Summary
Este protocolo describe un método sencillo y útil para almacenar sangre periférica y suero o plasma para análisis de aguas abajo como evaluación de un solo nucleótido polimorfismo (SNP) y el ensayo ELISA.
Abstract
Calidad de la muestra de sangre es crucial para asegurar el exactos análisis aguas abajo como en tiempo real PCR o ELISA. Almacenamiento correcto de materiales biológicos es el punto de partida para lograr resultados reproducibles y confiables. Todas las muestras deben ser tratadas de la misma forma de colección de sangre para almacenamiento. Dependiendo de los análisis a realizar, muestras de suero y sangre entera deben almacenarse a-20 ° C o -80 ° C hasta su uso. Las muestras de suero de sangre deben ser también alícuotas para evitar múltiples hielo-deshielo. Otra cuestión importante es las condiciones de la muestra durante el transporte de un laboratorio a otro. Si no hay hielo seco o el envío tarda más de unos días, se necesitan enfoques alternativos. Una opción es utilizar papel de filtro para recolección de sangre. Aquí, proponemos un método para la sangre y toma de muestras de suero que se aprovecha de secado manchas de sangre (DBS) y secado manchas de suero (DSS). Desarrollamos el procedimiento para extraer ADN de DBS para la posterior evaluación de algunos polimorfismos de nucleótido único (SNPs) por PCR en tiempo real. También hemos optimizado un ensayo de ELISA a partir de proteínas eluidas de DSS. Este método puede utilizarse con otros ensayos de ELISA o procedimientos de evaluación de las proteínas.
Introduction
El principal objetivo de la investigación en biomarcadores del cáncer es la identificación de nuevos parámetros biológicos que pueden utilizarse para el diagnóstico, de predicción de pronóstico paciente y para determinar si un paciente responderá a un tratamiento específico. Esta área de investigación es fundamental para el descubrimiento de tratamientos innovadores contra el cáncer y desempeña un papel clave en el tratamiento a medida.
Los procedimientos llevados a cabo durante cada paso de la identificación de biomarcadores y la validación deben ser fiables y reproducibles. Una piedra angular para el éxito de la investigación traslacional es el correcto almacenamiento de muestras biológicas tales como sangre y suero. Este es el primer paso hacia la obtención de material biológico de alta calidad que puede utilizarse para llevar a cabo experimentos de biología molecular o el análisis de proteínas.
A menudo se necesitan estudios multicéntricos reclutar suficientes pacientes para obtener datos robustos. No todos los institutos son capaces de almacenar las muestras a-80 ° C o enviar muestras a otros centros internacionales en hielo seco. El uso de papel de filtro para recolección de sangre es un método simple para el almacenamiento de sangre y suero y no requiere la congelación inmediata de las muestras1,2. Una gota de sangre o suero puede ser identificada en el papel, deja que seque durante la noche y entonces almacenar por hasta 14 días a temperatura ambiente1,2. Esto le da a los investigadores tiempo para enviar las muestras a otros laboratorios. El uso de sangre seca manchas (DBS) y manchas de suero seco (DSS) así podrían simplificar la colaboración entre los institutos en los países desarrollados y en vías de desarrollo.
Dada su facilidad de uso, muestreo de DBS es ampliamente utilizado en varios tipos de análisis genéticos o serológicos análisis aguas abajo. Por ejemplo, en el pasado, DBS se utiliza con frecuencia para el VIH en los países en desarrollo1,2,3,4,5. Otra ventaja de este método de almacenamiento es que se pueden recoger muestras de sangre del dedo-pinchazos, lo que permite su uso para recién nacidos cribado pruebas 6,7,8. Muestra fácil manipulación y el transporte son otras ventajas de DBS, especialmente para las muestras recogidas en sitios remotos donde no hay ningún equipo de laboratorio. En una publicación anterior, utilizamos DBS y DSS para probar la vitamina D y proteína de unión a vitamina D (DBP) en una serie de pacientes caucásicos y africanos9. Nuestros colegas africanos no fueron capaces de obtener hielo seco. Para comparar los marcadores biológicos para entender las diferencias en el camino de vitamina D entre las dos poblaciones étnicas, hemos mejorado el procedimiento de emparejado muestras almacenadas bajo condiciones estándar y en papel de filtro. Después de optimizar el procedimiento DBS/DSS, hemos podido analizar el DBP y la vitamina D en suero del paciente en ambas cohortes. También se evaluó una serie de polimorfismos de nucleótido único (SNPs) después de la extracción de ADN de sangre para los caucásicos y de DBS para los africanos9. El presente Protocolo permite las muestras de sangre de alta calidad para ser almacenado a temperatura ambiente sin que afecten a diferentes tipos de análisis aguas abajo desde biología molecular hasta los ensayos ELISA. Se recomienda administrar materiales biológicos en estudios multicéntricos o centros que no disponen de instalaciones para las condiciones de almacenamiento estándar. El siguiente protocolo representa la culminación de estos procedimientos optimizados.
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Protocol
Suero y sangre periférica fueron recogidos y almacenados procedentes de donantes sanos y pacientes que dieron consentimiento informado para participar en el estudio. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité local de ética conforme a las normas éticas establecidas en la declaración de Helsinki de 1964.
1. sangre almacenamiento en DBS
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Recogida de muestras de sangre
- Recoger 3 mL de muestra de sangre periférica en un tubo de 3 mL con 5,4 mg de ácido etilendiaminotetracético (EDTA).
Nota: Almacene sangre periférica como DBS tan pronto como sea posible y dentro de 8 h. - Escriba el número de código del paciente en la parte inferior derecha de la tarjeta de ahorro.
- Resuspender cuidadosamente la sangre con una pipeta de 5 mL.
- Recoger 3 mL de muestra de sangre periférica en un tubo de 3 mL con 5,4 mg de ácido etilendiaminotetracético (EDTA).
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Sangre manchas en DBS
- Pipeta y transferir una mancha de sangre (50 μL) en la tarjeta de ahorro (Tabla de materiales) con una punta de 50 a 200 μl.
- Repetir el punto 1.2.1. para tener un total de 3 a 5 puntos de sangre. Deseche la punta vieja y tomar uno nuevo para cada sangre alícuota.
- Deje el DBS seco durante la noche a temperatura ambiente en posición horizontal sobre una superficie no absorbente abierta, evitando la luz directa sol. Deje la tapa de la tarjeta de ahorro abierta para facilitar el secado de la sangre.
Nota: Cualquier partículas en el aire o polvo durante esta etapa de sequía no afectan a aplicaciones posteriores. - Guarde la tarjeta en la temperatura ambiente en una bolsa con desecante hasta su uso.
2. ADN extracción a partir de DBS según ficha técnica extracción DNA Kit (sección para manchas de sangre seca)
-
Preparación de la muestra
- Utilice 3 manchas de sangre seca de la tarjeta. Cortar cada una de las manchas de sangre seca de la tarjeta y separarlos de la tarjeta con las pinzas. Cortar las manchas de sangre seca separado en trozos pequeños (de aproximadamente 1 mm de diámetro).
- Coloque las piezas pequeñas en un tubo de centrífuga de 1.5 mL.
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Digestión de la muestra
- Añadir 180 μl de tampón de lisis 1 en el juego (Tabla de materiales) al tubo. Añadir 20 μl de proteinasa K. No mezcle el tampón de lisis 1 con proteinasa k antes de pipetear en el tubo de 1,5 mL de sangre vista tarjeta. Mezclar con un vórtex.
- Coloque el tubo en un thermoincubator e incubar a 56 ° C durante 60 minutos. Si el thermoincubator no está equipado con un agitador, vórtice la muestra cada 10 – 15 min por lo menos 10 s, teniendo cuidado de no dejar que la temperatura de la muestra disminuye. Centrifugar brevemente los tubos para eliminar las gotas de la tapa.
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Paso de lavado
- Añadir 200 μL de tampón de lisis 2 (Tabla de materiales) y vortex por 10 s.
- Coloque los tubos en un Termomezcladores o incubadora orbital climatizada e incubar a 70 ° C durante 10 minutos. Si el thermoincubator no está equipado con un agitador vortex las muestras una vez por al menos 10 s, teniendo cuidado de no dejar que la temperatura de las muestras de disminuir.
- Repita el paso 2.3.1. Transferir 400 μL de lisado del tubo de 1,5 mL a columna de elución (Tabla de materiales). Centrifugar la columna a 6.000 x g durante 1 minuto.
- Coloque la columna de elución en un nuevo tubo de recogida de 2 mL y desechar el anterior.
- Añadir 500 μl de tampón de lavado 1 (Tabla de materiales) y centrifugar a 6.000 x g durante 1 minuto.
- Coloque la columna en un tubo nuevo de colección de 2 mL y desechar el anterior.
- Añadir 500 μl de tampón de lavado 2 (Tabla de materiales) y centrifugar a 6.000 x g durante 1 minuto.
- Coloque la columna en un tubo nuevo de colección de 2 mL y desechar el anterior.
- Centrifugue a 20.000 x g durante 3 min secar la membrana.
-
Paso de elución
- Coloque la columna en un nuevo tubo de centrífuga de 1.5 mL y desechar el tubo de colección.
- Depositar 50 μl de agua destilada en el centro de la membrana. Incubar 10 min a temperatura ambiente.
- Centrifugar el tubo a 20.000 x g durante 1 minuto recoger el eluyente y coloque otra vez en el centro de la membrana.
- Centrifugar el tubo a 20.000 x g durante 1 minuto deseche la membrana.
- Medir la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro.
- Tienda ADN a-20 ° C hasta su uso.
Nota: La DNA extraída de DBS puede utilizarse para realizar varios análisis tales como evaluación de SNP por tiempo Real PCR o ADN Sanger secuenciación.
3. suero almacenamiento para DSS
-
Recogida de muestras de sangre
- Recoge 7 mL de la muestra de sangre periférica en un tubo de 7 mL sin EDTA. Dejar la muestra de sangre a coagular durante 30 min a temperatura ambiente.
- Escriba el número de código del paciente en la parte inferior derecha de la tarjeta de ahorro.
- Centrifugar la muestra de sangre en el 980 x g durante 15 min a temperatura ambiente.
Nota: Almacene suero como DSS tan pronto como sea posible y dentro de las 8 h. - Con cuidado quite el sobrenadante del tubo y transferir a un nuevo tubo de 15 mL. Resuspender cuidadosamente la sangre con una pipeta de 5 mL.
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Suero manchado en DSS
- Pipeta y transferir un punto de suero (50 μL) en la tarjeta de ahorro. Repita este paso para tener un total de 3 a 5 puntos de sangre.
Nota: Tenga muy cuidado al pipetear exactamente 50 μl de suero en cada punto. Suero no debe ir más allá de la línea discontinua de la tarjeta. - Deje el DSS seco durante la noche a temperatura ambiente. Deje la tapa de la tarjeta de ahorro abierta para facilitar el secado de la sangre.
- Guarde la tarjeta en la temperatura ambiente en una bolsa con desecante hasta su uso. Si el almacenamiento es mayor de 14 días, guarde la tarjeta a-20 ° C.
- Pipeta y transferir un punto de suero (50 μL) en la tarjeta de ahorro. Repita este paso para tener un total de 3 a 5 puntos de sangre.
4. ensayo ELISA a partir de DSS
-
Eluir la proteína de DSS.
- Si es necesario descongelar un DSS para cada muestra. Corte la DSS (aproximadamente 1 mm de diámetro). Poner las piezas en un tubo de 1,5 mL con 400 μL de PBS.
- Agitar las muestras durante la noche a 4 ° C.
Nota: Les sacuda a baja intensidad. PBS no debe mojar la cubierta del tubo durante el sacudimiento.
- Utilizar el efluente de la proteína como una muestra de suero para el análisis de factor de crecimiento secretado proteína según las instrucciones del kit de ELISA, después de las diluciones apropiadas.
Nota: Este procedimiento funciona bien para DBP detección9. Para otros ensayos de ELISA, puede ser necesario un paso de optimización.
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Representative Results
Tomamos ventaja de los procedimientos de DBS y DSS para almacenar sangre y suero a temperatura ambiente sin afectar la calidad del material biológico. La figura 1 muestra un ejemplo del protector de la tarjeta de la proteína sin sangre y después de la recolección de sangre. Para confirmar que el almacenamiento en papel de filtro y el procedimiento a fin de eluir sangre no interfieren con la calidad de la muestra, realizamos una comparación con métodos de almacenamiento estándar. Extrae ADN de 3 emparejadas muestras de sangre entera recogida en un tubo de 2 mL o como DBS, como se informó en la sección de protocolo. Cinco SNPs se analizaron por PCR en tiempo real. Los datos obtenidos para muestras emparejadas fueron 100% concordantes.
Con respecto a los análisis ELISA, almacena 8 muestras de suero recogida en un tubo de 2 mL (y almacenar inmediatamente a-80 ° C) y como DSS (almacenado a temperatura ambiente durante una semana y luego a-20 ° C). Eluyen proteínas de DSS, como se describe en la sección de protocolo y luego realizó ELISA según ficha técnica del fabricante para DBP para 8 muestras. Resultados se muestran en la tabla 1. El coeficiente de variación (CV) entre muestras emparejadas entre 2% y 24%. El CV promedio fue de 9,6%.
Figura 1: ejemplo de DBS antes y después de la recolección de sangre. (A) tarjeta de ahorro de proteínas. (B) tarjeta de ahorro de proteína después de tomar muestras de sangre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| DBP (μg/mL) | |||
| Muestras | Suero (st) | DSS | CV % |
| 1 | 66,47 | 65.28 | 2 |
| 2 | 213.31 | 216.51 | 1 |
| 3 | 164.96 | 145.21 | 14 |
| 5 | 109.81 | 120.28 | 9 |
| 6 | 162.70 | 130.60 | 24 |
| 7 | 124.63 | 117.13 | 6 |
| 8 | 149.47 | 132.69 | 12 |
Tabla 1: niveles DPB en muestras de suero y emparejado DSS. Niveles DBP analizados por análisis de ELISA. CV es el coeficiente de variación calculado entre los 2 valores obtenidos. El porcentaje de la CV se calcula como sigue: valor de ((DSS value-Serum value)/DSS) x 100%.
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Discussion
Este protocolo investiga el potencial de almacenamiento de sangre y suero en papel filtro cuando los laboratorios no tienen el personal o las infraestructuras necesarias para el correcto manejo de las muestras de sangre. En particular, sangre entera o suero recogido en tubos estándar o por pinchazo de dedo puede almacenarse usando este método y no es necesario congelar las muestras a-20 ° C o -80 ° C inmediatamente después de la recolección de sangre. DBS/DSS puede permanecer a temperatura ambiente hasta por 14 días sin ningún cambio en la integridad del suero de la sangre. Una cuestión crítica para el almacenamiento es la presencia de humedad que afecta a las propiedades del material biológico más que temperatura. Este problema puede evitarse mediante el uso de bolsas de plástico con desecante. Humedad se convierte en un problema durante el almacenamiento cuando las tarjetas están dentro de las bolsas de plástico. No se observaron problemas de partículas en aire, gotas, polvo o humedad durante la incubación durante la noche10. Anteriormente utilizamos papel de filtro para almacenar sangre y suero en un estudio de marcadores biológicos en cohortes italianos y africanos11. Se optimiza la extracción de ADN de DBS y analizaron un número de SNPs en ambas series de casos. Como también estábamos interesados en la evaluación de los niveles de proteínas, hemos optimizado un método para eluir las proteínas de DSS para realizar ensayos de ELISA. Almacenamiento de suero en DSS para ELISA es más delicado que el almacenamiento de sangre para análisis cualitativo porque los investigadores del laboratorio debe asegurarse de pipetear exactamente la misma cantidad de suero en las muestras. Si no es exacto el pipeteo, análisis aguas abajo podría deteriorarse. Mientras que el procedimiento de extracción de ADN se puede aplicar a otros análisis moleculares, el procedimiento de la proteína debe optimizarse en muestras combinadas para cada nuevo factor del cytokine/secretada investigado. Es importante cortar DSS en trozos muy pequeños y para mojar las piezas de la tarjeta con PBS durante la incubación durante la noche para asegurar la elución de la proteína eficiente. Este es un paso más delicado que el de elución de sangre porque es una evaluación cuantitativa.
En los últimos años, este enfoque de almacenamiento ha sido ampliamente utilizado para diferentes aplicaciones (como se describe en este protocolo) de biología molecular para análisis de proteína12,13. En particular, buena calidad totales resultados a partir de suero en tarjetas de ahorro han sido registrados14, confirmando la alta flexibilidad y fiabilidad del método.
Nuestros resultados, de acuerdo con la literatura, destacan la utilidad de almacenar muestras como DBS y confirman la fiabilidad de este procedimiento con respecto a los métodos de almacenamiento estándar. Confirmó los resultados anteriores y subrayó la posibilidad de optimizar un ensayo de ELISA usando nuestros métodos de almacenamiento de información. Gracias a su simplicidad, los países en desarrollo también pueden contribuir a la investigación del cáncer. Por ejemplo, como la mayoría de los estudios sobre los africanos se llevan a cabo en americanos africanos, muy pocos datos están disponibles en nativos africanos9. El uso de DBS podría ayudar a reducir esta brecha.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Gráinne Tierney por asistencia editorial.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
References
- Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
- Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
- Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
- Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
- Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172 (2017).
- Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
- Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
- Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
- Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
- Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
- Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
- St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710 (2013).
- Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).
