Hele cel electrofysiologie van primaire gekweekte lymfkliertest Enterochromaffin cellen

Summary

Enterochromaffin (EG) cellen bestaan uit een kleine subset van gastro-intestinale epitheliale cellen. EG cellen zijn elektrisch prikkelbaar en vrij serotonine, nog moeilijkheden in kweken en het identificeren van de EG cellen hebben beperkte fysiologische studies. De methode die hier gepresenteerd wordt een primaire cultuur model vatbaar voor onderzoek van afzonderlijke cellen van de EG vastgesteld door electrofysiologie.

Abstract

Enterochromaffin (EG) cellen in het gastro-intestinaal epitheel (GI) vormen de grootste subpopulatie van enteroendocrine cellen. Als gespecialiseerde zintuigcellen, EG cellen zin luminal prikkels en hen omzetten in serotonine (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release gebeurtenissen. De elektrofysiologie van deze cellen is echter slecht begrepen, omdat ze moeilijk te cultuur en zijn te identificeren. De methode voorgesteld in dit papier contouren primaire EG celculturen geoptimaliseerd voor eencellige electrofysiologie. Dit protocol maakt gebruik van een verslaggever van de transgene cyaan fluorescente proteïne (GVB) om te identificeren muis EG cellen in gemengde primaire culturen, bevordering van de aanpak voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige opnames van hele cel electrofysiologie in spanning - en stroom-clamp modi.

Introduction

Het gastro-intestinaal epitheel (GI) is een diverse Gemeenschap, bestaande uit verschillende celtypes. Enteroendocrine cellen bestaan uit ongeveer 1% van alle epitheliale cellen, en enterochromaffin (EG) cellen zijn de grootste enteroendocrine cel bevolking¹. Recente studies tonen aan dat enteroendocrine² en EG^3,4 cellen elektrisch prikkelbaar zijn. Wij zijn geïnteresseerd in het begrijpen van de primaire EG cel electrofysiologie. Dus, het doel van deze studie was om primaire EG celculturen geoptimaliseerd voor hele cel electrofysiologie.

Bestaande EG-cel lijnen die produceren en afscheiden van 5-HT (bijvoorbeeld QGP-1-⁵, BON⁶, KRJ-1-⁷) en zijn gebruikt voor het onderzoeken van de elektrofysiologie^5,8 zijn meestal gegenereerd op basis van vereeuwigd neoplastische weefsels. Terwijl de informatie overgenomen van deze cellijnen waardevolle^{5,8 is}, zijn studies van de primaire cel electrofysiologie noodzakelijk om goed te begrijpen EG celfysiologie. De elektrofysiologie van primaire cellen van de EG is vereist voor de isolatie en de cultuur van één epitheliale cellen, die heeft is beperkt door lage levensvatbaarheid van epitheliale culturen.

De methode van de cultuur gepresenteerd in deze studie is gebaseerd op transgene muizen met fluorescently geëtiketteerde EG-cellen, zoals Tph1-GVB⁹, gebruikt in deze studie. De methode optimaliseert gemengde primaire epitheliale culturen ontwikkeld eerder^2,,¹⁰ voor eencellige electrofysiologie³. Vorige methoden gebruikt combinaties van trypsine/EDTA plus Collagenase A of EDTA en DTT voor enzymatische spijsvertering en dichtheid verlopen te specifiek isoleren en cultuur cavia¹¹ en rat EG cellen¹². Meer recentelijk, intestinale organoids werden gegenereerd en mechanisch verstoord voor elektrofysiologische opnames⁴. Culturen met behulp van deze methoden zijn geschikt voor serotonine loslaat van experimenten, RT-qPCR analyse en, terwijl ze kunnen worden gebruikt voor electrofysiologie, zijn afhankelijk van het succes van tijdrovende organoid generatie, dichtheid verlopen EG cellen, worden geïdentificeerd en de cellulaire vernietigende effecten van trypsine en EDTA. Daarentegen het protocol hier beschreven verbetert enzymatische en mechanische behandelingen, optimaliseert kweken voorwaarden en procedures voor de productie van één gezonde EG cellen en geschikt voor de hoge cellulaire normen die nodig zijn voor de elektrofysiologie stroomlijnt.

Deze methode zal worden nuttig voor wetenschappers die willen werken aan primaire cellen van de EG in gemengde culturen in plaats van vereeuwigd culturen en willen onderzoeken de elektrofysiologie van afzonderlijke cellen. Echter kan het blijken minder geschikt voor de studie van cel populaties moeten sorteren of op lange termijn culturen waarvoor survival afgelopen 72 h.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Mayo Clinic. De primaire cel cultuur gedeelte van dit protocol is gebaseerd op eerder gepubliceerde methoden waarnaar kunnen worden verwezen voor verder details¹⁰. Alle experimentele procedures moeten worden goedgekeurd door de (IACUC), en alle experimenten moeten worden uitgevoerd volgens de relevante richtlijnen en verordeningen.

1. cultuur voorbereiding

1. Media.
   1. EG cel volledige voedingsbodems bereiden met hoge glucose [4500mg/L] Dulbecco's bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 5% foetale runderserum (FBS), 1 L-Glutamine en 1% penicilline-streptomycine (tabel 1).
      Opmerking: Media kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal een maand.
   2. Filteren van de EG cel volledige cultuurmedia en breng 25 mL van de media in een tube van 50 mL bij 37 ° C.
   3. Bereiden van spijsvertering media met hoge glucose [4.500 mg/L] DMEM aangevuld met 0,1% boviene serumalbumine (BSA) (tabel 1).
   4. De spijsvertering filtermedia en vier 10 mL aliquots van media in aparte 50 mL buizen en broeden in een waterbad 37 ° C.
      Opmerking: Media kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal een maand.
2. Enzym.
   1. Weeg 4 mg (jejunum) of 24 mg (dubbele punt) van Collagenase XI [≥800 eenheden/mg] in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
      Opmerking: Collagenase is stabiel bij-20 ° C gedurende maximaal één jaar.
   2. Resuspendeer de aliquote in 1 mL ijs koud PBS met Ca^{2 +} en Mg^{2 +}collagenase. Vortex de oplossing grondig combineren, en plaatsen op het ijs.
3. Coating cultuur platen.
   1. Ontdooi 150 µL van extracellulaire matrix's nachts op 4 ˚C op ijs.
   2. Maak een oplossing van 5% w/v extracellulaire matrix door het mengen van 100 µL van ontdooide extracellulaire matrix met 2 mL ijskoud serumvrij high-glucose DMEM.
      Opmerking: Extracellulaire matrix stolt bij kamertemperatuur en totdat u aan vacht gerechten met vooraf gekoeld pipetten, buizen en media moet worden behandeld.
   3. Onmiddellijk jas de binnenste cirkel van de glazen van glas-onder 35 mm gerechten met 250 µL van de extracellulaire matrix-oplossing van 5%. Dit recept zal betrekking hebben op maximaal 8 gerechten.
   4. Plaats de glazen-bodem gerechten in een incubator 37 ° C gedurende de resterende cel cultuur isolatie stappen. De extracellulaire matrix neemt minimaal 1 h om in te stellen maar kan worden ge¨ uncubeerd maximaal 2,5 h terwijl andere isolatie stappen uit te voeren.
      Opmerking: Incubations langer dan 3 h kunt maken met een opbouw van extracellulaire matrix waardoor kan worden belemmerd zegel formatie tijdens de hele cel electrofysiologie.

2. de weefsels isolatie

1. Volgens ethische richtlijnen, offeren een 3om 6 week-oude mannelijke of vrouwelijke Tph1-GVB transgene muis (The Jackson laboratorium voorraad: 028366)⁹ of een andere verslaggever stam.
   Opmerking: We gebruiken een fatale dosis van stijgende niveaus van kooldioxide en een cervicale dislocatie als een secundaire middel om dood. Het AVAM-Comité op euthanasie ook acht cervicale dislocatie een toegestane primaire euthanasie door personen die zijn opgeleid in het gebruik ervan als de dieren zijn eerst verdoofd.
2. PIN de euthanized muis die op een piepschuim dissectie podium met 21 G naalden. Ontsmetten van de buik van de muis met 70% ethanol.
3. Trek muis huid strak met behulp van micro-dissectie pincet (#5), en gebruik vervolgens scherpe chirurgische schaar te maken van een dwarse snede aan de onderkant van de buik van de muis om de intraperitoneaal holte bloot te stellen. Maak een andere snede verticaal omhoog de buik tot de ribbenkast is blootgesteld.
4. Gebruik de micro-dissectie verlostang om de blindedarm naar links van de muis om een duidelijk beeld van de dikke darm bereiken.
5. Gebruik de micro-dissectie schaar te knippen de meest distale deel van de dikke darm (maar nog steeds proximale tot en met het rectum) en een tweede distale gesneden aan de maag. Plaats de uitgepakte darmen in een 100 x 15 mm² petrischaal gevuld met 20 mL ijskoud fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
6. Een kleine liniaal gebruiken om te meten en uitknippen van 10 cm van beide mid colon of jejunum. Uittreksel dikke darm door het meten van uit het 10 cm-segment van darm proximally gelegen aan de eerste snede boven het rectum genomen. Het jejunum identificeren door de hele dunne darm doormidden vouwen en maken een eerste snede op het halverwege punt en een tweede snede 10 cm proximaal naar de eerste gesneden.
   Opmerking: Blijven alle latere isolatie stappen op het ijs.
7. Vul een 6 mL injectiespuit met ijs koud PBS en plaats de naald van de spuit in het lumen van het uitgepakte intestinale segment. Gebruik van de verlostang micro-dissectie klem te verzegelen van de darmen om de naald van de spuit, en voorzichtig spoelen 10 mL PBS via de lumen te spoelen weg fecale materie.
8. Het omkeren van de intestinale weefsel door zachtjes weven van de verlostang micro-dissectie via het lumen, een darmwand knijpen en intrekken van het weefsel proximale naar het uiteinde van de verlostang. Herhaal dit proces totdat het segment binnenstebuiten is met het lumen naar buiten geconfronteerd.
9. Gebruik micro-dissectie schaar te snijden het weefsel segment in stukjes van 1 cm.
10. Micro-dissectie pincet gebruiken om de segmenten van het weefsel in een 50 mL-bekerglas gevuld met 5 mL steriele PBS. Gebruik de micro-dissectie schaar om gehakt van de stukjes weefsel tot een vloeibaar consistentie.
11. Plaats de gehakt weefsel en 15 mL ijs koud PBS in een schone 50 mL-buis door overdracht pipet. Triturate 2 keer met de pipet overdracht, wachten op het weefsel te vestigen, 15 mL van het supernatans dat PBS verwijderen en vervangen door verse PBS. Herhaal dit proces drie keer totdat de PBS duidelijk is.
12. Plaats de tube 50 mL met gewassen weefsel stukken op het ijs en de ijsemmer brengen een weefselkweek kap.

3. enzymatische en mechanische spijsvertering

1. Eerste spijsvertering
   1. Ophalen uit het waterbad, een van de 50 mL tubes met 10 mL voorverwarmde spijsvertering media. Om de tube van 50 mL, voeg 250 µL van de PBS collagenase oplossing en gehakt intestinale weefsel stukken.
      Nota: zorg om te voorkomen dat met inbegrip van eventuele PBS van vorige wassen stappen.
   2. Plaats de tube van 50 mL in een waterbad gedurende 5 minuten (colon of jejunum) bij 37 ° C. Schud de buis 2 x per min.
      Opmerking: De optimale timing en intensiteit van mechanische spijsvertering kunnen variëren en zal moeten worden bepaald door de gebruiker. De optimale spijsvertering om voorwaarden te bepalen, kan een hoeveelheid van 10 µL van cellen na elke spijsvertering worden weergegeven. Tijdens 1 van de spijsvertering, moet het supernatant bestaan uit de bosjes van cellen.
   3. Langzaam triturate het weefsel één keer met een serologische pipet 10 mL. Kort laat het weefsel stukken regelen, gebruik dan een pipet overdracht te verwijderen van de gehele 10 mL van het supernatans.
2. Tweede spijsvertering: Herhaal stap 3.1.1 aan 3.1.3. Verhogen van de incubatietijd aan 10 min als dikke darm verteren en houd de incubatietijd bij 5 min. voor het jejunum.
   Opmerking: Op een observatie, het supernatant moet nog steeds bestaan uit grote bosjes van cellen.
3. Derde spijsvertering
   1. Herhaal stap 3.1.1
   2. Plaats de buis 50 mL in een waterbad 37 ˚C voor 10 min (colon of kleine jejunum). Schud de buis 2-3 x per min bij een hogere intensiteit dan spijsvertering van 1 en 2.
   3. Pipetteer langzaam op en neer het weefsel met een serologische pipet 10 mL. Laat de stukjes weefsel te regelen voor een korte tijd.
      Opmerking: Het supernatant moet bestaan uit een combinatie van afzonderlijke cellen en kleine bosjes.
   4. Gebruik een pipet overdracht Breng 10 mL van het supernatans dat in een nieuwe tube van 15 mL, voeg toe 2 mL verwarmde EG cel volledige cultuurmedia en eenmaal omkeren als u wilt mengen.
   5. Draaien op 100 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, gebruik dan een overdracht pipet om de bovendrijvende vloeistof verwijderen. Gebruik een pipet overdracht om resuspendeer de resterende pellet in 2.5 mL verwarmde EG cel volledige voedingsbodems.
4. Vierde spijsvertering: Herhaal stap 3.3.1 aan 3.3.5. Verhogen van de incubatietijd tot 15 min voor dikke darm en blijven op 10 min. voor het jejunum.
   Opmerking: Het supernatant moet nu bestaan uit afzonderlijke cellen.

4. de celkweek

1. Gebruik een pipet overdracht te combineren van de schorsingen van de cel van spijsvertering van 3 en 4 samengebracht in een nieuwe tube van 15 mL (5 mL totale volume).
2. Verwijderen van een hoeveelheid van 10 µL van cellen tellen met een hemocytometer en draai de resterende celsuspensie bij 100 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   Opmerking: De uiteindelijke celsuspensie zal bestaan uit kleine bosjes en afzonderlijke cellen.
3. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet overdracht en resuspendeer de pellet in EG cel volledige voedingsbodems bij een dichtheid van 1.000.000 cellen per mL.
   Let op: Het eindvolume van celsuspensie zal afhangen van de laatste cel tellen. Typische cel telt variëren van 2.000.000 tot 4.000.000.
4. Verwijder gecoate glazen-bodem cultuur gerechten uit de incubator. Gebruik een pipet P1000 ter vervanging van de extracellulaire matrix van elke cultuur schotel met 250 µL van de definitieve celsuspensie.
   Opmerking: Extracellulaire matrix coating neiging vast te houden aan de randen van de glazen-bodem schotel. Speciale zorg moet men zich verwijdert van de coating uit langs de rand om te voorkomen dat de opbouw van de gel.
5. Het maken van een stamoplossing van ROCK-remmer Y-27632 op 1 mM. 2.5 µL van stockoplossing aan elk gerecht onder glas tot een concentratie van de werken van 10 µM ROCK-remmer in elk gerecht toevoegen.
   Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang voor het voortbestaan van jejunum culturen maar is optioneel voor dikke darm.
6. Zet de schotel van elke cultuur in een 37 ° C en 5% CO₂ incubator voor 24 tot en met 72 h (Figuur 1).

5. bereiding van de cellen van de EG gehele cel electrofysiologie

1. Lijn de binnendiameter van de Microscoop fase met twee 5 x 0,5 cm stroken van wax film maken van een O-ring. Monteer de schotel cultuur 35-mm cel binnen de O-ring (Figuur 2A-B).
2. Spoel zowel zwevend puin, zoals niet-vastgemaakte extracellulaire matrix of dode cellen en cultuurmedia serum volledig uit de buurt van EG cellen om te voorkomen hetzij uit belemmeren zegel vorming tussen de cel van de EG en de elektrode. Gebruik van de drie volgende opties om grondige cel wassen voldoende voor electrofysiologie:
   1. Optie 1: Uitwisseling van de oplossing is efficiënter in een lange kamer meer nog dan een circulaire kamer. Aangezien de EG-cellen werden gekweekt in ronde 35 mm gerechten, maken een kunststof elliptische invoegen voor de schotel.
      1. De toevoeging maken door 3D printen of frezen van de traditionele methoden. De insert we gebruikten werd gemalen van acryl kunststof met de volgende afmetingen (in mm): buitendiameter, 34,5; innerlijke ellips, 20 x 9; Hoogte uitwendig, 10; binnenste hoogte, 1.5; brug span, 3 x 3; brug van mijnen, 1.5; inlaat en uitlaat, 4 x 4.
      2. Verlaag het invoegen in de cultuur-schotel (Figuur 2A-B) en veilig naar de top van het podium van de microscoop met twee 0.15 tot 0,2 g stukken van het modelleren van klei gedrukt in 1.2 x 0.3 x 0,1 cm rechthoeken (Figuur 2A-C).
      3. Met een kunststof transfer pipette, Voeg langzaam extracellulaire oplossing aan de ene kant van de schotel (inlaat) terwijl het zuigen van de andere kant (stopcontact).
   2. Optie 2: Zonder een gemanipuleerde plastic invoegen, voeg extracellulaire oplossing overdracht Pipetteer van de ene kant van de schotel (inlaat) terwijl het zuigen van de overkant (stopcontact). Langzaam draaien de locatie van de Pipet van overdracht (bijvoorbeeld N tot en met E tot S) terwijl de spiegeling van de plaatsing van de naald aspiratie aan de overkant (bijvoorbeeld S naar W tot N).
   3. Optie 3: Jas extracellulaire matrix op rechthoekige coverslips in stap 1.3.3., en cultuur van de celsuspensie op deze coverslips in stap 4.4. Deze dekglaasje aan overbrengen in een rechthoekige kamer gevuld met extracellulaire oplossing, weglaten stap 5.1 en 5.3 stap overslaan. Spoel de kamer met de extracellulaire oplossing van een kunststof transfer pipette, zoals beschreven in optie 1 (5.2.1.3).
3. Opnieuw aansluit het podium met de cultuur van de cel boven de omgekeerde Microscoop (Figuur 2D). Incubeer de EG celcultuur in serumvrij extracellulaire oplossing bij kamertemperatuur.
4. Na 4 uur, spoel de cultuur weer met extracellulaire oplossing zoals hierboven beschreven. Ga verder met de hele cel electrofysiologie.

6. de hele cel electrofysiologie EG cellen van primaire cultuur

1. Bereiken van een hele cel Giga-zegel
   1. Trek een dozijn elektroden naar een weerstand van 1-5 MΩ.
      OPMERKINGEN: Pipetten van 1 – 2 MΩ verzet dat de opbrengst van 10-100 GΩ zeehonden beste presteren. Fire polijsten van de elektrode tips is niet nodig om GΩ zeehonden.
   2. Jas gelijkmatig de neus kegel van alle pipetten met polymeer. Houd de pipet horizontaal op de grond en loodrecht op de voorzijde van een warmte-pistool. Langzaam draaien de pipet totdat het polymeer verhardt.
   3. Giet een aliquoot gedeelte van het intracellulaire oplossing in een conische buis 15 mL. Pipetteer 1.2 mL van deze oplossing in een tube van 1,5 mL microcentrifuge via 1 mL spuit. Trekken een ander 0,7 mL van intracellulaire oplossing in de spuit. Wegnemen van lucht uit het einde van de spuit. Hechten van een flexibele 34 G, 67 mm naald op de spuit, en spoelen van eventuele resterende lucht door deze naald.
   4. Identificeren van een Tph1-GVB + cell thats niet in contact met een andere cel of puin.
   5. Vul de elektrode-tip met intracellulaire oplossing. Aanvulling van de funderingsput de pipet door spuit. Zorgvuldig flick de pipet met een vingernagel om te verjagen de zeepbel air-interface.
   6. Met de plunjer opgesteld met 0.3 mL lucht, een 6 mL spuit aan de uitlaat van de houder van de buizen te koppelen. Monteer de elektrode in de houder.
      Opmerking: Sluit de spuit om de buis voordat de elektrode de bad-oplossing treedt te handhaven van neutrale of positieve druk binnen de intracellulaire oplossing vóór de afdichting.
   7. Laad een tweestaps spanning-clamp-protocol die records steady-state activerend stromingen door een ladder van de spanning op de eerste stap en registreert de beschikbare stromingen door een interne spanning op de tweede stap. Open de zegel-test (5 mV bij 50 kHz).
   8. Lager de elektrode in de oplossing van het bad. Manoeuvreren met de micromanipulators, de elektrode tip in-plane met en direct horizontale uit de cel. Verdrijven de 0.3 mL van lucht van de spuit.
   9. Zachtjes gaan de elektrode horizontaal langs de x-as aan te raken van de cel. Kijk voor een kuiltje te verschijnen op de EG-cel en/of een toename in membraan weerstand op de zegel-test. Zo nodig passen de elektrode naar beneden langs de z-as en/of horizontaal langs de x-as, beweegt niet voorbij de middellijn van de cel.
   10. Toepassen van 0,1-0,2 mL zuig op de 6-mL spuit. Houd de plunjer gestage totdat 100 MΩ is bereikt, dan greep uit de plunjer vrijgeven. Wacht totdat de cel giga-zegel. Koppel de spuit met een inbus beweging voorzichtig los.
       Opmerking: Als een EG-cel in eerste instantie niet verzegelen doet, het mogelijk te verzegelen het opnieuw met een volgende poging. Om dit te doen, Trek voorzichtig aan de elektrode uit de buurt van een EG-cel met < 20 MΩ zegel weerstand. Besturing van de verbruikte elektrode met de micromanipulators, rond de gerichte EG cel handmatig duidelijke weg matrix of puin. Dan, proberen te verzegelen van de cel van de EG met een verse elektrode.
2. Record hele cel spanning-gated nb⁺ huidige.
   1. Hechten van een 3 mL spuit opgesteld met 0,5-1,0 mL lucht. Een snelle Tik van zuiging van toepassing (0,1-0,5 mL) op een 3 mL spuit. Herhaal totdat de hele cel toegang wordt bereikt, dan voorzichtig het verbreken van de spuit.
      Opmerking: als de prestaties van een spuit kan aanvankelijk variëren en geleidelijk met de tijd en gebruik, praktijk vooraf met de 3 mL spuit (verzegeling het einde met een wijsvinger veranderen) om ervoor te zorgen dat de plunjer zal terugslag binnen 0,1-0,2 mL van de langetermijnproblemen plaats. Als dat niet het geval is, dan wisselen de spuit voor een nieuwe.
   2. Schadeloosstelling van de capaciteit van de hele cel inschakelen. Aanpassen precisiecapaciteit en serie weerstand. Serie weerstand compensatie inschakelen. Aanpassen met vertraging ingesteld op 60 ms, voorspelde dan gecorrigeerde serie weerstand compensatie. Sluit de test zegel.
   3. Het opnemen van een gemiddelde van 5 punten van geheel-cel spanning-gated nb⁺ huidige (Figuur 3A).
   4. Snel neem nota van twee parameters van spanning-gated nb⁺ huidige: de spanning aan venster huidige (Figuur 3B, rode symbolen, het snijpunt van activering en inactivering curven van de stationaire toestand) en de huidige piek nb⁺ dichtheid.
      Opmerking: De cellen van de EG met piek nb⁺ stromen meer dan-50 pA in spanning klem modus vaak gaat op aan het vuur ontlokte potentieel in huidige modus van de klem. Bovendien stromingen groter dan-200 pA in spanning klem (Figuur 3A) dan meestal brand actie potentieel spontaan in huidige klem van membraan potentieel (rode lijn, Figuur 3D) in de buurt van de spanning van de venster huidige (rode symbolen, Figuur 3B).
3. Record ontlokte actie potentieel.
   1. De serie weerstand compensatie uitschakelen. Uitschakelen van de externe opdracht. Overschakelen van de modus van V-clamp-clamp. Aanpassen van de winst. Het laden van een episodische huidige klem-protocol. Pas de hoeveelheid bedrijf huidige op 0 pA. Schakel de externe opdracht.
      Let op: Schakel niet van V-clamp-clamp (of omgekeerd) eerste zonder uit te schakelen de externe opdracht.
   2. Opmerking de rustpotentiaal membraan. Het huidige bedrijf input zodat de membraanpotentiaal onder het huidige venster leest aanpassen (bijvoorbeeld -80 te-100 mV). De episodische huidige klem protocol zodanig aanpassen dat het interval van de stap van huidige input is kleiner dan de waarde van het huidige bedrijf (Figuur 3C inzet, + 2 pA stappen voor-3 pA bedrijf huidige).
   3. Record ontlokte actie potentieel. Opmerking de minste hoeveelheid stroom geïnjecteerd om het vuur af een actiepotentiaal (Figuur 3C, vegen 3 van 5, een + 4 pA stap van-3 pA bedrijf = + 1 pA).
4. Record spontane actie potentieel.
   1. Uitschakelen van de externe opdracht. Een gap-vrije (niet-episodische) huidige klem-protocol laden.
      Opmerking: Zet niet de externe opdracht terug op totdat het bedrag van het huidige bedrijf in de huidige kloof-vrije klem-protocol is geverifieerd dat ze geschikt zijn voor de cel.
   2. Wijzigen van de huidige als de hoeveelheid stroom die geïnjecteerd in de laatste vegen in het elicited protocol dat deed een actiepotentiaal niet brand bedrijf (Figuur 3D, de huidige ingang tijdens de tweede sweep, een + 2 pA stap van-3 pA bedrijf =-1 pA).
   3. Schakel de externe opdracht. Controleer dat het huidige voorspelde bedrijf brengt de membraanpotentiaal de drempel tot de brand van een actiepotentiaal. Het huidige bedrijf aanpassen indien nodig. Record spontane activiteit.

Representative Results

Culturen:
Primaire lymfkliertest epitheliale cellen gemaakt van een transgene Tph1-GVB model hechten aan gerechten na 4 uur en zijn klaar voor fysiologische experimenten tussen 24 tot en met 72 h. Toen kweekomstandigheden had niet geoptimaliseerd, bestond de epitheliale celcultuur uit grote bosjes, drijvende cellulaire puin, beschadigde membranen en zwak signaal van het GVB in de cellen van de EG(Figuur 1). Culturen die zijn geoptimaliseerd voor electrofysiologie bestond uit afzonderlijke cellen en kleine bosjes. Gezonde EG cellen werden gemakkelijk geïdentificeerd door heldere GVB fluorescentie en had nog steeds vastgehouden aan de schotel na het krachtige wassen (Figuur 1B).

Elektrofysiologie:
EG hele cellen werden verkregen op slechts 15% van de ±4 van pogingen van de dikke darm culturen zonder ROCK inhibitor (29 hele cellen uit 182 pogingen van 22 culturen) maar 30% van de ±7 van pogingen van de dikke darm culturen met ROCK-remmer (27 hele cellen uit 102 pogingen van 50 culturen) (< C1 > figuur 4A; p < 0.05 door een niet-parametrische tweezijdige t-testen, dubbelpunt culturen zonder vs. met ROCK-remmer). Evenzo jejunum EG cellen zonder ROCK-remmer niet lang genoeg voor electrofysiologie overleven, terwijl EG hele cellen werden verkregen op 41 ±3% van pogingen van jejunum cultuur met ROCK-remmer (186 hele cellen uit 447 pogingen van 50 culturen) (figuur 4A; p > 0,05 door een niet-parametrische tweezijdige t-test, jejunum vs. colon met ROCK-remmer).

Door de hele cel electrofysiologie, werden nb⁺ stromingen geregistreerd in spanning-clamp modus en actie potentieel (AP) in current-clamp modus. NB⁺ stromingen werden geregistreerd van 81.3% van de ±4.0 van TPH1-GVB + cellen uit jejunum of 64,1% van de ±9.2 van dubbele punt³. Van 59 EG cellen uit jejunum culturen bevestigd door spanning-clamp hebben nb⁺ piek stromingen groter dan pA-25, 19 EG cellen in current-clamp modus ontslagen spontane AP ("spontane"), 29 EG cellen gestookte AP alleen wanneer ontlokte door een stap-protocol in current-clamp modus ("ontlokte-only") en 11 EG cellen niet brand AP spontaan of door stap protocol ("niet-vuren") (Figuur 4B). Spontane cellen had een gemiddelde piek nb⁺ stroomdichtheid (I_piek) van-108.0 ±19.3 pA/pF, ontlokte-alleen cellen had een ik_piek van-60.2 ±9.2 pA/pF, terwijl niet-vuren cellen had een ik_piek van-43.3 ±14 pA/pF (Figuur 4 B; p < 0,05, spontane vs. alleen-ontlokte of niet-vuren groepen; p > 0,05 alleen-ontlokte vs. niet-vuren groepen). Het verschil in huidige dichtheden waren niet een weerspiegeling van de capaciteit van de hele cel, als de spontane (3.3 ±0.2 pF), ontlokte-alleen (2.9 ±0.2 pF) en niet-vuren (3.1 ±0.3 pF) cellen had soortgelijk geheel cell capacitances (P > 0,05). EG cel nb⁺ stromingen en ontlokte AP waren gevoelig voor [nb⁺]_o concentratie en nb_V1.3 remming³.

Figuur 1 : Representatief aantal cultuur resultaten. DIC met epifluorescence beelden van een primaire epitheliale jejunum cultuur van een muis Tph1-GVB vergulde op een glazen bodem schotel en gekweekte gedurende 24 uur. Deze twee beelden tonen een aantal resultaten van de cultuur van dit protocol. GVB fluorescerende cellen (wit) zijn enterochromaffin (EG) cellen. (A) representatieve afbeelding van een cultuur die is slechte kwaliteit voor electrofysiologie. De cultuur bestaat uit grote bosjes, beschadigde cel membranen, lage fluorescentie signaal en drijvende groepen van dode cellen. (B) representatief beeld van een cultuur die is geoptimaliseerd voor electrofysiologie. Cultuur bestaat voornamelijk uit één, gezonde cellen en kleine bosjes die hebben gehouden aan de plaat. EG cellen in deze cultuur onderhouden een sterke fluorescentie-signaal. Schaal bar = 100 µm; panelen zijn schaal 1:1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Voorbereiding van cel culturen voor electrofysiologie. Een strategie voor efficiënt en grondig spoelen van EG celculturen met serumvrij extracellulaire oplossing is van cruciaal belang voor het verminderen van de extracellulaire matrix en serum die zegel vorming zou belemmeren. (A) materialen. Vanaf linksboven met de klok mee: podium, twee 5 mm brede stroken van wax film, twee stukken van de 200 mg voor het modelleren van klei, kunststof transfer pipette, #5 pincet, elliptische opname chamber, 35 mm cultuur schotel met glazen bodem. (B) houden wax film aan de binnendiameter van de fase lager de elliptische zaal in de cultuur-schotel en afvlakken van de klei in rechthoekige reepjes. (C) zachtjes druk op de schotel van cultuur in de wax film omzoomde fase en immobiliseren van de kamer van de opname door de modellering klei uit te rekken over de rand van de schotel, uit de zaal naar het podium. Spoel EG cellen met verschillende volumes van extracellulaire oplossing. (D) terugkeer de etappe naar de montagebeugels boven de omgekeerde Microscoop. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Representatief electrofysiologie resultaten. (A) hele cel nb⁺ stromingen, opgenomen door een tweestaps spanning-clamp protocol (inzet). 50 ms depolarizations van-120 mV activeren kanalen tijdens stap 1 (●), terwijl een verdere depolarisatie op 0 mV tijdens stap 2 (○) activeert kanalen die nog niet had geïnactiveerd (dat wil zeggen, zijn nog steeds beschikbaar om te openen). Rode trace, huidige ontlokte door spanning stappen van-120 -40 op 0 mV. (B) stroom-spanning relatie van piek nb⁺ stromen van paneel A, stap 1 (●, steady-state activering) of stap 2 (○, inactivatie van de stationaire toestand). Het snijpunt van de steady-state-activering en inactivatie-Curven toont een klein venster huidige op -40 mV (rode symbolen). (C) actie potentials ontlokte door depolarizing huidige prikkels. Een actiepotentiaal kan brand verleden 0 mV (grijze lijn) wanneer de membraanpotentiaal de spanning van nb⁺ venster huidige bereikt (rode lijn, -40 mV). Inzet, current-clamp protocol, waarin de 0 tot + 8 pA voor 50-ms depolarizations vanaf een basislijn van -3 werd geïnjecteerd pA. (D) actie potentials vuur van atop spontane gebeurtenissen die hebben depolarized aan -40 mV. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 : Doorvoer van hele cel electrofysiologie. (A) gemiddelde percentage van hele cellen per poging voor n dagen werk bij afwezigheid (-) of (+) aanwezigheid van ROCK-remmer (10 µM). EG cellen uit jejunum overleven 24u in cultuur zonder ROCK inhibitor niet. (B) nb⁺ huidige dichtheden gemeten in spanning-clamp uit n EG cellen, waarin actie potentials deed niet brand (Non-vuren), afgevuurd alleen wanneer ontlokte door een episodische current-clamp-protocol (Dit is een alleen-Elicited), of spontaan in brand gestoken in de kloof-vrije current-clamp modus (spontane) (foutbalken zijn SEM). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Volledig inzicht in functie van de cel EG vereist een kwalitatief hoogwaardige primaire cultuur-methode voor het genereren van cellen voor hele cel electrofysiologie. Primaire culturen van GI epitheel had van oudsher moeilijk als gevolg van lage overleven. Deze storende factor te verlichten, levert de huidige methode culturen van enkelvoud EG cellen uit kleine of grote darm die kunnen overleven voor meerdere dagen.

Wij vonden dat essentieel is voor de verbetering van de kwaliteit van culturen geschikt voor electrofysiologie waren: (1) het omkeren van de mucosa in plaats van peeling het, (2) het toevoegen van een kleine hoeveelheid BSA aan de media van de spijsvertering en FBS aan de voedingsbodems, (3) verlaging van de Collagenase XI de concentratie, (4) aanpassing van de duur en de intensiteit van mechanische agitatie om het aantal te verhogen en de gezondheid van de afzonderlijke cellen, (5) de extracellulaire matrix in een lage concentratie, en (6) kweken met ROCK-remmer plating.

Ook de volgende aanpassingen waren kritisch voor het verkrijgen van hele cellen terwijl patch klemmen: (1) grondig spoelen de culturen met serumvrij extracellulaire oplossing, (2) laten de EG cellen staan in de extracellulaire oplossing voor ten minste 4 uur, (3). elektroden-achtige purposing opnieuw een uitgegeven die van mislukte zeehonden-om duidelijke weg puin onderweg naar de volgende EG-cel, (4) toe te voegen 10 µM Gd^{3 +} aan de extracellulaire oplossing te blokkeren lek stromingen (indien aanwezig) en te vergemakkelijken van de hechting van zoogdiercellen suspensies met glas. Wij waarschuwen echter dat Gd^{3 +} spanning-gated Ca^{2 +} en/of mechanosensitive kanalen uitgedrukt in cellen van de EG blokkeren kan.

Ondanks de kweken voorwaarden hebben zorgvuldig worden geoptimaliseerd, we vonden een paar beperkingen: EG cellen moeten 24 uur volledig hechten maar vervallen na ~ 72 h in cultuur; Daarom hebben ze een 48-urige venster wanneer ze geschikt voor elektrofysiologische experimenten zouden. Omdat de cellen vaak samengeklonterd introduceren precisiecapaciteit transiënten die niet kunnen worden vergoed uit opnamen, generatie van één EG-cellen zijn van cruciaal belang. Echter door de EG cellen scheiden van het epitheel, de cellen dan leven in een omgeving van uitheemse (d.w.z., hoge glucose media met foetale runderserum en ROCK-remmer bovenop de extracellulaire matrix als een kunstmatige kelder membraan) en kon reageren functioneren in vivoop prikkels niet volledig representatief voor EG-cel. Ondanks deze beperkingen biedt de primaire kweken van EG cellen nog steeds inzicht in hun fysiologie.

EG-cellen spelen een cruciale rol bij het handhaven van een goed functionerende GI darmkanaal en het lichaam, en als zodanig, zijn er vele methoden ontwikkeld om een inzicht over EG cel electrofysiologie. Enteroendocrine en EG cel electrofysiologie werd onderzocht in vereeuwigd cel modellen^5,8,13, primaire celculturen van de EG van cavia¹¹, en muis^3,4, onze methode maakt gebruik van cel kwaliteit-bewarende methoden voor het maken van een cultuur die minimaal is verwerkt en weerspiegelt de oorspronkelijke EG-cellen. We gebruiken een transgeen muismodel, Tph1-GVB, waarin een cyaan fluorescentie in het cytoplasma wanneer Tph1 aanwezig^{9 is}. Deze methode kan ook worden gebruikt voor andere verslaggever of afstamming-getraceerd enteroendocrine celtypes. Onze methode brengt ook de isolatie van afzonderlijke cellen van de EG in minimale tijd en enzymatische behandeling, zoals de cellen worden alleen blootgesteld aan een zachte Collagenase XI bij een minimale maar effectieve concentratie van 0,1 mg/mL (jejunum) en 0,6 mg/mL (dubbele punt) voor minder dan een uur. Het resultaat van deze wijzigingen is een cultuur die is geoptimaliseerd voor elektrofysiologische studies van de EG-cellen.

We hebben met succes gebruikte deze methode om te studeren elektrofysiologie en serotonine vrijlating in lymfkliertest EG cellen³. De mogelijkheid om met succes isoleren, identificeren en cultuur één EG cellen belangrijke toekomstige aanwijzingen in studies over EG celfysiologie vergemakkelijkt. Deze methode kan worden gebruikt om verder het bepalen van kritische trajecten en kanalen die betrokken zijn in de EG cel exocytose van serotonine en andere EG cel-specifieke zenders. De methode kan ook worden gewijzigd om te isoleren en karakteriseren van de Fysiologie van de menselijke cel van de EG samen met het gebruik van acridine oranje voor identificatie¹³van de cel van de EG.

Zoals met de meeste wetenschappelijke protocol ontwikkeling, waren communicatie en onbevooroordeelde opmerkingen cruciaal voor het oplossen van dit protocol. Wanneer we testten de nieuwe cultuur-methoden voor het voortbestaan van onze culturen, was het nuttig voor het aantal fluorescerende cellen tellen als een maatregel van levensvatbaarheid, cel dichtheden in elk schotel en verzamel representatieve foto's en video's van de culturen uit de vele tijd schatten punten. Nadat de cellen overleven voorbij 24 uur in cultuur konden, werkten we aan het wijzigen van onze culturen voor electrofysiologie experimenten. Samen met het verzamelen van beelden en gedetailleerde opmerkingen, was het belangrijk om duidelijke communicatie tussen lab personeel met betrekking tot de aanpassing van mechanische spijsvertering en aanvulling en/of substraat concentraties, zodat gezonde EG cellen klaar waren voor de karakterisering van het elektrofysiologische.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm x 15 mm culture dish	Corning (Falcon)	351029
Transfer Pipette	Fisherbrand	13-711-7M
10 mL serological pipette	Corning (Falcon)	357551
50 mL Conical	Corning (Falcon)	352098
15 mL Conical	Corning (Falcon)	352097
1,000 mL Barrier Pipet Tips	Thermo Scientific (Art)	2079E	Keep sterile
MatTek Glass Bottom Dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Keep sterile
Micro-dissection Forceps - Very Fine, Extra-Long Points	Fine Science Tools	SB12630M
Surgical Scissors-Sharp	Nasco	14002-14
Micro-Dissection Scissors	Nasco	SB46568M
Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX	Covidien	8881250172
Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice	Jackson	Stock # 028366	Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm)	World Precision Instruments	MF34G-5
Parafilm "M" Laboratory Film	Pechiney Plastic Packaging
R6101	Dow Corning
6 mL syringe with regular luer tip	Monoject
3 mL syringe with regular luer tip	Monoject
Electrophysiology Equipment
Amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B
Data acquisition system (daq)	Molecular Devices	Digidata 1440A
Signal conditioner	Molecular Devices	CyberAmp 320
Software	Molecular Devices	pClamp 10.6