्धांतों मुख्यतः अपरिभाषित हैं । जबकि आणविक और सेलुलर स्तर पर यांत्रिक अध्ययन काफी गति से एकत्र कर रहे हैं, ऊतक/जीव स्तर पर यांत्रिक मापदंडों की खोज अपनी प्रारंभिक अवस्था में है । Hydrodynamic प्रतिगमन1 या वीडियो बल माइक्रोस्कोपी2 शोधकर्ताओं सक्रिय और निष्क्रिय बलों भेद करने के लिए अनुमति देते हैं, जबकि लेजर microsurgery3, या कम घुसपैठ परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) असंबद्ध कोशिकाओं के4 या vivo में 5 या nanoparticle microrheology6 एक ऊतक यांत्रिक गुणों और प्रतिक्रियाओं की प्रत्याशा अनुमति देते हैं ।

AFM एक जांच की सतह के साथ संपर्क पर ब्रैकट सुझावों के झुकाव से सतह किसी न किसी और अनुपालन को हल करने के उच्च परमाणु संकल्प के साथ एक तीन आयामी स्थलाकृतिक तकनीक है7। अलग AFM रोजगार के तरीके सतह संपत्तियों की जांच घर्षण, आसंजन बलों, और विविध सामग्रियों के viscoelastic गुणों को मापने सहित, विकसित किया गया है । हाल ही में, AFM जैविक नमूनों के यांत्रिक गुणों के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है । विशेष रूप से, AFM गैर-इनवेसिव एक माइक्रो टिप के साथ थरथरानवाला इंडेंट लागू करके एकल कोशिकाओं से जटिल कतरनी मापांक को दूर कर सकते हैं ज्ञात झुकने के एक ब्रैकट के लिए संलग्न लगातार8. यह हमें परिणामी बलों का अनुमान करने देता है । फिर भी, AFM अद्वितीय और विभिंन तरीकों से rheological डेटा और व्यक्तिगत कोशिकाओं (जैसे, Micropipette आकांक्षा9, चुंबकीय घुमा cytometry (MTC)10, या uniaxial तन्यता से यांत्रिक गुणों को निकालने की अनुमति नहीं है परीक्षण11) ।

फिर भी, जटिल morphogenetic प्रक्रियाओं के लिए इन उपंयास के तरीके के आवेदन सीधा नहीं है । मुख्य चुनौतियों का सामना करना पड़ा जब भ्रूण के ऊतकों के यांत्रिक गुणों का निर्धारण छोटे (µm मिमी), नरम (10 में2 -104 पीए रेंज) और विस्को-लोचदार (समय निर्भर घटना को जंम दे) सामग्री की प्रकृति12। इसलिए यह महत्वपूर्ण है के लिए यांत्रिक गुणों का निर्धारण (कठोरता, चिपचिपापन, आसंजन) भ्रूण और विकासशील जीवों के विशिष्ट मामले के लिए कार्यरत तरीकों को अनुकूलित । विकास का अध्ययन करने के लिए rheological दृष्टिकोण का विश्लेषण करते समय दो महत्वपूर्ण मुद्दों को ध्यान में रखा जाना चाहिए: घुसपैठी हस्तक्षेप से बचने के लिए और आसान पहुंच प्रदान करने के लिए । इस परिदृश्य में, micropipette आकांक्षा, MTC, और तन्यता परीक्षण प्रदर्श सीमाएं । पहले मामले में, उच्च विकृति है कि एक सेल पीड़ित अपने शारीरिक और यांत्रिक गुणों को बदल सकता है9। दूसरे मामले में, दृढ़ता से एक सब्सट्रेट करने के लिए प्रयोगात्मक ऊतक पालन करने के लिए सुनिश्चित करें कि तनाव ख़राब cytoskeleton स्थानीय रूप से भी ' कोशिकाओं सक्रियकरण राज्य पर प्रभाव लागू कर सकता है और, इसलिए, उनके यांत्रिक सुविधाओं में10 . पिछले, uniaxial तंयता दृष्टिकोण विकसित जीवों और पहुंच के11की ज्यामिति द्वारा सीमित हैं ।

AFM विकास प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए बेहतर अनुकूल लगता है क्योंकि यह किसी भी बोझिल नमूना तैयारी के बिना अपने प्राकृतिक वातावरण में सीधे जैविक नमूनों के अध्ययन की अनुमति देता है । इसके अलावा, भ्रूण के ऊतकों के पृथक्करण के रूप में आम तौर पर मुश्किल है, AFM जांच के कम आकार के मध्यम के प्रकार के चुनाव में कोई सीमा के साथ बहुमुखी प्रतिभा के एक उच्च डिग्री प्रदान करता है (या तो जलीय या गैर जलीय), नमूना तापमान, या रासायनिक नमूने की संरचना । AFM काफी बहुमुखी है करने के लिए लागू किया जा करने के लिए बड़े डोमेन और समय तराजू और विशिष्ट विकास चरणों या शारीरिक स्थितियों में ऊतकों की सामग्री गुण प्राप्त करने के लिए नियोजित किया गया है. पूरे देशी ऊतकों जैसे धमनियों13 या हड्डियों14 देखने के एक स्थलाकृतिक बिंदु से अध्ययन किया गया है और कुछ मामलों में, श्वेतपटल की तरह, यांत्रिक गुणों को भी प्राप्त किया गया है15. स्थलाकृति रहते भ्रूण में भी पता लगाया गया है के दृश्य की अनुमति, उदाहरण के लिए, सेल पुनर्व्यवस्था morphogenesis के दौरान Xenopus में16। पिछले, व्यापक नमूना तैयारी प्रोटोकॉल अलग विकासात्मक प्रक्रियाओं के दौरान यांत्रिक मापदंडों का निर्धारण करने के लिए विकसित किया गया है. Nanoindentation नक्शे लड़की भ्रूण पाचन तंत्र11के लिए देशी अनस्थिर ऊतक वर्गों पर उत्पंन किया गया है; चिपकने वाला और यांत्रिक गुण व्यक्तिगत बाह्यत्वक, त्वक, और अन्तः जनक gastrulating zebrafish भ्रूण4से पृथक कोशिकाओं के लिए प्राप्त; कठोरता epiblast और एवियन भ्रूण से explants पर आदिम लकीर के लिए प्रदर्शन किया माप17; और कठोरता ढाल का एक अलग पैटर्न सीधे Xenopus के भ्रूण मस्तिष्क में परिभाषित5।

भ्रूण के विकास की खोज के लिए AFM लागू करने के लिए एक महत्वपूर्ण गुणात्मक छलांग सरल सुलभ morphogenetic प्रक्रियाओं आ से आ सकता है । Zebrafish epiboly एक आवश्यक और संरक्षित घटना है, जिसमें विभिंन ऊतकों एक सीमित गोलाकार अंतरिक्ष में समंवय करने के लिए कुछ ही घंटों में blastoderm के विस्तार प्रत्यक्ष । zebrafish epiboly (गोलाकार चरण) की शुरुआत में, कोशिकाओं की एक सतही परत, ढंक परत (EVL), एक अर्द्ध बड़े पैमाने पर जर्दी syncytial कोशिका पर बैठे भ्रूण के पशु पोल पर केंद्रित blastomeres के गोलाकार टोपी शामिल हैं । Epiboly EVL के cortical वनस्पति वार्ड विस्तार, blastoderm की गहरी कोशिकाओं (dc), और जर्दी के आसपास syncytial जर्दी सेल (ई YSL) के बाहरी परत के होते हैं । Epiboly वनस्पति पोल18,19,20पर EVL और dc के बंद होने के साथ समाप्त होता है । कैसे और कहां बलों epiboly के दौरान उत्पंन कर रहे है और कैसे वे विश्व स्तर पर युग्मित है अभी तक1,21स्पष्ट नहीं है ।

यहाँ हम विस्तार में वर्णन कैसे vivo मेंzebrafish जर्दी सेल में epiboly प्रगति के दौरान निष्क्रिय यांत्रिक ऊतक संपत्तियों का अनुमान लगाने के लिए AFM लागू करने के लिए । ऐसा करने के लिए, हम जांच के रूप में AFM cantilevers से जुड़ी छोटी microspheres कार्यरत हैं । यह गैर वर्दी जर्दी सेल सतह के भीतर सटीक स्थानीय जानकारी की बहाली और तनाव ढाल और समय के साथ उनकी गतिशीलता का अध्ययन करने की अनुमति देता है । वैकल्पिक AFM दृष्टिकोण ऐसी कील cantilevers22का उपयोग करते हुए उन के रूप में, स्थानीय डेटा है कि पर्याप्त सटीक है रेंडर नहीं होगा । कील तकनीक, जो गोंद के लिए बहुत सावधान हेरफेर कौशल की आवश्यकता है एक कील ब्रैकट के अंत में नमूना आकार से बड़ा, भ्रूण की जांच के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है (~ 2-ब्रैकट की लंबाई से बड़ा गुना) यांत्रिकी ।

मॉडलिंग और गुणात्मक और मात्रात्मक तरीकों में कोशिकाओं के viscoelastic गुण निस्र्पक उनके यांत्रिक की एक बेहतर समझ के लिए अनुमति देता है । देखने के एक यांत्रिक बिंदु से, यह epiboly समझ आवश्यक है, और cortical तनाव माप और गतिशीलता है, जो AFM द्वारा निकाला जा सकता है पर न सिर्फ मांग ज्ञान; इस प्रकार वहाँ ऊतक के भौतिक गुणों के बारे में जानकारी के लिए की जरूरत है । इस जानकारी को निकालने के लिए, सेल rheology तकनीक की एक किस्म के वर्षों में विकसित किया गया है क्रम में विभिन्न शारीरिक शर्तों के तहत विभिन्न प्रकार के सेल को चिह्नित करने के लिए23. इनमें AFM, MTC और ऑप्टिकल चिमटी (ओटी) शामिल हैं । इन तरीकों, तथापि, भ्रूण या अंगों के पैमाने पर mesoscopic विश्लेषण के लिए अपर्याप्त साबित किया गया है । एक विकल्प के रूप में, हम सफलतापूर्वक nanoparticle ट्रैकिंग microrheology6 के लिए vivo rheological माप में अनुकूलित किया है । यह तकनीक व्यक्तिगत कणों के Brownian विस्थापनों का विश्लेषण करती है और स्थानीय micromechanical गुणों का अनुमान लगाती है.

एक साथ AFM और nanoparticle microrheology cortical तनावपूर्ण गतिशीलता और epiboly के दौरान जर्दी की आंतरिक यांत्रिक गुणों की परिभाषा की अनुमति देते हैं । यह जानकारी पूरी तरह से एक मॉडल है जिसमें अनिसोट्रोपिक तनाव EVL की विकृति प्रतिक्रिया में अंतर का एक परिणाम के रूप में विकसित करता है और जर्दी Cytoplasmic परत (YCL) ई के आइसोट्रोपिक actomyosin संकुचन YSL प्रांतस्था के लिए आवश्यक है समर्थन EVL और epiboly प्रगति के दिशात्मक नेट आंदोलन1.

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Protocol

नीचे वर्णित सभी प्रोटोकॉल चरण हमारे संस्थानों के पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करते हैं ।

1. Zebrafish कल्चर

  1. नस्ल और मानक शर्तों के तहत वयस्क zebrafish बनाए रखना ।
    नोट: इस अध्ययन के लिए एबी और टीएल वाइल्ड टाइप भ्रूण का इस्तेमाल किया गया ।
  2. भ्रूण ले लीजिए और उन्हें २८.५ डिग्री सेल्सियस पर E3 भ्रूण मध्यम24में हो जाना । पहले बताई गई19के रूप में आकृति विज्ञान के अनुसार उन्हें चरण ।

2. परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी

  1. मैंयुअल रूप से dechorionate zebrafish भ्रूण (अलग उंर के व्यक्तिगत हितों के अनुसार) का मंचन किया । दो पतली और तेज संदंश के साथ चोरियों को दूर ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    1. एक संदंश का उपयोग कर घर का काम पकड़ और अंय संदंश के साथ इसमें एक आंसू बनाते हैं । फिर, एक क्षेत्र में आंसू की है कि विपरीत में चोरियों पकड़, खोलने के माध्यम से धीरे भ्रूण धक्का ।
    2. एक विच्छेदन stereomicroscope के तहत dechorionation के बीच बढ़ाई के एक समायोज्य रेंज के साथ प्रदर्शन करते हैं ।
  2. माउंट AFM के लिए भ्रूण
    1. भ्रूण माध्यम में 2% agarose का समाधान तैयार करें और इस के साथ ३५-mm पेट्री डिश भरें । इसे जमना । व्यास के १.५ मिमी के छोटे छेद (दो बार भ्रूण का आकार) और लगभग ३५० µm गहराई (आधा भ्रूण आकार) agarose बिस्तर में पतली संदंश के साथ बनाओ ।
    2. agarose परत में किए गए प्रहारों में भ्रूण प्लेस और आश्वासन देते है कि वे जगह में भ्रूण माध्यम में ०.५% कम पिघलने agarose के एक समाधान के आसपास फैल द्वारा कर रहे हैं । बस भ्रूण के चारों ओर इस समाधान डालो उंहें छेद में सुरक्षित है ।
    3. इससे पहले कि कम पिघलने बिंदु agarose कमरे के तापमान पर जम जाता है, इस तरह से है कि ब्याज के क्षेत्र AFM द्वारा जांच की जा करने के लिए ऊपर की ओर (चित्र 1a) चेहरा होगा में भ्रूण घुमाएँ ।
  3. AFM ने की भ्रूण की जांच
    1. स्थिति जानें और छवि पेट्री डिश में भ्रूण एक औंधा परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोप में एक 20X उद्देश्य को रोजगार ( सामग्री की तालिका25) कमरे के तापमान पर (23-24 डिग्री सेल्सियस) देखें ।
      नोट: भ्रूण को जिंदा भ्रूण माध्यम में डुबोकर रखा जाता है और agarose पलंग से अटैच कर दिया जाता है.
    2. कैस्टर भ्रूण की जर्दी सेल सतह जांच ०.०१ N के एक नाममात्र वसंत स्थिरांक के साथ एक ब्रैकट करने के लिए संलग्न व्यास में ४.५ µm के गोलाकार polystyrene मोती रोजगार/5 µm और इसकी आवृत्ति के लिए 1 हर्ट्ज के लिए ब्रैकट दोलन की चोटी-से-चोटी आयाम सेट करें ।
    3. प्रत्येक क्षेत्र के लिए डेटा इकट्ठा करने के लिए विभिंन स्थितियों में और कई भ्रूण में परीक्षण किया, एक दिनचर्या के रूप में, औसत डेटा के लिए ।
      नोट: एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु के बीच में स्थित पांच पदों की जांच और एक 10 µm x 10 µm वर्ग के कोनों पर XY पीजो-AFM माइक्रोस्कोप के साथ ब्रैकट स्थिति को नियंत्रित करने से है । इमेजिंग और डेटा संग्रह भ्रूण प्रति 20 मिनट के आसपास ले लिया । भ्रूण की जर्दी सेल सतह के विभिंन क्षेत्रों में डेटा रिकॉर्डिंग, जैसे, वनस्पति पोल या विभिंन क्षेत्रों EVL कोशिकाओं मार्जिन (आंकड़ा 1b और 1C) के करीब, केवल अलग अलग उंमुख नमूनों को रोजगार के द्वारा किया जा सकता है ।
  4. बलों की गणना
    1. AFM ब्रैकट के ऊर्ध्वाधर विस्थापन को मापने (जेड) तनाव गेज सेंसर के साथ पीजो करने के लिए युग्मित-प्रेरक, और इसके विक्षेपन (डी) माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर के साथ ऑप्टिकल लीवर विधि द्वारा एक वृत्त का चक्र photodiode का उपयोग ( सामग्री की तालिका देखें 25).
    2. photodiode संकेत और ब्रैकट झुकाव (डी) के बीच सहसंबंध जांच करने के लिए एक गिलास coverslip के एक नंगे क्षेत्र से एकत्र डेटा से प्राप्त एक डी-जेड वक्र की ढलान का उपयोग करें ।
      नोट: मापा ऊर्ध्वाधर विस्थापन ब्रैकट झुकाव के बराबर होती है और ढलान ऑप्टिकल लीवर के झुकाव संवेदनशीलता का प्रतिनिधित्व करता है26.
    3. थर्मल उतार चढ़ाव से ब्रैकट स्प्रिंग स्थिरांक (k) का अनुमान पहले से27बताया गया है ।
    4. के रूप में नमूना (h) के इंडेंट की गणना:
      h = (z-zc)) -(d-dउतर) (1)          
      नोट: यहां जेडग संपर्क बिंदु और डीबंद की स्थिति है photodiode की भरपाई है ।
    5. के रूप में ब्रैकट पर बल (च) की गणना:
      च = k · d (2)
  5. एक तरल गुब्बारा cortical तनाव की एक लोचदार परत से मिलकर मॉडल के मामले में प्रांतस्था के तनाव की गणना टीसी एक चिपचिपा तरल संलग्न । इस मॉडल में, छोटे इंडेंटेशन (भ्रूण के आकार की तुलना में) के लिए, बल आनुपातिक4,28 के रूप में बढ़ जाती है:
    च = 4π Tc[(rb / Re) + 1)] h (3)
    ध्यान दें: यहां आरबी मनका और आरई की त्रिज्या है भ्रूण की त्रिज्या है । zebrafish भ्रूण के लिए, भ्रूण की त्रिज्या के रूप में (४०० µm) (२.२५ µm) मनका की तुलना में बड़ा परिमाण के दो आदेश है, इस समीकरण के रूप में अनुमानित किया जा सकता है:
    च = 4π Tग h (4)
    1. तनाव बल-इंडेंट की गणना (F-h) प्रत्येक भ्रूण की जर्दी सेल क्षेत्र में पांच विभिंन बिंदु माप के लिए घटता है ।
    2. T के लिए गैर-रेखीय ंयूनतम-वर्ग फिटिंग द्वारा प्रत्येक F-h वक्र की गणना । सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, cortical तनाव टीग परिकलित अलग F-h curves से औसत होना चाहिए ।
  6. कम आयाम (१०० एनएम) multifrequency दोलनों को लागू करने से प्रांतस्था के viscoelastic गुण (rheology) को मापने के लिए अलग आवृत्तियों की AFM तरंगों से बना sinusoidal के दौरान25.
    1. के रूप में बल इंडेंटेशन curves से आवृत्ति डोमेन में एक प्रभावी जटिल मापांक g * (ƒ) की गणना:
      g * (च) = [च(च)/ ज(च)]- ifb (5)
      यहाँ मैं काल्पनिक इकाई है और एफ(एफ) और एच(एफ) बल और इंडेंट की आवृत्ति (F) स्पेक्ट्रा हैं. b सतह पर लागू दोलनों से निकाले गए ब्रैकट पर चिपचिपा खींचें के लिए सुधार है ।
    2. के रूप में वास्तविक और काल्पनिक भागों में अलग g * (ƒ) :
      g * (ƒ) =           g' (f) + ़' ' (च) (6)
      em > जी ' (च) लोचदार मापांक है और लोचदार ऊर्जा का एक उपाय है संग्रहीत और दोलन के चक्र के अनुसार बरामद किया । g' ' (f) चिपचिपा मापांक है जो कि अपव्ययी ऊर्जा के लिए खाते हैं ।
    3. हानि स्पर्श परिकलित करें, जो ठोस-समान (< 1) या लिक्विड-लाइक (> 1) व्यवहार की अनुक्रमणिका प्रदान करता है, जैसा कि:
      g' ' (          f)/ g' ' (f) (7)
      नोट: माप के इस प्रकार के साथ, यह संकेत कैसे चिपचिपा और कैसे लोचदार जांच सामग्री है मापदंडों को निकालने के लिए संभव है । हालांकि बी थोड़ा सतह के लिए ब्रैकट के अंत की दूरी पर निर्भर करता है, जी´ ´ की जर्दी सेल द्वारा प्रदर्शित की बहुत कम मूल्यों को देखते (नीचे चित्र 2d देखें), बी में छोटे रूपों में एक नगण्य प्रभाव है माप29।

3. कण ट्रैकिंग Microrheology

  1. कण microinjection को जर्दी कक्ष में निष्पादित करें
    1. एक क्षैतिज micropipette खींचने और borosilicate केशिका ग्लास ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर सिलवाया microneedles गढ़े ।
      1. १.०० mm, ०.५८ mm के एक भीतरी व्यास और खींचने सेटिंग्स का उपयोग कर 10 सेमी की लंबाई के एक बाहरी व्यास है कि microneedles तैयार करें: दबाव: ५००; गर्मी: ५१०; खींचो: ६५; वेग: २५; समय: ५० ।
    2. एक इंजेक्शन पेट्री डिश प्लेट तैयार करने में एक 1% agarose में सीधे इंडेंट लेन बनाने के द्वारा भ्रूण मध्यम बिस्तर में काम कर रहे कस्टम मोल्ड ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
      1. मोल्ड्स उल्टा कर दें और लिक्विड agarose जेल के ऊपर रखें और जेल को जम जाने के बाद मोल्ड्स को हटा दें । पिपेट में मोल्ड द्वारा बनाए गए खांचे में भ्रूण को 1.2 x आवर्धन पर एक विदारक stereomicroscope के तहत agarose ।
        नोट: चौड़ाई और मोल्ड की डिजाइन भ्रूण स्वयं को सक्षम करने के लिए संरेखित करें ।
    3. इंजेक्शन से पहले, लगभग पूरी तरह से इंजेक्शन की सुविधा के लिए माध्यम को हटाने (सतह तनाव जब इंजेक्शन के बाद इसे हटाने सुई करने के लिए चिपके से भ्रूण/चोरियों को रोकता है) ।
    4. Microinject फ्लोरोसेंट नैनोकणों (त्रिज्या एक = १०० एनएम, सामग्री की तालिकादेखें) पानी में पतला (1:1000) भ्रूण की जर्दी कोशिका के वनस्पति भाग में (चित्रा 3) ।
    5. परिशुद्धता micromanipulators के साथ micropipette समायोजित करें और समय और दबाव नियंत्रण ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ एक स्वत: microinjector के साथ मोतियों का इंजेक्शन 10 और 20 साई के बीच दबाव सेट करें ।
    6. मनका समाधान इंजेक्शन से पहले, मात्रा एक 1x ०.०१ mm चरण माइक्रोमीटर के साथ microinjector द्वारा दिया छोटी बूंद आकार को मापने के द्वारा (०.५ nL) इंजेक्षन करने के लिए जांचना ( सामग्री की तालिकादेखें).
    7. इंजेक्शन, जो कमरे के तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं के दौरान भ्रूण कल्पना करने के लिए विदारक stereomicroscope में 1.6 x का इज़ाफ़ा रोजगार ।
  2. थर्मल उतार चढ़ाव रिकॉर्डिंग द्वारा जर्दी के viscoelastic व्यवहार का आकलन
    1. Dechorionate २.१ चरण में के रूप में microinjected भ्रूण और उंहें एक ०.५% कम पिघलने बिंदु agarose में 30 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण मध्यम समाधान में एंबेड । बाद में, उंहें ग्लास नीचे प्लेटों को हस्तांतरण ( सामग्री की तालिकादेखें) और ओरिएंट और उंहें coverslip की ओर धक्का जब agarose अभी भी तरल है ।
      नोट: जब agarose कमरे के तापमान पर जम जाता है, भ्रूण छवि के लिए तैयार कर रहे हैं ।
    2. microinjection के बाद एक फोकल उल्टे माइक्रोस्कोप 2 एच के मंच पर ग्लास नीचे प्लेटों में घुड़सवार भ्रूण प्लेस । नैनोकणों की छवियों पर कब्जा 26 एस के एक नमूना दर पर 25 हर्ट्ज के कमरे के तापमान पर एक औंधा फोकल माइक्रोस्कोप में एक 63X उद्देश्य के साथ मानक वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर (पिक्सेल आकार = १६६ एनएम, छवियों हर ४० पर कब्जा कर लिया) को रोजगार.
    3. कणों ' centroids की स्थिति की गणना और खुला स्रोत ImageJ सॉफ्टवेयर (चित्र बी) के TrackMate प्लगइन के साथ समय के साथ अपने पथ को परिभाषित करें ।
    4. कस्टम बनाया सॉफ्टवेयर के साथ प्रत्येक कण के दो आयामी माध्य वर्ग विस्थापन (एमएसडी) की गणना6,30 के रूप में:
      < Δr2 (τ) > = < [x(t + τ)- x(t)]2 + [y(t + τ)- y(t)]2>           (8)
      नोट: यहां t बीता हुआ समय और समय अंतराल है । एक शुद्ध चिपचिपा तरल में, एमएसडी चिपचिपापन (ν) के साथ उलटा बढ़ स्टोक्स आइंस्टीन के रिश्ते के अनुसार:
                < Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/6πνa, (9)
      जहां T पूर्ण तापमान है ।

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Representative Results

Cortical तनाव मापन
प्रत्येक माप बिंदु के लिए, पांच बल-विस्थापन (F-z) curves द्वारा AFM द्वारा अधिग्रहीत किए गए थे 1 हर्ट्ज पर ब्रैकट रैंप के साथ 5 µm (वेग = 10 µm/s) के एक अधिकतम इंडेंट अप करने के लिए ~ 2 µm. यह कार्यविधि 20 मिनट से कम ले रही थी और epiboly प्रगति से प्रभावित नहीं थी । प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत में कम से कम 5 भ्रूण का परीक्षण किया गया ।

बल-विस्थापन घटता भ्रूण जर्दी सेल पर दर्ज की गई, मुलायम आसपास के agarose के लिए इसी के विपरीत पर, एक आनुपातिक रैखिक संबंध प्रदर्शन (आर2 > 0.999) (चित्रा 2a) । हम 3 µm/s और 30 µm/s पर नियंत्रण F-z curves के अतिरिक्त सेट का प्रदर्शन किया और ब्रैकट के वेग पर cortical तनाव टीc की एक संभावित निर्भरता खारिज कर दिया । टीसी ने सिर्फ 13% (p < 0.01, t-test) की वृद्धि की है जब वेग 10 से घटाकर 3 µm/s किया गया था और कोई भी महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं दिखा जब 10 से बढ़ाकर 30 µm/

जर्दी सेल पर 10 µm/एस के एक ब्रैकट वेग पर दर्ज बल-इंडेंट (एफ एच) curves लगभग रेखीय थे और एक तरल गुब्बारा मॉडल (चित्र 2 बी)1के साथ सज्जित । इस फिटिंग मतलब सतह तनाव (pN/µm) के विभिंन epiboly चरणों में और विभिंन पदों पर EVL अग्रणी धार के सापेक्ष निरपेक्ष मूल्यों की गणना (संचारित प्रकाश के तहत की पहचान की) (तालिका 1) ।

Rheology के प्रांतस्था
बल-विस्थापन (F-z) वक्र (चित्र 2c) के इंडेंट और पुनर्कर्षण के बीच के अंतर भ्रूण की जर्दी कोशिका प्रांतस्था के viscoelastic व्यवहार का संकेत देते हैं । कम आयाम (१०० एनएम) multifrequency दोलन माप की जर्दी सेल सतह और उसके लोचदार और चिपचिपा घटकों (देखें ऊपर प्रोटोकॉल) के प्रभावी जटिल मापांक जी*(ƒ ) की गणना करने के लिए जानकारी प्रदान करते हैं ।

प्रांतस्था rheology zebrafish भ्रूण जर्दी कोशिका में चिपचिपा मापांक के साथ एक ठोस तरह के व्यवहार पर हावी है 5 बार लोचदार मापांक1से कम । यह व्यवहार या तो लोचदार (ANOVA, p = ०.१२३) के लिए, या चिपचिपा मापांक (ANOVA, p = ०.७१९) (चित्र 2d) के लिए, निर्भर आवृत्ति नहीं है ।

Rheology की जर्दी
जर्दी की चिपचिपाहट फिटिंग समीकरण द्वारा गणना की गई थी (5) एमएसडी डेटा nanoparticle ट्रैकिंग से प्राप्त करने के लिए ( चित्र 4a-B) देखें । एमएसडी की जर्दी में एंबेडेड फ्लोरोसेंट नैनोकणों के थर्मल उतार चढ़ाव के समय अंतराल τ, एक ंयूटोनियन तरल के व्यवहार के अनुरूप पर आनुपातिक निर्भरता दर्शाती है । जर्दी के प्रभावी कतरनी चिपचिपापन, जो व्युत्क्रम नैनोकणों के थोक प्रसार गुणांक से संबंधित है, १२९ mPa · s था ।

Figure 1
चित्रा 1: vivo में zebrafish जर्दी कोशिकाओं की AFM । (क) की स्थापना का वर्णन आरेख को AFM द्वारा zebrafish जर्दी सेल प्रांतस्था जांच करने के लिए कार्यरत हैं । अलग उंर के Dechorionated भ्रूण आधे रास्ते अनुकूलित agarose ब्लॉकों में बनाया छेद में डाला गया, एक विशेष अभिविंयास में घुमाया गया और कम पिघलने बिंदु agarose के साथ किनारों पर बंद कर दिया । जर्दी कोशिकाओं गोलाकार polystyrene एक ब्रैकट (लाल) से जुड़ी मोतियों के साथ जांच की गई । (ख) ५०% epiboly आधा agarose में एंबेडेड पर भ्रूण वनस्पति पोल पर एक ब्रैकट (लाल रंग में झूठी) के साथ जांच की । (ग) बीमें उस के लिए एक समकक्ष भ्रूण, EVL कोशिकाओं मार्जिन के लिए करीब एक क्षेत्र में जर्दी सेल में जांच की । स्केल पट्टियां = १०० µm (B और C) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. Zebrafish भ्रूण की जर्दी सेल cortical तनाव और rheology । (क) बल [झुकाव (d)]-विस्थापन (z) ब्रैकट टिप दृष्टिकोण और संपर्क के रूप में एक प्रतिनिधि भ्रूण के लिए प्राप्त घटता नमूना [agarose सतह (नियंत्रण) नीले रंग में और जर्दी सेल सतह में लाल] । (ख) बल इंडेंटेशन (F-h) घटता (n = 3 भ्रूण, एक दूसरे से 10 µm की दूरी पर प्रति भ्रूण 3 माप । प्रत्येक माप 5 घटता के माध्य का प्रतिनिधित्व करता है) एक लिक्विड-गुब्बारा मॉडल के साथ फ़िट (संदर्भ1से) । भ्रूण की जर्दी सेल सतह के साथ संपर्क पर झुकाव में रैखिक वृद्धि नोट करें । डैश्ड ब्लैक लाइन मॉडल को फिटिंग से पता चलता है (जिसमें से cortical तनाव से नवाजा जाता है) । (ग) सन्निकटन (लाल) और व्याकुलता (बैंगनी) बल-विस्थापन एक प्रतिनिधि भ्रूण के लिए घटता है. घुमावदार लाल और बैंगनी तीर डेटा संग्रह के लौकिक शासन को इंगित करते हैं । डबल नेतृत्व में तीर आ रहा है और विक्षेपण प्रांतस्था के viscoelastic चरित्र की ओर इशारा करते मूल्यों को वापस लेने के बीच अंतर पर प्रकाश डाला गया । (D) Viscoelasticity की जर्दी सेल प्रांतस्था (n = 5 भ्रूण) । प्रभावी जटिल मापांक (g *) multifrequency दोलनों AFM मापन ( 1से) से निकाला गया । लाल प्रतीकों लोचदार मापांक (जी ') का प्रतिनिधित्व करते हैं, और नीले प्रतीकों चिपचिपा मापांक (जी ″), क्रमशः परिभाषित करते हैं । माध्य और मानक त्रुटि (SE) प्रदर्शित किए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. कण ट्रैकिंग microrheology । (क) फ्लोरोसेंट नैनोकणों ५०% epiboly पर zebrafish भ्रूण की जर्दी कोशिका में इंजेक्ट कर रहे हैं । (ख) विस्थापितों को जर्दी (बाएँ) के भीतर बेतरतीब ढंग से वितरित की गई वैयक्तिक नैनोकणों के लिए ट्रैक किया गया. नैनोकणों (centroids) की जर्दी (2 उदाहरण) यादृच्छिक चलता है कि चिपचिपा प्रसार की विशेषता है के भीतर एंबेडेड की विशिष्ट पथ का समय पाठ्यक्रम । स्केल बार = १०० µm (A); 1 µm (B, left); २०० एनएम (बी, दाएं) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. zebrafish भ्रूण की जर्दी का Microrheology । (क) व्यक्तिगत नैनोकणों के MSDs (n = ९९) समय अंतराल के साथ एक लगभग रैखिक निर्भरता प्रदर्शन । (ख) मतलब ± मानक त्रुटि नैनोकणों और जर्दी की चिपचिपाहट की MSDs । पहनावा औसत MSDs (मतलब लाल रेखा ± SE) nanoparticle जनसंख्या के मुख्य रूप से चिपचिपा चरित्र दर्शाती है । रिश्ते की रैखिक ढलान नैनोकणों के प्रसार गुणों को दर्शाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तनाव (pN/मिमी) औसत ± एसई % Epiboly
40-50 60-70 80-90
EVL मार्जिन तक दूरी 20 माइक्रोन (ई-YSL) - ६० ± 7 -
४० माइक्रोन (YCL) ६७ ± 11 ७२ ± 5 ११० ± 7
वनस्पति पोल - ७५ ± 3 -
n = 3 भ्रूण (5 प्रत्येक पर इंडेंट) प्रत्येक शर्त के लिए

तालिका 1: Spatio-Epiboly के दौरान जर्दी सेल सतह पर लौकिक तनाव वितरण ।

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Discussion

यहां हम बताते है कि सामग्री गुण और epiboly के दौरान zebrafish की जर्दी कोशिका के कुछ यांत्रिक मापदंडों आसानी से AFM और नैनोकणों microrheology द्वारा अनुमान किया जा सकता है ।

जबकि AFM शारीरिक स्थितियों में कोशिकाओं और ऊतकों की rheological सुविधाओं को पुनः प्राप्त करने के लिए नियोजित किया गया है4,5,25,28, यहां हम AFM लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित बरकरार विकासशील भ्रूण है कि हम epiboly के दौरान zebrafish भ्रूण की जर्दी सेल सतह का परीक्षण करने के लिए कार्यरत हैं ।

हमारे AFM माप के लिए, भ्रूण के उंमुखीकरण आधे से उंहें कम पिघलने agarose में एंबेडिंग सुरक्षित था । फिर भी, agarose एंबेडिंग AFM माप को प्रभावित नहीं किया । agarose की कठोरता एक गोलाकार टिप के साथ अपनी सतह की जांच द्वारा मापा गया था । हम इस जेल के लिए एक जवान के मापांक (ई) ४.२ ०.२ Pa के एक लोचदार शरीर की एक सपाट सतह को इंडेंट करने वाले एक क्षेत्र के हर्ट्ज संपर्क मॉडल के साथ बल-इंडेंट घटता फिटिंग द्वारा । यह देखते हुए कि ई 3जी', agarose की जर्दी सेल प्रांतस्था (चित्रा 2d) की तुलना में ५०-गुना नरम था । इसलिए, अपनी सीमित मोटाई और बहुत कम कठोरता को देखते हुए, AFM माप भ्रूण के ऊपर दर्ज की बेहद विश्वसनीय दिखाई देते हैं ।

यह ध्यान दें कि AFM डेटा से cortical तनाव के लिए निरपेक्ष मूल्यों को प्राप्त करने के लिए यांत्रिक मॉडल फिटिंग के बारे में चरम देखभाल की मांग महत्वपूर्ण है । zebrafish जर्दी सेल के मामले में, एक बाहरी microtubules-रिच cytoplasmic परत के साथ अपनी अनूठी संरचना के साथ एक अत्यधिक चिपचिपा जर्दी द्रव्यमान को शामिल, हम इस समस्या को दरकिनार एक तरल गुब्बारा एक लोचदार प्रांतस्था संलग्न मॉडल को रोजगार चिपचिपा तरल । इस मॉडल को पहले micropipette आकांक्षा के साथ leucocytes के cortical तनाव का अनुमान किया गया है28, गोलाकार gastrulating टिप्स4के साथ दांतेदार बना zebrafish AFM भ्रूण से गोलाकार जनक कोशिकाओं, और हेला कोशिकाओं के साथ AFM 22cantilevers कील का प्रयोग ।

हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छोटे गोलाकार टिप के साथ इसकी सतह इंडेंट द्वारा जर्दी सेल के cortical तनाव का अनुमान है । इस छोटे से जांच हमें सीधे cortical तनाव में क्षेत्रीय मतभेदों को मापने के लिए अनुमति दी । के रूप में ऊपर वर्णित है, बल-इंडेंट डेटा एक ंयूनतम तरल गुब्बारा मॉडल (Eq .2) के संदर्भ में व्याख्या की गई । एक 3/2 नवोन्मेष के साथ एक शक्ति कानून के रूप में इंडेंट के साथ एक गोलाकार टिप वृद्धि के साथ जैल और कोशिकाओं की सतह पर दर्ज बल घटता. इसके विपरीत, हम एक आनुपातिक बल-इंडेंट संबंध बहुत अच्छी तरह से Eq .2 (चित्रा 2 बी) के साथ फिट पाया । ब्रैकट वेग और कम g' '/g' अनुपात (चित्र 2d) पर टीसी की थोड़ी निर्भरता यह इंगित करती है कि प्रांतस्था यांत्रिकी एक लोचदार व्यवहार का प्रभुत्व है ।

जर्दी यांत्रिकी स्वतंत्र रूप से microparticle rheology के साथ जांच की गई । एमएसडी के रैखिक वृद्धि मनाया स्पष्ट रूप से एक शुद्ध चिपचिपा व्यवहार को दर्शाता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बहुलक समाधान की चिपचिपापन जांच के आकार पर निर्भर करता है31। इसलिए, हम त्रिज्या में १०० एनएम की जांच के साथ मापा जर्दी चिपचिपाहट के मूल्य कुछ हद तक आणविक (जैसे, fluoresce ध्रुवीकरण) या macroscopic माप से अलग सकता है । एक साथ लिया, इन परिणामों तरल गुब्बारा मॉडल की पर्याप्तता और cortical तनाव और जर्दी चिपचिपापन माप की मजबूती के लिए मजबूत समर्थन प्रदान करते हैं ।

हम कारण है कि इस दृष्टिकोण को आसानी से एक ही भ्रूण में blastoderm यांत्रिकी उपाय करने के लिए बढ़ाया जा सकता है या अंय zebrafish में विकास के समय अंक और, अंत में, अंय जीवों के लिए । इस सन्निकटन केवल इंजीनियरिंग उचित बढ़ते प्रक्रियाओं पर निर्भर करेगा (संदर्भ३२देखें) सही समय पर सही स्थानों के लिए AFM जांच के उपयोग की सुविधा । फिर भी, विकास के दौरान सबसे अधिक कोशिकाओं और ऊतकों के निरंतर गति अन्य विकास मॉडल के लिए किसी भी आवेदन में ध्यान में रखा जाना चाहिए. सेल आंदोलनों इन तरीकों के आवेदन बहुत अधिक चुनौतीपूर्ण बना देगा ।

कुछ मामलों में, vivo में AFM लागू किया जाएगा यदि पहुंच समस्याओं को दूर नहीं किया जा सकता । दोनों भ्रूण और वयस्कों के विकास में, कोशिकाओं को काफी हद तक दुर्गम हैं । इस प्रकार, सीटू मेंभौतिक गुणों का परीक्षण करने के लिए, प्रत्यक्ष संपर्क की आवश्यकता नहीं विधियों को रोजगार के लिए अनिवार्य है । Nanoparticle ट्रैकिंग microrheology इन आवश्यकताओं को पूरा करता है6। इस तकनीक को व्यक्तिगत कणों के Brownian विस्थापन के उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ विश्लेषण पर आधारित है । इन नैनोकणों को घेरे viscoelastic द्रव के स्थानीय micromechanical गुण अपने MSDs की सीमा और समय के अंतराल-निर्भरता का प्रत्यक्ष प्रतिबिंब है. यह दृष्टिकोण पहले से ही विकसित जीवों के लिए लागू किया गया है और C. एलिगेंस भ्रूण कोशिका30के अत्यधिक चिपचिपा चरित्र का निर्धारण करने में मदद मिली है । हमने उजागर किया है कि एक zebrafish जर्दी सी. एलिगेंस भ्रूण के साथ समतुल्य गुण प्रदर्शित करता है, हालांकि इसकी चिपचिपापन परिमाण के दो आदेश कम है । zebrafish जर्दी के उन लोगों के लिए जर्दी चिपचिपापन के समान मूल्यों के साथ एमएसडी की एक रैखिक समय निर्भरता हाल ही में Drosophila३३में सूचित किया गया है ।

हालांकि हम इस संभावना का पता लगाने के अपने आप को नहीं था, इंजेक्शन unकोट और लेपित नैनोकणों हाल ही में zebrafish लार्वा३४में ऑप्टिकल चिमटी के लक्ष्य के रूप में नियोजित किया गया है । गैर इनवेसिव एक पूरे जीव के अंदर micromanipulation न सिर्फ सेल बातचीत में प्रत्यक्ष अंतर्दृष्टि लेकिन यांत्रिक गुणों और गतिविधियों में मौजूदा दृष्टिकोण का उपयोग कर सुलभ नहीं दे सकता है ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों या हित के अंय संघर्ष की घोषणा ।

Acknowledgments

हम अमायरा हर्नेनडेज़-वेगा और फिलिप-एलेक्जेंडर Pouille इन प्रोटोकॉल के लिए आधार स्थापित करने में भाग लेने के लिए धंयवाद । हम भी IBMB-पीसीबी, जेवियर Esteban और सतत समर्थन के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों से आणविक इमेजिंग मंच का शुक्र है । Generalitat de Catalunya और DGI और Competitivity अर्थव्यवस्था और स्पेन के EMB और डीएन के मंत्रालय से समेकन अनुदान के समेकित समूहों कार्यक्रम इस काम का समर्थन किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted optical microscope Nikon TE2000 Visualization of the sample and AFM cantilever
Atomic force microscope (AFM) Custom made - Any commercialized AFM could be employed
Inverted Confocal microscope Zeiss LSM780 Nanorheology data collection
Agarose D1 Low EEO Conda 8016.00 Casting embryos
Ultrapure LMP Agarose (low melting) Invitrogen 16520-100 Securing embryos
Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds World Precision Instruments Z-MOLDS Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed
Dumont 5 Forceps FST 11251-20 1.5 mm diameter
Si3N4 cantilever Novascan PT.GS Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m
Fluorescent nanoparticles Life Technologies FluoSpheres F8811, For tracking nanorheology
Micropipette puller Sutter Instruments P-2000 Fabricating tailored microneedles
Borosilicate capillary glass Warner Instruments G100TF-4 Fabricating tailored microneedles
Micromanipulator Narishige MN-153 Manipulating the micropipette
Microinjector Eppendorf FemtoJet Express Controlling injection time and pressure
Stereomicroscope Leica DFC365FX Visualization of the embryos during injection
Analysis Software MathWorks Matlab Analyzing AFM and particle tracking data
Zebrafish AB and TL wild type - Strains employed for embryo collection
Glass Bottom Plates Mat Tek P35G-0.170-14-C Mounting embryos for nanorheology data collection
Stage micrometer FST 29025-02 Measuring injection volume

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १२९ Zebrafish जर्दी परमाणु बल माइक्रोस्कोपी Cortical तनाव Microrheology Nanoparticle ट्रैकिंग
Zebrafish भ्रूण जर्दी सेल में AFM और Microrheology
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Marsal, M., Jorba, I., Rebollo, E.,… More

Marsal, M., Jorba, I., Rebollo, E., Luque, T., Navajas, D., Martín-Blanco, E. AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell. J. Vis. Exp. (129), e56224, doi:10.3791/56224 (2017).

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