Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الكهربية كل خلية من خلايا Enterochromaffin موريني مثقف الأولية

Published: September 26, 2018 doi: 10.3791/58112
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1, 1
1Enteric Neuroscience Program, Division of Gastroenterology & Hepatology,Department of Physiology & Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Gastroenterology, Department of Medicine, University of Massachusetts Medical School
* These authors contributed equally

Summary

خلايا Enterochromaffin (EC) تضم مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا الظهارية المعدية المعوية. خلايا الجماعة الأوروبية منفعل كهربائياً وإطلاق السيروتونين، بعد صعوبات في استزراع وتحديد خلايا الجماعة الأوروبية محدودة الدراسات الفسيولوجية. الطريقة المعروضة هنا تؤسس نموذج ثقافة الأولية قابلة للفحص لخلايا الجماعة الأوروبية الكهربية.

Abstract

وتشكل خلايا Enterochromaffin (الجماعة الأوروبية) في الظهارة (غي) الجهاز الهضمي يتدنى أكبر من الخلايا انتيروندوكريني. كخلايا حسية متخصصة، بمعنى المحفزات لومينال خلايا الجماعة الأوروبية وتحويلها إلى أحداث إطلاق السيروتونين (5-هيروكسيتريبتاميني، 5-HT). ومع ذلك، هو غير مفهومة الكهربية لهذه الخلايا لأنها صعبة للثقافة وتحديد. الطريقة التي عرضت في هذه الورقة الخطوط العريضة الأولية EC خلية الثقافات الأمثل للكهربية خلية مفردة. هذا البروتوكول يستخدم مراسل المعدلة وراثيا بروتين فلوري سماوي (CFP) لتحديد خلايا الجماعة الأوروبية الماوس في الثقافات الابتدائية المختلطة، النهوض بالنهج المتبع للحصول على تسجيلات عالية الجودة الكهربية الخلية كلها في أوضاع المشبك الجهد والحالية.

Introduction

الظهارة (غي) الجهاز الهضمي مجتمع متنوع يتكون من عدة أنواع من الخلايا. الخلايا انتيروندوكريني تضم حوالي 1% من جميع الخلايا الظهارية، وخلايا enterochromaffin (المفوضية الأوروبية) هي أكبر انتيروندوكريني خلية السكان1. وتظهر الدراسات الأخيرة أن انتيروندوكريني2 و3،EC4 خلايا منفعل كهربائياً. ونحن مهتمون بفهم الجماعة الأوروبية الرئيسية الخلية الكهربية. وهكذا، كان الغرض من هذه الدراسة إنشاء الأساسي الثقافات الخلية EC الأمثل للكهربية الخلية كلها.

خلية الجماعة الأوروبية القائمة عادة ما يتم إنشاء الأسطر التي تنتج وتفرز 5-HT (مثلاً، قجب-15، بون6، كرج-17) وقد استخدمت لدراسة الكهربية5،8 من خلد الورمية الأنسجة. أن المعلومات المكتسبة من هذه الخطوط الخلية القيمة5،8، فالدراسات الكهربية الخلية الأولية ضرورية لفهم فيزيولوجيا الخلية المفوضية الأوروبية بشكل صحيح. يتطلب الكهربية لخلايا الجماعة الأوروبية أولية بالعزلة وثقافة واحدة من الخلايا الظهارية، الذي كان محدودا باستمرارية انخفاض الثقافات الظهارية.

يعتمد الأسلوب الثقافة المقدمة في هذه الدراسة على الفئران المحورة وراثيا مع خلايا الجماعة الأوروبية المسماة فلوريسسينتلي، مثل Tph1-الحراجية المعتمدة9، المستخدمة في هذه الدراسة. الأسلوب الذي يحسن ابتدائية مختلطة الثقافات الظهارية وضعت سابقا2،10 لخلية مفردة الكهربية3. استخدام تركيبات التربسين/يدتا بالإضافة إلى A كولاجيناز أو يدتا و DTT الهضم الأنزيمي الأساليب السابقة ويستخدم كثافة التدرجات إلى عزل على وجه التحديد والثقافة خنزير غينيا11 والفئران خلايا الجماعة الأوروبية12. في الآونة الأخيرة، كانت ولدت أورجانويدس المعوية وعطلت ميكانيكيا للتسجيلات الكهربية4. الثقافات باستخدام هذه الأساليب مناسبة تماما السيروتونين الإفراج عن التجارب، وتحليل RT-قبكر، وأنه، في حين أنها يمكن أن تستخدم للكهربية، تعتمد على نجاح الجيل أورجانويد مضيعة للوقت، وكثافة التدرجات تحديد خلايا الجماعة الأوروبية، الآثار المدمرة التي تخلفها الخلوية التربسين ويدتا. على النقيض من ذلك، البروتوكول الموصوفة هنا يحسن العلاج الأنزيمي والميكانيكية، ويحسن ظروف تثقيف، ويبسط إجراءات لإنتاج خلايا الجماعة الأوروبية واحد وصحية مناسبة للمعايير الخلوية العالية اللازمة للكهربية.

سوف تكون هذه الطريقة مفيدة للعلماء الذين يريدون العمل في خلايا الجماعة الأوروبية الأولية في الثقافات المختلطة بدلاً من الثقافات مخلدة وتريد التحقيق الكهربية للخلايا المفردة. ومع ذلك، قد يكون أقل ملاءمة لدراسة السكان الخلية التي تحتاج الثقافات الفرز أو طويلة الأجل تتطلب بقاء ح 72 الماضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) لينك. الجزء ثقافة الخلية الأولية من هذا البروتوكول يستند إلى أساليب نشرها مسبقاً التي يمكن الرجوع إليها لمزيد من التفاصيل10. يجب أن يوافق جميع الإجراءات التجريبية (إياكوك)، وجميع التجارب التي يجب أن يتم وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة والأنظمة.

1-إعداد الثقافة

  1. وسائل الإعلام.
    1. تعد المفوضية الأوروبية خلية كاملة ثقافة وسائل الإعلام مع ارتفاع الجلوكوز تستكمل تعديل النسر المتوسطة (دميم [4500 مغ/لتر [دولبيكو ل) مع 5% مصل بقرى الجنين (FBS)، 1% لالجلوتامين و 1% البنسلين-ستربتوميسين (الجدول 1).
      ملاحظة: يمكن تخزين الوسائط عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
    2. تصفية خلية الجماعة الأوروبية وسائل الإعلام ثقافة كاملة ووضع 25 مل من وسائل الإعلام في أنبوب 50 مل عند 37 درجة مئوية.
    3. تحضير الوسائط الهضم مع ارتفاع الجلوكوز [4,500 مغ/لتر [دميم وتستكمل مع 0.1% ألبومين المصل البقري (BSA) (الجدول 1).
    4. تصفية وسائل الإعلام الهضم ووضع أربعة مختبرين 10 مل من وسائل الإعلام في أنابيب منفصلة 50 مل واحتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الوسائط عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  2. إنزيم.
    1. تزن 4 ملغ (صائم) أو 24 ملغم (للقولون) الحادي عشر كولاجيناز [إيه إيت زيرو زيرو وحدات/مغ] في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
      ملاحظة: كولاجيناز مستقرا عند-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
    2. ريسوسبيند كولاجيناز الكوة في 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة الجليد مع Ca2 + و Mg2 +. دوامة الحل لدقة الجمع، ووضع على الجليد.
  3. طلاء ألواح الثقافة.
    1. ذوبان الجليد 150 ميليلتر من المصفوفة خارج الخلية بين عشية وضحاها في ˚C 4 على الجليد.
    2. جعل حل مصفوفة خارج الخلية 5% w/v بخلط 100 ميليلتر من المصفوفة خارج الخلية المذابة مع 2 مل من المثلج الجلوكوز عالية خالية من المصل دميم.
      ملاحظة: المصفوفة خارج الخلية يتصلب في درجة حرارة الغرفة، ويجب التعامل مع الممصات مبردة مسبقاً، وأنابيب، ووسائل الإعلام حتى على استعداد للاطباق معطف.
    3. فورا معطف الزجاج الدائرة الداخلية للزجاج-أسفل الأطباق 35 ملم مع 250 ميليلتر من الحل المصفوفة خارج الخلية 5%. وستغطي هذه الوصفة الأطباق تصل إلى 8.
    4. وضع الأطباق أسفل الزجاج في حاضنة 37 درجة مئوية خلال خلية ثقافة العزلة الخطوات المتبقية. المصفوفة خارج الخلية يأخذ الحد ني ح 1 لتعيين ولكن يمكن المحتضنة لتصل إلى 2.5 س أثناء تنفيذ الخطوات الأخرى العزلة.
      ملاحظة: ختم إينكوبيشنز أطول من ح 3 يمكنك إنشاء تراكم المصفوفة خارج الخلية التي يمكن أن تعرقل تشكيل أثناء الكهربية الخلية كلها.

2-الأنسجة العزلة

  1. وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية، التضحية 3to 6 الأسبوع عمره ذكرا كان أو أنثى Tph1-الحراجية المعتمدة المعدلة وراثيا الماوس (جاكسون مختبر الأسهم: 028366)9 أو سلالة مراسل آخر.
    ملاحظة: نحن نستخدم جرعة قاتلة من ارتفاع مستويات ثاني أكسيد الكربون واضطراب عنق الرحم كوسيلة ثانوية للتأكد من الوفاة. كما ترى "اللجنة أفام" على القتل الرحيم التفكك عنق الرحم أسلوب القتل رحيم الأولية المسموح بها من الأفراد المدربين على استخدامها إذا هي أول مرة مخدراً الحيوانات.
  2. دبوس الماوس euthanized الخروج على مرحلة تشريح رغوة البوليسترين استخدام الإبر ز 21. إزالة التلوث من البطن الماوس مع الإيثانول 70%.
  3. سحب الماوس الجلد مشدود استخدام الملقط الصغير-تشريح (#5)، ومن ثم استخدام مقص جراحي حاد جعل شق عرضية في الجزء السفلي من البطن الماوس لفضح داخل تجويف. إجراء شق آخر عمودياً حتى البطن حتى يتم كشفها القفص الصدري.
  4. استخدام الملقط الصغير-تشريح للانتقال الأعور إلى يسار الفأرة لتحقيق رؤية واضحة من القولون.
  5. استخدام مقص التشريح الجزئي لقص الجزء الأكثر البعيدة من القولون (ولكن لا يزال الأقرب إلى المستقيم) وجعل ثانية قطع القاصي للمعدة. مكان الأمعاء المستخرجة إلى 100 × 15 ملم2 طبق بتري مليئة 20 مل فوسفات المثلج مخزنة المالحة (PBS).
  6. استخدم مسطرة صغيرة لقياس وقطع 10 سم أما منتصف القولون أو صائم. استخراج القولون بقياس خارج الجزء 10 سم من الأمعاء يقع بروكسيمالي إلى الخفض الأولى المتخذة أعلاه المستقيم. التعرف الصائم بطي الأمعاء الدقيقة أكملها في نصف وجعل شق أولى في منتصف الطريق وشق ثاني الدانية للأول 10 سم قطع.
    ملاحظة: الاستمرار في تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة العزلة على الجليد.
  7. ملء المحاقن مل 6 مع برنامج تلفزيوني الباردة الجليد ووضع إبرة المحقن في التجويف الجزء المعوية المستخرجة. استخدام الملقط الصغير-تشريح المشبك وختم الأمعاء حول إبرة حقنه، وتدفق بلطف 10 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق التجويف شطف بعيداً من البراز.
  8. عكس الأنسجة المعوية بلطف النسيج الملقط الصغير-التشريح عن طريق التجويف ومعسر جدار الأمعاء، وتراجعه الأنسجة الأقرب إلى طرف الملقط. كرر هذه العملية حتى يصبح الجزء من الداخل إلى الخارج مع التجويف تواجه إلى الخارج.
  9. استخدام مقص التشريح الجزئي لقطع الجزء الأنسجة إلى قطع 1 سم.
  10. استخدام الملقط الصغير-تشريح لنقل شرائح الأنسجة في كوب 50 مل مليئة 5 مل PBS العقيمة. استخدام مقص التشريح الجزئي فرم قطع الأنسجة إلى اتساق المسيل.
  11. ضع الأنسجة مفروم و 15 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني في أنبوب نظيف 50 مل بنقل ماصة. تريتوراتي 2 مرات مع ماصة نقل، والانتظار للأنسجة لتسوية وإزالة 15 مل من المادة طافية برنامج تلفزيوني، واستبدال مع برنامج تلفزيوني جديد. كرر هذه العملية ثلاث مرات حتى برنامج تلفزيوني واضح.
  12. ضع أنبوب 50 مل مع قطع الأنسجة غسلها بالثلج وإحضار دلو الجليد إلى غطاء زراعة الأنسجة.

3-الانزيمية وميكانيكية الهضم

  1. الهضم الأول
    1. من حمام الماء، استرداد واحدة من 50 مل الأنابيب التي تحتوي على 10 مل من الهضم المعالجون مسبقاً وسائل الإعلام. إلى أنبوب 50 مل، إضافة 250 ميليلتر لبرنامج تلفزيوني كولاجيناز الحل وقطع الأنسجة المعوية مفروم.
      ملاحظة: الحرص على تجنب بما في ذلك برنامج تلفزيوني أي من الخطوات السابقة الغسيل.
    2. ضع 50 مل الأنبوب في حمام مائي لمدة 5 دقائق (القولون أو صائم) عند 37 درجة مئوية. هز الأنبوب 2 x في الدقيقة.
      ملاحظة: أن التوقيت الأمثل وكثافة الهضم الميكانيكية قد تختلف وسوف تحتاج إلى أن يحددها المستخدم. تحديد شروط الهضم الأمثل، يمكن عرضها قاسمة 10 ميليلتر من الخلايا بعد كل عملية الهضم. أثناء الهضم 1، ينبغي أن تتألف المادة طافية من كتل من الخلايا.
    3. تريتوراتي الأنسجة ببطء مرة واحدة مع ماصة 10 مل مصلية. بإيجاز اسمحوا الأنسجة تسوية قطعة، ثم استخدم ماصة نقل لإزالة كامل 10 مل من المادة طافية.
  2. الثانية الهضم: كرر الخطوات 3.1.1 إلى 3.1.3. زيادة فترة الحضانة إلى 10 دقيقة إذا هضم القولون والحفاظ على الوقت حضانة في 5 دقائق صائم.
    ملاحظة: عند المراقبة، المادة طافية لا يزال يتكون من كتل كبيرة من الخلايا.
  3. الهضم الثالث
    1. كرر الخطوة 3.1.1
    2. وضع أنبوب 50 مل في حمام مائي 37 ˚C لمدة 10 دقائق (القولون أو صائم الصغيرة). هز الأنبوب x 2-3 في الدقيقة في كثافة أعلى من ديجيسشنز 1 و 2.
    3. ببطء "الماصة؛" الأنسجة صعودا وهبوطاً مع ماصة 10 مل مصلية. السماح لقطع الأنسجة تسوية لفترة قصيرة.
      ملاحظة: يجب أن تتألف المادة طافية من مزيج من الخلايا المفردة وكتل صغيرة.
    4. استخدام ماصة نقل إلى وضع 10 مل من المادة طافية في أنبوب 15 مل جديدة وإضافة 2 مل من حرارة المفوضية الأوروبية خلية كاملة ثقافة الإعلام، وعكس مرة واحدة لخلط.
    5. تدور في 100 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم استخدم ماصة نقل لإزالة المادة طافية. استخدام ماصة نقل ريسوسبيند بيليه المتبقية في 2.5 مل من حرارة المفوضية الأوروبية خلية كاملة ثقافة الإعلام.
  4. الهضم الرابع: كرر الخطوات 3.3.1 إلى 3.3.5. زيادة فترة الحضانة لمدة 15 دقيقة للقولون وتظل في 10 دقيقة صائم.
    ملاحظة: المادة طافية الآن يتكون من خلايا مفردة.

4-خلية ثقافة

  1. استخدام ماصة نقل للجمع بين تعليق الخلية التي تم جمعها من 3 ديجيسشنز و 4 في أنبوب 15 مل جديدة (الحجم الإجمالي 5 مل).
  2. قم بإزالة قاسمة 10 ميليلتر من الخلايا لحساب مع هيموسيتوميتير وتدور تعليق خلية المتبقية في 100 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: تعليق خلية النهائي سيتألف من كتل صغيرة وخلايا مفردة.
  3. إزالة المادة طافية مع ماصة نقل وريسوسبيند بيليه في المفوضية الأوروبية خلية الإعلام ثقافة كاملة في كثافة الخلايا 1,000,000 كل مل.
    ملاحظة: وحدة التخزين النهائي لتعليق خلية سيتوقف على عدد الخلايا النهائية. حساب الخلية النموذجية تتراوح بين 2,000,000 إلى 4,000,000.
  4. إزالة الأطباق الثقافة أسفل زجاج مصقول من الحاضنة. استخدام ماصة P1000 لاستبدال المصفوفة خارج الخلية من كل طبق الثقافة مع 250 ميليلتر من تعليق خلية النهائي.
    ملاحظة: طلاء المصفوفة خارج الخلية يميل إلى التمسك بحواف الطبق أسفل الزجاج. ويجب إيلاء عناية خاصة لإزالة الطلاء من على طول الحافة لمنع تراكم هلام.
  5. جعل حل أسهم للمانع روك Y-27632 في 1 مم. إضافة 2.5 ميليلتر من حل الأسهم لكل طبق أسفل الزجاج لتحقيق تركيز عامل من 10 ميكرون روك المانع في كل طبق.
    ملاحظة: هذه الخطوة هو أمر حاسم لبقاء الثقافات صائم بل هو اختياري للقولون.
  6. ضع كل طبق الثقافة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 حاضنة ح 24 إلى 72 (الشكل 1).

5-إعداد خلايا الجماعة الأوروبية لكامل الخلية الكهربية

  1. خط القطر الداخلي لمرحلة مجهر مع الشريطين 5 × 0.5 سم من الشمع الفيلم لإنشاء الدائري. جبل الطبق الثقافة خلية 35 ملم داخل الدائري (الشكل 2أ-ب).
  2. شطف الحطام العائم على حد سواء، مثل فاتحة المصفوفة خارج الخلية أو الخلايا الميتة، والمصل وسائط الثقافة تماما بعيداً عن المفوضية الأوروبية ختم خلايا لمنع أي من عرقلة تشكيل بين خلية الجماعة الأوروبية والقطب. استخدام الخيارات الثلاثة التالية لتحقيق دقيق خلية الغسيل كافياً للكهربية:
    1. الخيار 1: تبادل الحلول أكثر كفاءة في غرفة طويلة أكثر من ذلك من تعميم للدائرة. حيث كانت مثقف خلايا الجماعة الأوروبية في الأطباق جولة 35 مم، إنشاء إدراج اهليلجية بلاستيك للطبق.
      1. إنشاء الإدراج عليها 3D الطباعة أو عن طريق أساليب الطحن التقليدية. وكان ناعم إدراج استخدمنا من بلاستيك اﻷكريليك مع الأبعاد التالية (في مم): القطر الخارجي، 34.5؛ الداخلية القطع الناقص، 20 × 9؛ الطول الخارجي، 10؛ الارتفاع الداخلي، 1.5؛ جسر سبان، 3 × 3؛ إزالة الجسر، 1.5؛ مدخل ومخرج، 4 × 4 كل.
      2. انخفاض الإدراج إلى الطبق الثقافة (الشكل 2أ-ب) وتأمينه إلى أعلى مرحلة مجهر مع قطعتين ز 0.15 إلى 0.2 من نمذجة الطين إلى 1.2 × 0.3 × 0.1 سم المستطيلات (الشكل 2أ-ج).
      3. مع ماصة نقل بلاستيك، إضافة ببطء حل خارج الخلية إلى جانب واحد من الطبق (مدخل) بينما يسفط من الجانب الآخر (منفذ).
    2. الخيار 2: دون إدراج بلاستيكية هندسيا، إضافة الحل خارج الخلية ماصة نقل من جانب واحد من الطبق (مدخل) بينما يسفط من الجانب المعاكس (منفذ). ببطء تدوير موقع ماصة نقل (مثلاً، ن إلى ه إلى ق) أثناء النسخ المتطابق موضع الإبرة تطلع على الجانب الآخر (مثلاً S إلى ث إلى N).
    3. الخيار 3: معطف المصفوفة خارج الخلية على كوفيرسليبس مستطيلة في خطوة 1.3.3.، وثقافة تعليق خلية في هذه كوفيرسليبس في الخطوة 4، 4. نقل هذا ساترة إلى حجرة مستطيلة مليئة بحل خارج الخلية، مع حذف الخطوة 5.1 وتخطي الخطوة 5، 3. شطف الدائرة مع الحل خارج الخلية من ماصة نقل بلاستيك، كما هو موضح في الخيار 1 (5.2.1.3).
  3. إعادة إرفاق المرحلة مع ثقافة الخلية أعلاه المجهر المقلوب (الشكل 2د). احتضان ثقافة خلية الجماعة الأوروبية في الحل خارج الخلية خالية من المصل في درجة حرارة الغرفة.
  4. بعد 4 ساعات، يشطف ثقافة مرة أخرى مع الحل خارج الخلية كما هو موضح أعلاه. المضي قدما في الكهربية الخلية كلها.

6-كل خلية الكهربية لخلايا الجماعة الأوروبية من الثقافة الأولية

  1. تحقيق ختم جيجا خلية كاملة
    1. سحب دستة أقطاب لمقاومة MΩ 1-5.
      الملاحظات: الماصات 1 – 2 MΩ المقاومة التي تسفر عن الأختام GΩ 10-100 أداء أفضل. النار التلميع نصائح القطب ليس من الضروري لتحقيق GΩ الأختام.
    2. معطف بالتساوي مخروط الآنف من جميع الماصات مع البوليمر. عقد ماصة الأفقي للأرض وعمودي على الجزء الأمامي من بندقية الحرارة. قم بتدوير الماصة حتى يصلب البوليمر ببطء.
    3. صب قاسمة للحل داخل الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل. نقل 1.2 مل من هذا الحل في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل عن طريق حقنه 1 مل. سحب آخر مل 0.7 من حل داخل الخلايا في المحاقن. تبديد الهواء من نهاية المحاقن. إرفاق جي 34 مرنة، إبرة 67 ملم للمحاقن، وطرد أي الهواء المتبقي من هذه الإبرة.
    4. التعرف Tph1-الحراجية المعتمدة + الخلية التي ليست على اتصال بأي خلية أخرى أو الحطام.
    5. ملء نصيحة قطب كهربائي مع الحل داخل الخلايا. الردم الماصة بحقنه. بعناية فليك الماصة مع ظفر تبديد واجهة فقاعة الهواء.
    6. مع المكبس وضعت مع 0.3 مل هواء، إرفاق حقنه 6 مل بالمأخذ حامل الأنابيب. جبل مسرى في الحامل.
      ملاحظة: الاتصال حقنه بالانبوب قبل مسرى يدخل حمام الحل للحفاظ على ضغط محايدة أو إيجابية داخل الحل داخل الخلايا قبل الختم.
    7. تحميل بروتوكول جهد-المشبك خطوتين يسجل التيارات تفعيل الحالة المستقرة بسلم جهد في الخطوة الأولى، ويسجل التيارات المتاحة بجهد واحد في الخطوة الثانية. قم بفتح اختبار الختم (5 أم في 50 كيلو هرتز).
    8. أقل الكهربائي في حمام الحل. مع ميكرومانيبولاتورس، المناورة القطب نصيحة في الطائرة مع الأفقي مباشرة ومن الخلية. طرد 0.3 مل الهواء من المحاقن.
    9. تحرك بلطف مسرى أفقياً على طول المحور السيني للمس الخلية. احترس نقرة تظهر في الخلية المفوضية الأوروبية و/أو زيادة في مقاومة الغشاء على اختبار الختم. إذا لزم الأمر، تعديل الكهربائي إلى أسفل على طول محور ع و/أو أفقياً على طول المحور س، لا تتحرك في الماضي خط الوسط للخلية.
    10. تطبيق 0.1-0.2 مل شفط في المحاقن 6 مل. اضغط المكبس مطرد حتى يتحقق 100 MΩ، ثم حرر مقبض من المكبس. الانتظار للخلية إلى جيجا-الختم. قطع المحاقن مع حركة أونسكريوينج بلطف.
      ملاحظة: إذا كان عدم ختم خلية تابعة للجماعة الأوروبية في البداية، قد يكون من الممكن إعادة ختم ذلك مع محاولة لاحقة. للقيام بذلك بلطف سحب مسرى بعيداً عن خلية تابعة للجماعة الأوروبية مع < 20 MΩ ختم المقاومة. التوجيه الكهربائي المستهلك ميكرومانيبولاتورس، أبحر حول الخلية المفوضية الأوروبية الهادفة إلى مصفوفة يدوياً واضحة بعيداً أو الحطام. ثم محاولة ختم الخلية الجماعة الأوروبية مع قطب طازجة.
  2. خلية كله سجل الجهد عن طريق بوابة نا+ الحالية.
    1. إرفاق حقنه 3 مل وضعت مع 0.5 – 1.0 مل الهواء. تطبيق الاستفادة سريعة من الشفط (0.1 – 0.5 مل) في حقنه 3 مل. كرر حتى يتحقق الوصول إلى كل خلية، ثم افصل بلطف المحاقن.
      ملاحظة: يمكن أن تختلف في البداية أداء حقنه وتغير تدريجيا مع الوقت والاستخدام، الممارسة مسبقاً مع المحاقن 3 مل (ختم النهاية مع سبابة) لضمان أن سوف نكص المكبس داخل 0.1 – 0.2 موقف مل من الانطلاق. إذا لم يكن كذلك، ثم تبادل المحاقن لواحدة جديدة.
    2. قم بتشغيل خلية كاملة السعة التعويض. ضبط المقاومة السعة وسلسلة. قم بتشغيل سلسلة المقاومة التعويض. مع الفارق في 60 مرض التصلب العصبي المتعدد، ضبط التعويض المقاومة سلسلة تنبأ ثم تصحيحها. إغلاق اختبار الختم.
    3. سجل متوسط 5 تشغيل كامل الخلية عن طريق بوابة الجهد الحالي Na+ (الشكل 3أ).
    4. يحيط علما بمعلمتين من بوابات الجهد الحالي Na+ بسرعة: الجهد في النافذة الحالية (الشكل 3ب، رموز حمراء، والتقاطع منحنيات الحالة المستقرة التنشيط والمنظمة) والحالية ذروة نا+ الكثافة.
      ملاحظة: خلايا الجماعة الأوروبية مع ذروة نا+ تيارات أكثر من السلطة الفلسطينية-50 في الجهد عادة وضع المشبك سيتوجه إلى إطلاق إمكانات انتزع في وضع المشبك الحالي. بالإضافة إلى ذلك، التيارات أكبر من السلطة الفلسطينية-200 في الجهد المشبك (الشكل 3أ) ثم عادة إطلاق إمكانات العمل تلقائياً في المشبك الحالية من إمكانات غشاء (الخط الأحمر، الشكل 3د) القرب من الجهد الإطار الحالي (رموز حمراء، الشكل 3ب).
  3. وقد سجل آثار إمكانات العمل.
    1. إيقاف سلسلة المقاومة التعويض. إيقاف تشغيل الأوامر الخارجية. التبديل الوضع من الخامس-المشبك-المشبك. ضبط المكاسب. تحميل بروتوكولا المشبك الحالية عرضية. ضبط مقدار عقد الحالي إلى 0 السلطة الفلسطينية. قم بتشغيل الأوامر الخارجية.
      تنبيه: لا التبديل من الخامس-المشبك-المشبك (أو العكس بالعكس) دون إيقاف أول الأمر الخارجي.
    2. ملاحظة إمكانات غشاء يستريح. ضبط عقد الحالي الإدخال حيث أن إمكانات غشاء يقرأ أدناه الإطار الحالي (مثلاً، -80-100 mV). ضبط بروتوكول المشبك العرضية الحالي حيث يكون الفاصل خطوة الإدخال الحالي أقل من قيمة عقد الحالية (الشكل 3ج اقحم، خطوات السلطة الفلسطينية + 2-3 السلطة الفلسطينية تحتجز حاليا).
    3. وقد سجل آثار إمكانات العمل. ملاحظة أقل قدر من حقن لإطلاق النار قبالة بإمكانيات العمل الحالية (الشكل 3جيم، اكتساح 3 5، خطوة السلطة الفلسطينية + 4 من السلطة الفلسطينية-3 عقد = pA + 1).
  4. سجل إمكانات العمل العفوي.
    1. إيقاف تشغيل الأوامر الخارجية. تحميل بروتوكول المشبك الحالي فجوة خالية (غير عرضية).
      ملاحظة: لا يتم تشغيل الأمر الخارجي مرة أخرى حتى تم التحقق من مقدار الضغط الحالي في البروتوكول المشبك خالية من الفجوة الحالية تكون مناسبة للخلية.
    2. تغيير عقد الحالي أن يكون مقدار التيار حقن في الاجتياح الأخير في البروتوكول انتزع أنه لم يطلق النار بإمكانيات العمل (الشكل 3دمن الإدخال الحالي أثناء الاجتياح الثاني، خطوة السلطة الفلسطينية + 2 من السلطة الفلسطينية-3 عقد =-1 السلطة الفلسطينية).
    3. قم بتشغيل الأوامر الخارجية. الاختيار مزدوج أن توقع عقد الحالي يجلب غشاء المحتملة عن عتبة لإطلاق النار بإمكانات العمل. تعديل عقد الحالية إذا لزم الأمر. سجل النشاط العفوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الثقافات:
إرفاق إلى الأطباق بعد 4 ساعات الابتدائي الخلايا الظهارية مورين من طراز Tph1-الحراجية المعتمدة المعدلة وراثيا وهي جاهزة للتجارب الفسيولوجية بين 24 إلى 72 ح. عندما قد لا تم تحسين ظروف الثقافة، وثقافة الخلايا الظهارية تتألف من كتل كبيرة، تعويم الحطام الخلوية والأغشية التالفة، وضعف إشارة الحراجية المعتمدة في خلايا الجماعة الأوروبية (الشكل 1أ). الثقافات التي قد تم تحسينها للكهربية تتألف من خلايا مفردة وكتل صغيرة. خلايا الجماعة الأوروبية صحية حددت سهولة مشرق الحراجية المعتمدة الأسفار ولا تزال تلتزم الطبق بعد الغسيل نشطة (الشكل 1ب).

الكهربية:
وتم الحصول على خلايا الجماعة الأوروبية كلها على مجرد 15% ±4 من محاولات من الثقافات القولون دون المانع روك (الخلايا كلها 29 من أصل 182 المحاولات من الثقافات 22) لكن 30% ±7 لمحاولات من الثقافات القولون مع مثبط روك (خلايا كاملة 27 من أصل 102 محاولات من الثقافات 50) (< c1 > الشكل 4أ؛ ف < 0.05 من ثنائي الطرف غير حدودي تي-اختبار، الثقافات القولون دون مقابل مع مثبط روك). وبالمثل، صائم خلايا الجماعة الأوروبية دون المانع روك لم ينج طويلة بما يكفي للكهربية، بينما المفوضية الأوروبية وتم الحصول على خلايا كاملة على 41 في المائة ±3 من محاولات من الثقافة صائم مع مثبط روك (خلايا كاملة 186 من محاولات 447 من الثقافات 50) (الشكل 4أ؛ p > 0.05 من ثنائي الطرف غير حدودي تي-اختبار، صائم مقابل نقطتين مع مثبط روك).

وسجلت التيارات نا+ بخلية كله الكهربية، في وضع المشبك الجهد وإمكانات العمل (AP) في الوضع الحالي-المشبك. وسجلت التيارات نا+ من 81.3 في المائة ±4.0 من TPH1-الحراجية المعتمدة + الخلايا من صائم أو 64.1 في المائة ±9.2 من القولون3. خلايا الجماعة الأوروبية 59 من الثقافات صائم أكده المشبك الجهد لدى نا+ ذروة التيارات أكبر من السلطة الفلسطينية-25، 19 خلايا الجماعة الأوروبية في الوضع الحالي-المشبك أطلقت عفوية AP ("عفوية")، 29 EC الخلايا أطلقت وكالة اسوشييتد برس إلا عندما أثارت ببروتوكول خطوة في المشبك الحالية وضع ("أثارت فقط")، و 11 EC الخلايا لا النار AP عفويا أو بخطوة بروتوكول ("عدم إطلاق") (الشكل 4ب). خلايا عفوية يبلغ متوسط ذروة نا+ الحالي كثافة (طالذروة)-108.0 ±19.3 السلطة الفلسطينية/الجبهة الوطنية، قد أثارت فقط الخلايا أناذروة -60.2 ±9.2 السلطة الفلسطينية/pF، بينما الخلايا غير إطلاق النار كان أناذروة -43.3 ±14 السلطة الفلسطينية/pF (الشكل 4 ب؛ ف < 0.05، عفوية مقابل أثارت فقط أو عدم إطلاق مجموعات؛ p > 0.05 أثارت فقط مقابل عدم إطلاق مجموعات). الفرق في الكثافة الحالية لم تكن انعكاسا لخلية كاملة السعة، عفوية (3.3 ± 0.2 pF)، وأثارت فقط (2.9 ± 0.2 pF)، وعدم إطلاق النار (3.1 ±0.3 pF) الخلايا قد مماثلة كل خلية كاباسيتانسيس (P > 0.05). المفوضية الأوروبية خلية نا+ التيارات وانتزع وكالة اسوشييتد برس كانت حساسة لتركيزس [نا+] و تثبيط 1.3 غت3.

Figure 1
الشكل 1 : مجموعة تمثيلية من نتائج الثقافة- مدينة دبي للإنترنت مع الصور ابيفلوريسسينسي ثقافة صائم الظهارية الأولية من ماوس Tph1-الحراجية المعتمدة مطلي على طبق أسفل زجاج ومثقف ح 24. اثنين من هذه الصور تظهر مجموعة من نتائج الثقافة من هذا البروتوكول. الحراجية المعتمدة الفلورسنت الخلايا (أبيض) خلايا enterochromaffin (الجماعة الأوروبية). (أ) صورة تمثيلية من ثقافة نوعية رديئة للكهربية. الثقافة تتكون من كتل كبيرة وأغشية الخلايا التالفة وإشارة منخفضة الأسفار والعائمة مجموعات من الخلايا الميتة. (ب) صورة تمثيلية من ثقافة التي تم الأمثل للكهربية. الثقافة يتكون أساسا من خلايا مفردة، وصحية، وكتل صغيرة التي تنضم إلى اللوحة. خلايا الجماعة الأوروبية في هذه الثقافة الحفاظ على إشارة قوية الأسفار. شريط المقياس = 100 ميكرومتر؛ لوحات هي ذات مقياس 1:1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : إعداد خلية الثقافات للكهربية. وضع استراتيجية فعالة وشاملة الشطف الثقافات الخلية الجماعة الأوروبية مع الحل خارج الخلية خالية من المصل أمر بالغ الأهمية لتخفيض المصفوفة خارج الخلية والمصل الذي من شأنه أن يعرقل تشكيل الختم. (أ) المواد. اتجاه عقارب الساعة من أعلى اليسار: المرحلة، طبق الشريطين واسعة 5 مم من الشمع الفيلم، قطعتين 200 مغ من نمذجة الطين، ماصة نقل البلاستيك، الملقط #5، دائرة تسجيل بيضاوي الشكل، وثقافة 35 ملم مع أسفل الزجاج. (ب) الالتزام الفيلم الشمع للقطر الداخلي للمرحلة وانخفاض في دائرة اهليلجية إلى الطبق الثقافة وتتسطح الطين إلى شرائح مستطيلة. (ج) اضغط الطبق الثقافة إلى مرحلة مبطنة الفيلم الشمع برفق وشل في دائرة التسجيل التي تمتد على حافة الطبق، من الدائرة إلى المرحلة الطين النمذجة. شطف خلايا الجماعة الأوروبية مع عدة مجلدات من الحل خارج الخلية. (د) عودة المرحلة الأقواس المتزايدة أعلاه المجهر المقلوب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : نتائج الكهربية التمثيلية. (أ) خلية كله التيارات نا+ ، المسجلة بموجب بروتوكول جهد-المشبك خطوتين (داخلي). ديبولاريزيشنز 50 مللي من-120 أم تنشيط قنوات خلال الخطوة 1 (●)، بينما ديبولاريزيشن أخرى إلى 0 أم أثناء الخطوة 2 (○) ينشط القنوات التي قد لا إلغاء تنشيطه بعد (أي، لا تزال متاحة لفتح). تتبع أحمر، أثارت بالجهد الحالي خطوات من-120 إلى-40 إلى 0 أم. (ب) الجهد الحالي علاقة التيارات نا+ الذروة من الفريق، الخطوة 1 (●، تنشيط الحالة المستقرة) أو الخطوة 2 (○، المنظمة حالة ثابتة). تقاطع منحنيات الحالة المستقرة التنشيط والمنظمة يكشف نافذة صغيرة الحالية في-40 mV (رموز حمراء). (ج) إمكانات العمل أثارت قبل ديبولاريزينج المحفزات الحالية. يمكن إطلاق النار بإمكانيات العمل في الماضي 0 mV (الخط الرمادي) عندما يصل الغشاء المحتملة الجهد نا+ النافذة الحالية (الخط الأحمر،-40 mV). اقحم، بروتوكول المشبك الحالية، التي تم حقن 0 إلى السلطة الفلسطينية + 8 ديبولاريزيشنز 50 مللي ثانية من خط أساس من-3 السلطة الفلسطينية. (د) إمكانات العمل النار من فوق الأحداث العفوية التي قد ديبولاريزيد إلى-40 أم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : سرعة النقل الكهربية الخلية كله. (أ) نسبة متوسط الخلايا كلها في محاولة لأيام ن العمل في غياب (-) أو وجود المانع روك (10 ميكرون) (+). خلايا الجماعة الأوروبية من صائم لم ينج ح 24 في الثقافة دون مثبط لموسيقى الروك. (ب) نا+ الكثافة الحالية تقاس بالجهد-المشبك من خلايا الجماعة الأوروبية n ، فيها إمكانات العمل لم يطلق النار (عدم إطلاق)، أطلقت فقط عندما أثارت بالبروتوكول الحالي-المشبك عرضية (الستيد فقط)، أو أطلقت تلقائياً في وضع خال من الفجوة الحالية-المشبك (العفوي) (وهي أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

فهم تماما وظيفة الخلية المفوضية الأوروبية يتطلب أسلوب ثقافة الأولية عالية الجودة لإنشاء خلايا للكهربية الخلية كلها. الثقافات الأولية ظهارة غي تقليديا صعباً بسبب بقاء منخفضة. التخفيف من حدة هذه العوامل المؤثرة الأخرى، الأسلوب الحالي غلة الثقافات المفرد EC الخلايا من الأمعاء الصغيرة أو الكبيرة التي قادرة على البقاء على قيد الحياة لعدة أيام.

لقد وجدنا أن التالية ذات أهمية حاسمة لتحسين نوعية الثقافات تكون مناسبة للكهربية: (1) عكس الغشاء المخاطي بدلاً من تقشير لها، (2) إضافة كمية صغيرة من جيش صرب البوسنة على وسائل الإعلام في الهضم و FBS لوسائل الإعلام الثقافة، (3) تخفيض تركيز كولاجيناز الحادي عشر، (4) ضبط المدة وشدة الانفعالات الميكانيكية لزيادة عدد وصحة الخلايا المفردة، (5) تصفيح المصفوفة خارج الخلية في تركيز منخفض، و (6) استزراع مع مثبط لموسيقى الروك.

وبالمثل، كانت حاسمة بالنسبة للحصول على خلايا كاملة أثناء التصحيح لقط التعديلات التالية: (1) دقة الشطف الثقافات مع الحل خارج الخلية خالية من المصل، (2) السماح للجماعة الأوروبية تقف الخلايا في الحل خارج الخلية على الأقل 4 ح، (3). إعادة تحديد الأهداف، أي قضى أقطاب مثل تلك من الأختام الفاشلة-لإزالة الأنقاض في طريقها إلى خلية الجماعة الأوروبية المقبلة، (4) إضافة 10 ميكرون Gd3 + للحل خارج الخلية لمنع تسرب التيارات (إذا كان موجوداً) وتيسير الانضمام لخلايا الثدييات معلقات للزجاج. ونحن نحذر من أن Gd3 + يمكن عرقلة الجهد عن طريق بوابة Ca2 + و/أو ميتشانوسينسيتيفي قنوات المعرب عنها في خلايا الجماعة الأوروبية.

وعلى الرغم من وجود الأمثل بعناية الظروف تثقيف، وجدنا عدد قليل من القيود: خلايا الجماعة الأوروبية بحاجة إلى 24 ساعة لإرفاق تماما بعد تنتهي بعد ح ~ 72 في الثقافة؛ ولذلك، لديهم نافذة 48 ساعة عندما تكون مناسبة للتجارب الكهربية. لأنه تجمعت الخلايا غالباً ما يعرض العابرين السعة التي لا يمكن تعويضها من التسجيلات، وتوليد خلايا الجماعة الأوروبية الحاسمة. ومع ذلك، بفصل خلايا الجماعة الأوروبية من الظهارة، الخلايا ثم العيش في بيئة غير أصلي (أيوسائل الإعلام الجلوكوز عالية مع الجنين المصل البقري ومثبط الصخور فوق المصفوفة خارج الخلية كغشاء اصطناعي) ويمكن أن يستجيب للمنبهات ليست تماما وظيفة ممثل الجماعة الأوروبية الخلية في فيفو. وعلى الرغم من هذه القيود، الابتدائي استزراع خلايا الجماعة الأوروبية لا يزال يوفر نظرة ثاقبة علم وظائف الأعضاء.

خلايا الجماعة الأوروبية تلعب دوراً حاسما في الحفاظ على الجهاز الهضمي يعمل بشكل جيد والجسم، وعلى هذا النحو، وهناك العديد من الأساليب المتقدمة للحصول على فهم عن المفوضية الأوروبية الخلية الكهربية. وكان التحقيق الكهربية الخلية انتيروندوكريني والجماعة الأوروبية في خلية مخلدة نماذج5،8،13، الجماعة الأوروبية الرئيسية الخلية الثقافات من خنزير غينيا11و3،الماوس4، لدينا أسلوب يستخدم أساليب الحفاظ على نوعية الخلية لإنشاء ثقافة قد تمت معالجته بالحد الأدنى، ويعبر عن خلايا الجماعة الأوروبية الأصلية. نحن نستخدم نموذج الفأر وراثيا، Tph1-الحراجية المعتمدة، يظهر الأسفار سماوي في السيتوبلازم عند Tph1 الحالي9. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب لمراسل أو تتبع النسب انتيروندوكريني أنواع الخلايا الأخرى. لدينا أسلوب يحقق أيضا عزل الخلايا المفردة من المفوضية الأوروبية في الحد الأدنى من الوقت والمعالجة الانزيمية، كما تتعرض الخلايا فقط الحادي عشر كولاجيناز لطيف في تركيز الحد الأدنى لكنها فعالة من 0.1 مغ/مل (صائم) و 0.6 ملغ/مل (القولون) لأقل من ساعة واحدة. نتيجة لهذه التعديلات هي ثقافة التي تم الأمثل للدراسات الكهربية لخلايا الجماعة الأوروبية.

أننا استخدمت بنجاح هذا الأسلوب لدراسة الإفراج الكهربية والسيروتونين في خلايا الجماعة الأوروبية مورين3. تحديد القدرة على عزل بنجاح،، وثقافة واحدة EC خلايا يسهل التوجهات المستقبلية الهامة في دراسات عن فيزيولوجيا الخلية الجماعة الأوروبية. يمكن استخدام هذا الأسلوب لزيادة تحديد المسارات الحرجة وقنوات المشاركة في الرقابة خلية الجماعة الأوروبية السيروتونين والمفوضية الأوروبية الأخرى أجهزة الإرسال الخاصة بالخلية. يمكن أيضا تعديل الأسلوب لعزل وتوصيف فسيولوجيا الخلية EC البشرية جنبا إلى جنب مع استخدام أورانج أكريديني ل تحديد الخلية المفوضية الأوروبية13.

كما هو الحال بالتنمية بروتوكول آخر العلمية، الاتصال والملاحظات غير متحيزة كانت حاسمة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها لهذا البروتوكول. عندما نقوم اختبار أساليب ثقافة جديدة لبقاء ثقافاتنا، كان من المفيد حساب عدد الخلايا فلوري كتدبير من تدابير السلامة، وتقدير كثافة الخلية في كل طبق، وجمع الصور التمثيلية وأشرطة الفيديو من الثقافات عبر الكثير من الوقت النقاط. بعد الخلايا كانت قادرة على البقاء على قيد الحياة في الماضي ح 24 في الثقافة، عملنا على تعديل ثقافاتنا للتجارب الكهربية. جنبا إلى جنب مع جمع الصور والملاحظات التفصيلية، من المهم الحفاظ على اتصال واضحة بين موظفي المختبر فيما يتعلق بإدخال تعديلات على الهضم الميكانيكي والملحق و/أو تركيزات الركازة، حيث أن الخلايا السليمة في الجماعة الأوروبية على استعداد لتحديد خصائص الكهربية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا شيء

Acknowledgments

يشكر المؤلفون السيدة ليندسي Busby للمساعدة الإدارية والسيد روبرت هيت من "مايو كلينيك عيادة شعبة الهندسة" لتصميم وطباعة 3D لإدراج طبق الثقافة. هذا العمل كان يدعمها K08 المعاهد الوطنية للصحة لأب (DK106456) والطيار ومنحة الجدوى لأب من مركز عيادة مايو كلينيك "الخلية الإشارات" في أمراض الجهاز الهضمي (P30DK084567 المعاهد الوطنية للصحة) وعام 2015 جاسترونتيرولوجيكال رابطة البحوث الباحث جائزة الأمريكية (RSA أغا) إلى آب، والمعاهد الوطنية للصحة R01 لفرنك غيني (DK52766).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm x 15 mm culture dish Corning (Falcon) 351029
Transfer Pipette Fisherbrand 13-711-7M
10 mL serological pipette Corning (Falcon)  357551
50 mL Conical Corning (Falcon)  352098
15 mL Conical Corning (Falcon)  352097
1,000 mL Barrier Pipet Tips Thermo Scientific (Art) 2079E Keep sterile
MatTek Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-14-C Keep sterile
Micro-dissection Forceps - Very Fine, Extra-Long Points Fine Science Tools SB12630M
Surgical Scissors-Sharp Nasco 14002-14
Micro-Dissection Scissors Nasco SB46568M
Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX Covidien 8881250172
 Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice Jackson Stock # 028366 Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) World Precision Instruments MF34G-5
Parafilm "M" Laboratory Film Pechiney Plastic Packaging
R6101 Dow Corning
6 mL syringe with regular luer tip Monoject
3 mL syringe with regular luer tip Monoject
Electrophysiology Equipment
Amplifier Molecular Devices Axopatch 200B
Data acquisition system (daq) Molecular Devices Digidata 1440A
Signal conditioner Molecular Devices CyberAmp 320
Software Molecular Devices pClamp 10.6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
  2. Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, Pt 5 1081-1093 (2011).
  3. Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
  4. Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
  5. Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
  6. Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells. Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).
  7. Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).
  8. Wang, F., et al. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces. The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).
  9. Li, H. J., et al. Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus. Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).
  10. Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells. Journal of Visualized Experiments. (122), 55687 (2017).
  11. Raghupathi, R., et al. Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells. The Journal of Physiology. 591, Pt 23 5959-5975 (2013).
  12. Nozawa, K., et al. TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).
  13. Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, Pt 1 161-175 (2005).

Tags

البيولوجيا، 139 قضية، الجهاز الهضمي، وظهاره، خلايا enterochromaffin، الثقافة الأولية، الكهربية الخلية كلها، المشبك الجهد، المشبك الحالية
الكهربية كل خلية من خلايا Enterochromaffin موريني مثقف الأولية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Knutson, K., Strege, P. R., Li, J.,… More

Knutson, K., Strege, P. R., Li, J., Leiter, A. B., Farrugia, G., Beyder, A. Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells. J. Vis. Exp. (139), e58112, doi:10.3791/58112 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter