Summary
Denne protokol beskriver en simpel og nyttig metode til at gemme perifert blod og serum/plasma til downstream analyser som enkelt nukleotid polymorfisme (SNP) evaluering og ELISA assay.
Abstract
Blod prøve kvalitet er afgørende at sikre nøjagtig downstream analyser såsom real-time PCR eller ELISA. Korrekt opbevaring af biologiske materialer er udgangspunktet for at opnå reproducerbare og pålidelige resultater. Alle prøver skal behandles på samme måde fra indsamling til opbevaring. Afhængigt af analyserne skal udføres, bør fuldblod og serumprøver opbevares ved-20 ° C eller-80 ° C indtil brug. Blod/serum prøver bør også være aliquoted at undgå flere fryse-optøning. Et andet vigtigt spørgsmål er de prøve betingelser under forsendelsen fra ét laboratorium til en anden. Hvis tøris er ikke tilgængelig eller leverancen tager længere tid end et par dage, er alternative tilgange nødvendige. En mulighed er at bruge filtrerpapir for blod samling. Her foreslår vi en metode for blod og serum prøve samling, der udnytter tørret blod steder (DBS) og tørret serum steder (DSS). Vi udviklede procedure for at udtrække DNA fra DBS for den efterfølgende evaluering af nogle single nucleotide polymorphisms (SNPs) af realtid PCR. Vi har også optimeret en ELISA assay startende fra proteiner elueres fra DSS. Denne metode kan bruges med andre ELISA assays eller procedurer evaluering proteiner.
Introduction
Hovedformålet med forskning i kræft biomarkører er identifikationen af nye biologiske parametre, der kan bruges til diagnosticering, forudsige patienternes prognose og for at afgøre, om en patient vil reagere på en bestemt behandling. Dette forskningsområde er grundlæggende for opdagelsen af innovative kræftbehandling og spiller en nøglerolle i skræddersyet behandling.
De procedurer, der er gennemført under hvert trin af biomarkør identifikation og validering skal være pålidelig og reproducerbar. En hjørnesten for en vellykket gennemførelse af Translationel forskning er korrekt opbevaring af biologiske prøver som blod og serum. Dette er det første skridt mod at opnå høj kvalitet biologisk materiale, der kan bruges til at udføre Molekylærbiologi eksperimenter eller protein assays.
Multicenter studier er ofte behov for at ansætte nok patienter for at få solide data. Ikke alle institutter er i stand til at gemme prøver på-80 ° C eller til at sende prøver til andre internationale centre i tøris. Brug filtrerpapir for blod samling er en simpel metode til lagring af blod og serum og kræver ikke de omgående frysning af prøver1,2. En dråbe blod eller serum kan blive opdaget på papir, overladt til tørre natten over og derefter lagret i op til 14 dage ved stuetemperatur1,2. Dette giver forskere tid til at sende prøverne til andre laboratorier. Anvendelse af tørret blod pletter (DBS) og tørrede serum steder (DSS) kunne således forenkle samarbejdet mellem institutter i udviklede lande og udviklingslande.
I betragtning af sin brugervenlighed, er DBS prøvetagning meget udbredt i flere typer af assays til serologisk eller genetisk downstream analyser. For eksempel, i fortiden, blev DBS ofte brugt til HIV screening i udviklingslandene1,2,3,4,5. En anden fordel ved denne opbevaring metode er, at blodprøver kan indsamles fra finger-pricks, således at dets anvendelse til nyfødte screening test 6,7,8. Nem prøven håndtering og transport er yderligere fordele af DBS, især for prøver, der opsamlet i fjerntliggende steder hvor der ikke er nogen laboratorieudstyr. I en tidligere publikation brugte vi DBS og DSS for at teste vitamin D og vitamin D bindende protein (DBP) i en serie af kaukasisk og afrikanske patienter9. Vores afrikanske kolleger var ikke i stand til at opnå tøris. Hvis du vil sammenligne de biologiske markører for at forstå forskellene i D-vitamin vej mellem de to etniske befolkningsgrupper, forbedret vi yderligere proceduren ved hjælp af matchede prøver opbevares under standardbetingelser og på filtrerpapir. Efter optimering DBS/DSS procedure, har vi kunnet analysere DBP og D-vitamin i patientens serum i begge årgange. Vi har også vurderet en antallet af single nucleotide polymorphisms (SNPs) efter DNA-ekstraktion fra fuldblod for kaukasiere og DBS for afrikanere9. Denne protokol tillader høj kvalitet blodprøver skal opbevares ved stuetemperatur uden at påvirke forskellige typer af downstream analyser spænder fra Molekylærbiologi til ELISA assays. Det anbefales til brug til at håndtere biologiske materialer i multicenter studier eller centre, der ikke har faciliteter for standard opbevaringsforhold. Følgende protokol repræsenterer kulminationen på disse optimeret procedurer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Perifert blod og serum blev indsamlet og lagret fra raske donorer og patienter, der gav skriftlig informeret samtykke til at deltage i undersøgelsen. Undersøgelse-protokollen blev godkendt af de lokale etiske udvalg i overensstemmelse med de etiske standarder fastlagt i Helsinki 1964-erklæringen.
1. blodet opbevaring i DBS
-
Blod prøve indsamling
- Indsamle 3 mL af perifert blodprøven i 3 mL rør med 5,4 mg ethylendiamintetra syre (EDTA).
Bemærk: Butikken perifert blod som DBS hurtigst muligt og inden for 8 h. - Skrive patient kodenummeret på det nederste højre hjørne af kortet saver.
- Omhyggeligt resuspend blod med 5 mL pipette.
- Indsamle 3 mL af perifert blodprøven i 3 mL rør med 5,4 mg ethylendiamintetra syre (EDTA).
-
Blod spotting på DBS
- Der afpipetteres og overføre en plet af blod (50 µL) på saver kortet (Tabel af materialer) med en 50-200 µL spids.
- Gentag trin 1.2.1. at have en i alt 3 – 5 blod steder. Kassér den gamle spids og tage en ny for hver blod alikvot.
- Forlade DBS til tørre natten over ved stuetemperatur i en vandret position over en åben ikke-absorberende overflade, undgår direkte sollys. Åbner forsiden af kortet saver at lette blod tørring.
Bemærk: Alle partikler i luften eller støv under trinnet tørring påvirker ikke downstream applikationer. - Gemme kort ved stuetemperatur i en plastik pose med tørremiddel indtil brug.
2. DNA-ekstraktion fra DBS ifølge DNA udvinding Kit dataark (sektion for tørrede blod steder)
-
Forberedelse af prøver
- Bruge 3 tørrede blod pletter fra kortet. Skær hver af de tørrede blod pletter fra kortet og adskille dem fra kortet med pincet. Skær adskilt tørrede blod steder i små stykker (diameter ca. 1 mm).
- Placer de små stykker i en 1,5 mL-centrifugerør.
-
Prøven fordøjelsen
- Tilføj 180 µL af lysisbuffer 1 findes i kit (Table of Materials) til røret. Tilføj 20 µL af Proteinase K. Bland ikke lysisbuffer 1 med Proteinase k før pipettering ind i 1,5 mL rør med blod spottet kort. Mix af vortexing.
- Glasset anbringes i et thermoincubator og inkuberes ved 56 ° C i 60 min. Hvis thermoincubator ikke er udstyret med en shaker, vortex stikprøven hver 10 – 15 min til mindst 10 s, pas på ikke for at lade temperaturen i prøven falde. Kort centrifugeres rør for at fjerne dråber fra låget.
-
Vaske trin
- Tilføje 200 µL af lysisbuffer 2 (Table of Materials) og vortex for 10 s.
- Sted rør i en thermomixer eller opvarmet orbital inkubator og inkuberes ved 70 ° C i 10 min. Hvis thermoincubator ikke er udstyret med en shaker, vortex prøver en gang til mindst 10 s, pas på ikke for at lade temperaturen af prøverne falde.
- Gentag trin 2.3.1. Overføre de 400 µL af lysate fra 1,5 mL tube til eluering kolonne (Tabel af materialer). Der centrifugeres kolonnen ved 6.000 x g i 1 min.
- Placer kolonnen eluering ind i et nyt 2 mL indsamling rør og kassere gamle.
- Tilføje 500 µL af wash buffer 1 (Tabel af materialer) og centrifugeres ved 6.000 x g i 1 min.
- Placere kolonnen i et nyt 2 mL indsamling rør og kassere gamle.
- Tilføje 500 µL af vaskebuffer 2 (Table of Materials) og centrifugeres ved 6.000 x g i 1 min.
- Placere kolonnen i et nyt 2 mL indsamling rør og kassere gamle.
- Der centrifugeres ved 20.000 x g i 3 min tørre membranen.
-
Eluering trin
- Placer kolonnen i en ny 1,5 mL-centrifugerør og kassér collection tube.
- Sted 50 µL destilleret vand på midten af membranen. Der inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur.
- Centrifugeres tube på 20.000 x g i 1 min. indsamle eluatet og placere det igen på midten af membranen.
- Centrifuge tube på 20.000 x g i 1 min. kassere membranen.
- Måle DNA koncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer.
- Store DNA ved-20 ° C indtil brug.
Bemærk: DNA ekstraheret fra DBS kan bruges til at udføre flere analyser som SNP evaluering af Real Time PCR eller DNA Sanger sekventering.
3. serum lagerplads til DSS
-
Blod prøve indsamling
- Indsamle 7 mL af perifert blodprøven i et 7 mL rør uden EDTA. Forlade blodprøve at koagulere i 30 min. ved stuetemperatur.
- Skrive patient kodenummeret på det nederste højre hjørne af kortet saver.
- Der centrifugeres blodprøve på 980 x g i 15 min. ved stuetemperatur.
Bemærk: Butikken serum som DSS hurtigst muligt og inden for 8 h. - Forsigtigt fjerne supernatanten fra røret og overføre det til en ny 15 mL tube. Omhyggeligt resuspend blod med 5 mL pipette.
-
Serum pletblødning i DSS
- Der afpipetteres og overføre ét sted i serum (50 µL) på kortet saver. Gentag dette trin for at få alt af 3 – 5 blod pletter.
Bemærk: Vær forsigtig til afpipetteres præcis 50 µL serum i hver plet. Serum bør ikke gå ud fra den stiplede linje på kortet. - Forlade DSS til tørre natten over ved stuetemperatur. Åbner forsiden af kortet saver at lette blod tørring.
- Gemme kort ved stuetemperatur i en plastik pose med tørremiddel indtil brug. Hvis lageret er længere end 14 dage, gemme kort ved-20 ° C.
- Der afpipetteres og overføre ét sted i serum (50 µL) på kortet saver. Gentag dette trin for at få alt af 3 – 5 blod pletter.
4. ELISA Assay startende fra DSS
-
Elueres protein fra DSS.
- Hvis det er nødvendigt, tø en DSS for hver prøve. Skær DSS i små stykker (ca. 1 mm i diameter). Sætte brikkerne til en 1,5 mL tube med 400 µL af PBS.
- Ryst prøverne natten over ved 4 ° C.
Bemærk: Ryste dem ved lav intensitet. PBS bør ikke våd forsiden af røret under omrystning.
- Bruge protein eluatet som en serumprøven udskilles protein/vækst faktor analyse efter ELISA kit instruktioner, efter passende fortyndinger.
Bemærk: Denne procedure fungerer godt for DBP påvisning9. For andre ELISA assays, kan en optimering trin være påkrævet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi tog fordel af DBS og DSS at opbevare blod og serum ved stuetemperatur uden at påvirke kvaliteten af det biologiske materiale. Figur 1 viser et eksempel på protein card saver uden blod og efter indsamling. For at bekræfte, at opbevaring på filtrerpapir, og proceduren at eluere blod ikke interfererer med prøven kvalitet, udført vi en sammenligning med standard opbevaring metoder. Vi ekstraherede DNA fra 3 matchede prøver af blod indsamlet i et 2 mL tube eller gemt som DBS, som rapporteret i afsnittet protokol. Fem SNPs blev analyseret af realtid PCR. Oplysninger indhentet for matchede prøver var 100% overensstemmende.
Med hensyn til ELISA analyser, vi gemt 8 prøver af serum, der opsamlet i et 2 mL tube (og lagret straks ved-80 ° C) og som DSS (opbevares ved stuetemperatur i en uge og derefter ved-20 ° C). Vi elueret proteiner fra DSS, som beskrevet i afsnittet protokol, og derefter udføres ELISA ifølge producentens datablad for DBP 8 prøverne. Resultaterne er vist i tabel 1. Variationskoefficienten (CV) mellem matchede prøver varierede fra 2% til 24%. Den gennemsnitlige CV var 9,6%.
Figur 1: eksempel på DBS før og efter samlingen blod. (A) Protein saver kort. (B) Protein saver kort efter udtagning af blodprøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| DBP (µg/mL) | |||
| Prøver | Serum (st) | DSS | CV % |
| 1 | 66.47 | 65.28 | 2 |
| 2 | 213.31 | 216.51 | 1 |
| 3 | 164.96 | 145.21 | 14 |
| 5 | 109.81 | 120.28 | 9 |
| 6 | 162.70 | 130.60 | 24 |
| 7 | 124.63 | 117.13 | 6 |
| 8 | 149.47 | 132.69 | 12 |
Tabel 1: DPB niveauer i matchede DSS og serumprøver. DBP niveauer analyseret af ELISA assay. CV er variationskoefficienten beregnes mellem de 2 opnåede værdier. CV-procenten beregnes som følger: ((DSS value-Serum value)/DSS værdi) x 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol undersøger mulighederne for at opbevare blod og serum på filtrerpapir, når labs ikke har personale eller infrastruktur behov for korrekt håndtering af blodprøver. Især fuldblod eller serumprøver indsamlet i standard rør eller af finger-prik kan lagres ved hjælp af denne metode, og der er ingen grund til at fryse prøver på-20 ° C eller-80 ° C umiddelbart efter samlingen blod. DBS/DSS kan forblive ved stuetemperatur i op til 14 dage uden ændring i blod/serum integritet. Et kritisk spørgsmål til opbevaring er tilstedeværelsen af fugt, som påvirker egenskaberne af biologisk materiale mere end temperatur. Dette problem kan undgås ved hjælp af plastikposer med tørremiddel. Fugt bliver et problem under opbevaring når kort er inde i plastikposer. Problemer som følge af partikler i dråber-luft-støv eller fugt blev ikke overholdt i natten inkubation10. Vi har tidligere brugt filtrerpapir for at opbevare blod og serum i en undersøgelse af biologiske markører i italiensk og afrikanske kohorter11. Vi optimeret DNA-ekstraktion fra DBS og analyseret et antal SNPs i begge tilfælde serie. Vi var også interesseret i at evaluere protein niveauer, optimeret vi en metode til at eluere proteiner fra DSS for at udføre ELISA assays. Serum opbevaring i DSS for ELISA er mere sarte end fuldblod opbevaring for kvalitative analyser, fordi laboratorium forskere skal være sikker på at afpipetteres nøjagtig den samme mængde af serum i alle prøver. Hvis pipettering ikke er præcist, vil downstream analyser være kompromitteret. Mens DNA udtræk procedure kan anvendes til andre molekylære analyser, bør proceduren protein optimeres i matchede prøver for hver ny cytokin/udskilles faktor undersøgt. Det er vigtigt at skære DSS i meget små stykker og våd stykker af kortet grundigt med PBS i natten inkubation at sikre effektiv protein eluering. Dette er en mere delikat trin end blod eluering fordi ELISA er en kvantitativ evaluering.
I de seneste år, har denne opbevaring tilgang været meget anvendt til forskellige applikationer spænder (som beskrevet i denne protokol) fra Molekylærbiologi til protein analyse12,13. Især rapporteret god kvalitet masse resultaterne fra serum spottet i saver kort har været14, bekræfter den høje fleksibilitet og pålidelighed af metoden.
Vores resultater, efter aftale med litteraturen, fremhæve nytten af lagring prøver som DBS og bekræfte pålideligheden af denne procedure med hensyn til opbevaring af standard metoder. Vi bekræftede tidligere resultater og understregede mulighed for at optimere en ELISA assay ved at bruge det sammen med vores opbevaring metoder. Takket være dets enkelhed, kan udviklingslandene også bidrage til kræftforskning. For eksempel, som fleste undersøgelser af afrikanere er udført på afroamerikanere, er meget få data tilgængelige på indfødte afrikanere9. Brugen af DBS kunne bidrage til at slå bro over denne kløft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Gráinne Tierney for redaktionelle bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
References
- Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
- Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
- Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
- Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
- Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172 (2017).
- Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
- Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
- Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
- Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
- Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
- Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
- St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710 (2013).
- Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).
