Summary
Denne protokollen beskriver den kirurgiske labyrinthectomy av rotte, som er en nyttig metode for å studere vestibulærsystemet.
Abstract
For å studere vestibulærsystemet eller vestibular kompensasjonsprosessen, har en rekke metoder blitt utviklet for å skade vestibular, inkludert kirurgiske eller kjemiske labyrinthectomy og vestibular neurectomy. Kirurgisk labyrinthectomy er en relativt enkel, pålitelig og rask metode. Her beskriver vi den kirurgiske teknikken for rotten labyrinthectomy. Et postauricular snitt er gjort under narkose å avsløre den ytre auditiv kanalen, og trommehinnen, hvoretter trommehinnen og ossicles fjernes uten stigbøylen. Stigbøylen arterien, som ligger mellom stigbøylen og det ovale vinduet, er en sårbar struktur og må bevares for å få et klart kirurgisk felt. Hull til fenestrate vestibylen er laget med en 2.1 mm drill bur overlegen stigbøylen. Deretter er 100% etanol injisert gjennom dette hullet og pustende flere ganger. Grundig disseksjon under et mikroskop og nøye blødning kontroll er avgjørende for å få pålitelige resultater. Symptomer av vestibular tap, som nystagmus, hodet vippe og en bølgende bevegelse, blir sett umiddelbart etter operasjonen. Rotarod eller rotasjonen chair testen kan brukes å objektivt og kvantitativt evaluere funksjonen vestibulærsystemet.
Introduction
Vestibular orgelet er avgjørende for balanse og øye. En normal vestibular funksjon, avhenger av symmetrisk afferente signaler fra vestibulærsystemet organene i to indre ører. Vestibular hypofunction eller tap induserer svimmelhet, nystagmus og postural ubalanse. Etter akutt skade gjenoppretter funksjonen vestibular spontant i flere dager, en prosess som kalles vestibular kompensasjon1,2. Vestibular kompensasjon av statisk underskudd er en prosess av frisk knyttet til ubalanse spontan hvile aktivitet mellom ipsilateral og kontralateral vestibular kjerner. Vestibular kompensasjon av dynamisk underskudd oppnås hovedsakelig via sensorisk og atferdsmessige erstatninger (med visuelle eller somatosensory innganger)3. Disse prosessene er attraktive for neuronal plastisitet studier4,5.
En rekke metoder har blitt utviklet for å studere vestibulærsystemet og mekanismene som underbygger neuronal plastisitet under vestibular kompensasjon, som kirurgiske og kjemiske labyrinthectomy og vestibular neurectomy5,6 ,7,8. Vestibular neurectomy er en bestemt måte å indusere fullstendig vestibular tap, men det er en vanskeligere og invasiv prosedyre og kan indusere hjerneskade8,9. Denne metoden krever større kirurgiske ferdigheter og tar mer tid enn labyrinthectomy. Kjemiske labyrinthectomy inkludert gentamycin, arsanilate og tetracaine, er enklere og kan gi pålitelige resultater10,11,12. Men sneglehuset kan også være skadet og vestibular tap kan utvikle seg over tid11. I tillegg er effekter av kjemikalier på hjernen, som bør bevares for nøyaktig vurdering, uklart. Kirurgisk labyrinthectomy ble først introdusert i dyrestudier i 184215 og ble først rapportert i rotte i 193616. Denne teknikken har blitt brukt i mange dyr studier5,17,18,19. Kirurgisk labyrinthectomy er en spesifikk, pålitelige og relativt enkle. 13 , 14 videre symptomene på vestibular skade sett umiddelbart etter operasjonen. Her beskriver vi våre kirurgisk teknikk for rotten labyrinthectomy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført i henhold til institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Seoul National University Hospital (14-0148-C1A1), som er akkreditert av foreningen for vurdering og akkreditering av laboratoriet Animal Care International.
Merk: Forsøkene ble utført på Sprague-Dawley (SD) hannrotter 7-8 uker gamle (200/250 g). Hvert dyr ble akklimatisert laboratorium vilkårene for 1 uke før starten av eksperimentet. Dyrene ble plassert i temperatur og luftfuktighet-kontrollerte rom med en konstant 12-h:12-h lys: mørke syklus med gratis tilgang til mat og vann.
1. Labyrinthectomy
- Dekk autoklaveres Kirurgiske instrumenter med en bakteriefri pute. Desinfiser driftsområdet med 70% etanol. Bruk en steril drapere og opprettholde sterile forhold under operasjonen.
- Bære en kjole, maske (til dekker nese og munn), cap (for å dekke hodet), og en par av sterile hansken. De kirurgiske instrumentene må bare komme i kontakt med sterilt overflater.
- Sett inn tiletamine-zolazepam bedøvelse (40 mg/kg kroppsvekt) intramuskulært i mediale låret eller intraperitoneally, og xylazine (10 mg/kg kroppsvekt) intramuskulært eller intraperitoneally.
Merk: Andre moduser for narkose, inkludert isoflurane innånding, kan også brukes. - Plass rotta på en oppvarming pad (opprinnelig satt på 42 ° C). Smøremiddel øye ointment gjelde begge øynene til rotta å hindre øye tørrhet under anestesi.
- Sett rotta på høyre side. Barbere pelsen i kirurgiske området med hårklippere. Desinfiser området med 70% etanol.
- Injisere 1% lidokain hydroklorid subcutaneously i venstre retroauricular området.
- Bruke en skalpell blad #15, lage en ~5.0 cm retroauricular snitt. Skille muskel og fascia å avsløre den ytre auditiv kanalen med Iris saks (figur 1A). Litt åpne ekstern auditiv kanalen bladet #15 eller i Iris saks (figur 1B). Mye utsette trommehinnen (figur 2A).
- Under et mikroskop (7.5 X eller 12,5 X), fjerne trommehinnen og ossicles unntatt stigbøylen, ved hjelp av pinsett. Løsne musklene på lambdoidal ryggen med bladet #15 eller i Iris saks (figur 2B).
- Bruke en drill ved lav hastighet (< 3000 rpm) med en diamant bur (2.1 eller 1,4 mm), bore tympanic bulla benet rundt punktet av utgangen av ansikts nerve (figur 3A). Identifisere arteria stapedial. Ta vare ikke for å skade arteria stapedial under bore prosessen.
- Fortsette boring vestibylen overlegen arteria stapedial og avsløre vinduet runde og benete lateral halvsirkelformet kanalen. Åpne lateral halvsirkelformet kanalen i sin ampulla. Fortsette boring i flyet av lateral halvsirkelformet kanalen og bore ampulla av overlegen halvsirkelformet kanalen.
- Sug opp innholdet i vestibylen bruker en 18-G eller 22-G nål. Injisere og Sug opp 1 cm3 av 100% etanol 3 x.
- Lukk musklene og huden i to lag med enkel avbrutt suturer.
- Ikke la et dyr uovervåket før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency. Holde rotta varme til det wakens bruker en oppvarming pad eller en varmelampe. Etter oppvåkning, flytte rotta til en individuell bur i et rom med vanlige miljøforholdene.
- Administrere antibiotika (f.eksCefazoline 20 mg/kg, trimethoprim-sulfonamide 100 µL subcutaneously, eller penicillin 300.000 IU) etter behov på dag 1; en analgesic (ikke en opioid; f.eksMetacam 2 mg/kg, Carprofen 5 mg/kg subcutaneously) kan også gis.
2. humbug kirurgi
- Humbug kirurgi som en kontroll, utføre de samme kirurgiske og post-kirurgiske prosedyrene (som angitt i del 1), inkludert eksponering av ytre auditiv kanalen, og trommehinnen (trinn 1.7), fjerning av trommehinnen og ossicles, og avdeling av musklene på lambdoidal ridge (trinn 1.8), men ikke åpne halvsirkelformet kanalen eller injisere etanol.
3. Sjekk tap av Vestibular funksjon
Merk: Tap av vestibular funksjonen kan evalueres bruker enten atferdsmessige eller vestibular funksjon tester. 13 , 17 , 18 atferdsmessige tester inkluderer evalueringen av postural asymmetri og nystagmus.
- Identifisere postural asymmetri som inkluderer spontan eller vakte fat-rulle, fallende til venstre, eller flytte rundt mens lener mot lesioned siden18. Se Video 1.
- Identifisere nystagmus ved en visuell inspeksjon av frivillig øyebevegelser. Når spontan nystagmus mangler i hvile tilstand, blåse luft forsiktig over hodet av dyr18. Se Video 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Suksessen til operasjonen ble validert av atferdsmessige tester. Alle dyr utstilt vanlig av ensidig tap av vestibular funksjon. Spontan fat-rulle var tydelig umiddelbart etter kirurgi, fremkalt av en luft puff over hodet eller en lett berøring til kroppen i tidlig restitusjonsfasen (Video 1). 3 d etter operasjonen, dyrene flyttet rundt lener seg mot den lesioned siden med sporadiske faller til venstre. Spontan nystagmus ble observert i 2 d (Video 2). Vakte nystagmus ble observert i 3D.
Kirurgi vanligvis nødvendig < 30 min. I løpet av 50 operasjoner døde 2 rotter under operasjonen og 3 i 1 d av operasjonen. Samlet var tap rate 10% (5 dødsfall under/etter 50 operasjoner). Alle dødsfall ble forårsaket av en skade arteria stapedial. Vi bemerket ingen forsinket død og ingen infeksjon innen 1 uke. I flere dager etter operasjonen, kan rotter vise en dårlig muntlig inntak og vekt forlis.
Figur 1: post auricular snitt i det venstre øret. (A) A postauricular snitt ble gjort og ansikts nerve (↑) ble identifisert mellom temporalis muskelen (*) og sternomastoid muskelen (†). (B) deretter, ekstern auditiv kanalen (↑) åpnet litt og brusken i det ytre øret ble skilt fra pyramideformet benet. Skala bar 2 mm gjelder alle paneler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksponering av benete veggen av vestibylen. (A) etter åpning ekstern auditiv kanalen bredt, malleus (*) ble sett under trommehinnen. (B) etter fjerning av trommehinnen og ossicles (med unntak av stigbøylen), odden cochlea (*) ble identifisert og musklene på lambdoidal ridge opphøyet (†). Skala bar 2 mm gjelder alle paneler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Vestibular fenestration. (A) etter fjerning av bakre laterale veggen av trommehinnen hulrommet, benet rundt punktet av utgangen av ansikts nerve ble boret. Arteria stapedial (↑) og runde vinduet (Δ) over odden cochlea (*) ble utsatt. (B) etter boring ut lateral vestibylen, ampulla av halvsirkelformede kanaler var synlig i vestibulærsystemet levningen (↑), som var dårligere plasseringen av odden cochlea (*). Skala bar 2 mm gjelder alle paneler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1. Spontan fat ruller. SD rotta som gjennomgikk labyrinthectomy 2 d tidligere viste spontan fat ruller. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 2. Spontan nystagmus. SD rotta som gjennomgikk labyrinthectomy 2 d tidligere viste spontan nystagmus. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne teknikken er en nyttig metode for oppretting av plutselige, permanent og fullstendige vestibular funksjonen tap. Dette kan brukes til å studere vestibular patologi, som vestibular nevritt, en akustisk svulst og Meniere's sykdom. Mange studier har brukt denne teknikken for å studere neuronal plastisitet av vestibular kjerner eller relaterte sentrale prosess5,17,18,19.
The Most kritiske for vellykket operasjon er 1) bevaring av arteria stapedial, 2) en forsiktig boring på nøyaktig posisjon og 3) grundig blødning kontroll. En stor postauricular snitt kan forårsake en stor ekstern sår, som forstyrrer beinet bevegelse på behandlet siden. Men et lite innsnitt begrenser kirurgiske feltet og forårsaker operasjonen tar lenger tid. En skikkelig retraction er avgjørende for å opprettholde et tilstrekkelig kirurgisk visning13. Etter postauricular snitt, kan ansikts nerve bli identifisert ovenfor bulla og mellom til digastricus og sternocleidomastoid-muskelen, kjører fremre inferiorly i ansiktet. Arteria retroauricular og større auricular nerve kjører i motsatt retning. Skade ansikts nerve forårsaker ansikts lammelse etter inngrepet. For å oppnå en bredere kirurgisk visning og unngå en stigbøylen arterien skade, foretrekker vi å fjerne overlegen ytre auditiv kanalen veggen og deretter tilnærming overlegen til stigbøylen arterien17,19. Denne tilnærmingen er forbundet med en større risiko for infeksjon sammenlignet ventrolateral tilnærming, som ikke har åpningen av ytre auditiv kanalen veggen eller fjerning av trommehinnen (som eksponerer mellomøret til eksterne miljø). I vår erfaring, de langsiktige sekvele (generell dyr ytelsen, sine fôring og drikking vaner, gjenopptakelse av vektøkning og statusen infeksjon) ikke avviker spesielt mellom dyr utsatt til transtympanic tilnærming beskrevet her og den ventrolateral tilnærming17,20. Åpne bulla kan skade vedlagte muskel- og noen ganger resultere i noe blødning. I rotte krysser arteria stigbøylen nær stedet for vestibular fenestration. Hos mennesker, men forsvinner stigbøylen arterien under embryogenesis. Når feltet kirurgisk er smal, det er ikke lett å kontrollere blødningen og feltet kan raskt fylles med blod. For å unngå dette, koagulere noen forfattere arteria stigbøylen før hullet. Selv om dens rolle ikke er klart, foretrekker noen forfattere ikke å koagulere stigbøylen arterien14 fordi det leverer det indre øret, sentrale nerve systemet (geniculate ganglion, mediale lemniscus og trapes kroppen) og ansikts nerve i rotte14 ,21. Hvis blødning oppstår, vi komprimere arteria med en liten bomullspinne og deretter bruke elektrisk koagulering med nok sugekraft.
Et lite burr er nyttig for å lage et hull i vestibylen. En liten krok eller p kan brukes i stedet for en burr. En mekanisk boreanlegget resulterer i mindre fenestration traumer og bidrar til å oppnå konsistente resultater. Uten etanol vanning observerte vi variabel atferdsdata svar etter labyrinthectomy13,17. Etanol vanning og sug sikre at labyrinten er terminalt skadet. 13 sløv elektrisk koagulering av vestibular nerve kan utføres via dette hullet22. Riktig forstørrelse er viktig, og et mikroskop er obligatorisk i de fleste tilfeller.
Midten og indre øret er også skadet under labyrinthectomy, som resulterer i døvhet. Det er ingen måte å bevare det indre øret trygt. Kjemiske labyrinthectomy kan bevare dyrets hørsel, men gir variable resultater8. Vestibular neurectomy kan også skade cochlear nerve8. For å utføre humbug operasjonen i kontrollgruppen, fjernet vi trommehinnen og ossicles uten stigbøylen, som resulterte i mild conductive hørselstap uten noen vestibular skade13.
Flere opptreden og vestibular tester kan brukes til å bekrefte at labyrinthectomy har blitt utført13,14. Umiddelbart etter inngrepet, kan skew variasjonen på øyet observeres. Etter utvinning av bedøvelsen, kan spontan nystagmus, bølgende bevegelse og hodet vippe sees. Rotasjon av halen henger er den mest pålitelige test17,20. Disse underskudd gjenopprette sakte i flere dager17,20. Spontan nystagmus med hurtig bevegelse til kontralateral siden forsvinner innen 3-4 d etter inngrepet. Hodet vippe forblir i flere måneder. Vestibular funksjon tester, for eksempel en rotasjon stol test eller en rotarod test, kan gi mer objektive og kvantitative data23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av et stipend fra Korea helse teknologi R & D prosjektet gjennom den Korea helse industri Development Institute (KHIDI), finansiert av helse og velferd, Sør-Korea (gi nummer: HI15C2651).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ASPIRATOR KB-012 | KOH BONG & CO., LTD. | KB-012 | Medical aspirator |
| Blade: #15 | Fine Science Tools | #10015-00 | Blades for #7 Scalpel Handles, #15 |
| Carbon Steel Burrs | Fine Science Tools | #19007-05 | shaft diameter: 2.3 mm, length: 44 mm, package of 10 burrs |
| Carl Zeiss Surgical GmbH | Carl Zeiss | #6627100863 | Surgical microscope |
| Dumont #3c | Fine Science Tools | #11231-20 | Standard tip 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Dumont #5SF | Fine Science Tools | #11252-00 | |
| Dumont #7B | Fine Science Tools | #11270-20 | Serrated 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Extra Fine Bonn: straight | Fine Science Tools | #14084-08 | Iris scissors, best suited for microdissection under high magnification |
| Fine Iris Scissors: straight | Fine Science Tools | #14094-11 | Made from martensitic stainless steel, combined with molybdenum and vanadium |
| Finger Loop Ear Punch | Fine Science Tools | #24212-01 | 1 mm. Provides stability and control for researchers using the numbering system |
| Hartman | Fine Science Tools | #13002-10 | Tip width: 1 cm, serrated, 10 cm |
| Short Scalpel Handle #7 Solid | Fine Science Tools | #10003-12 | #7 short, 12 cm |
| Small Vessel Cauterizer | Fine Science Tools | #18000-03 | Replacement tip, straight knife, keeps bleeding to a minimum and therefore provides a surgical field clear of clamps and hemostats |
| Strong 207S | SAESHIN | 207S | Powerful torque at low speed, available with speed or on/off foot controller |
| Suction Tubes | JEUNGDO B&P CO., LTD. | H-1927-8 | Frazier, 18 cm |
| VICRYL | ETHICON | W9570T | Synthetic absorbable sterile surgical suture |
| Weitlaner-Locktite | Fine Science Tools | #17012-13 | Maximum spread: 4.5 cm, 2 x 3 blunt teeth, 11 cm |
| Zoletil | Virbac, France | Tiletamine-zolazepam | |
| Rompun | Bayer | Xylazine | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Septra | Pfizer | Trimethoprim-sulfonamide |
References
- Curthoys, I. S., Halmagyi, G. M. Vestibular compensation: a review of the oculomotor, neural, and clinical consequences of unilateral vestibular loss. Journal of Vestibular Research. 5 (2), 67-107 (1995).
- Smith, P. F., Curthoys, I. S. Mechanisms of recovery following unilateral labyrinthectomy: a review. Brain Research. Brain Research Reviews. 14 (2), 155-180 (1989).
- Lacour, M., Helmchen, C., Vidal, P. P. Vestibular compensation: the neuro-otologist's best friend. Journal of Neurology. 263, Suppl 1. S54-S64 (2016).
- Darlington, C. L., Smith, P. F. Molecular mechanisms of recovery from vestibular damage in mammals: recent advances. Progress in Neurobiology. 62 (3), 313-325 (2000).
- Shinder, M. E., Ramanathan, M., Kaufman, G. D. Asymmetric gene expression in the brain during acute compensation to unilateral vestibular labyrinthectomy in the Mongolian gerbil. Journal of Vestibular Research. 16 (4-5), 147-169 (2006).
- Dutheil, S., Brezun, J. M., Leonard, J., Lacour, M., Tighilet, B. Neurogenesis and astrogenesis contribution to recovery of vestibular functions in the adult cat following unilateral vestibular neurectomy: cellular and behavioral evidence. Neuroscience. 164 (4), 1444-1456 (2009).
- Gunther, L., et al. N-acetyl-L-leucine accelerates vestibular compensation after unilateral labyrinthectomy by action in the cerebellum and thalamus. PLoS One. 10 (3), e0122015 (2015).
- Pericat, D., Farina, A., Agavnian-Couquiaud, E., Chabbert, C., Tighilet, B. Complete and irreversible unilateral vestibular loss: a novel rat model of vestibular pathology. Journal of Neuroscience Methods. 283, 83-91 (2017).
- Cass, S. P., Goshgarian, H. G. Vestibular compensation after labyrinthectomy and vestibular neurectomy in cats. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 104 (1), 14-19 (1991).
- Vignaux, G., et al. Evaluation of the chemical model of vestibular lesions induced by arsanilate in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 258 (1), 61-71 (2012).
- Berryhill, W. E., Graham, M. D. Chemical and physical labyrinthectomy for Meniere's disease. Otolaryngologic Clinics of North America. 35 (3), 675-682 (2002).
- Morgenstern, C., Mori, N., Arnold, W. Experimental studies on the effect of labyrinth anesthesia. Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 237 (3), 255-261 (1983).
- Nadasy, G. L., Raffai, G., Feher, E., Schaming, G., Monos, E. A simple standard technique for labyrinthectomy in the rat: a methodical communication with a detailed description of the surgical process. Physiology International. 103 (3), 354-360 (2016).
- Hitier, M., Besnard, S., Vignaux, G., Denise, P., Moreau, S. The ventrolateral surgical approach to labyrinthectomy in rats: anatomical description and clinical consequences. Surgical and Radiologic Anatomy. 32 (9), 835-842 (2010).
- Flourens, M. J. Recherches experimentales sur les propriétés et les fonctions du système nerveux dans les animaux vertébrés. , Crevot. Paris. (1824).
- T'Ang, Y., Wu, C. F. The effects of unilateral labyrinthectomy in the albino rat. Chinese Journal of Physiology. 10, 571-598 (1936).
- Chang, M. Y., et al. MicroRNAs 218a-5p, 219a-5p, and 221-3p regulate vestibular compensation. Scientific Reports. 7 (1), 8701 (2017).
- Bergquist, F., Ludwig, M., Dutia, M. B. Role of the commissural inhibitory system in vestibular compensation in the rat. The Journal of Physiology. 586 (18), 4441-4452 (2008).
- Cameron, S. A., Dutia, M. B. Cellular basis of vestibular compensation: changes in intrinsic excitability of MVN neurones. NeuroReport. 8 (11), 2595-2599 (1997).
- Park, M. K., Lee, B. D., Lee, J. D., Jung, H. H., Chae, S. W. Gene profiles during vestibular compensation in rats after unilateral labyrinthectomy. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 121 (11), 761-769 (2012).
- Yamamoto, H., Tominaga, M., Sone, M., Nakashima, T. Contribution of stapedial artery to blood flow in the cochlea and its surrounding bone. Hearing Research. 186 (1-2), 69-74 (2003).
- Potegal, M., Abraham, L., Gilman, S., Copack, P. Technique for vestibular neurotomy in the rat. Physiology & Behavior. 14 (2), 217-221 (1975).
- Tung, V. W., Burton, T. J., Dababneh, E., Quail, S. L., Camp, A. J. Behavioral assessment of the aging mouse vestibular system. Journal of Visualized Experiments. (89), e51605 (2014).
- de Jeu, M., De Zeeuw, C. I.
