Epididymal 단백질 합성 및 분 비의 분석

모든 포유류 종의 정 충 취득 표시 앞으로 진보적인 운동 잠재력 epididymis 수 남성 외 고환 덕트 시스템의 전문된 영역을 통해 그들의 장기 하강 동안 한 ovum를 기름 지 게 (종)에 따라 이동 7-14 일¹. 아버지 chromatin의 극단적인 응축 및 testes에서 정 충의 cytodifferentiation와 함께 제공 되는 세포질의 대부분의 흘리기, 그들의 후속 기능 성숙의 상호 작용에 의해 독점적으로 구동 됩니다. 와 함께 epididymal microenvironment. 이 환경, 차례 차례로, 라이닝 epididymal 소마의 분 비 및 흡수 활동에 의해 만들어지고 세그먼트 세그먼트 변형¹의 뛰어난 수준을 표시. 따라서, 단백질 합성 및 분 비 활동적인 세그먼트 epididymis (즉, 증 류 및 코 퍼스)²의 근 위 부분에 있는 있습니다. 이 활동 거울 기능 능력의 표시 셀 첫 처음으로 정 충의 기능 프로 파일 (즉,., 진보적인 운동 및 산 solubilized zona glycoproteins 바인딩할 수) 다음 그들의 caput epididymis³통로입니다. 이러한 기능적인 특성 정자 도달 원심 epididymal 세그먼트 (cauda), 어떤 점에서 그들은 사정에 대 한 준비에는 무부하 상태에 저장 됩니다로 서 최적의 수준에 도달 하기 전에 개발을 계속 합니다. 형성 및이 정자 저장 저수지의 유지 보수는 라이닝 상피는 cauda에서 강한 흡수 활동^4,5에 의해 지배 되는에 또한 밀접 하 게 연관 됩니다. 비록 해부학 적 차이 보고^6,7,8, 이러한 지역적인된 분업이 나타납니다 포유류 종의 대부분 공유 되 epididymis의 특성 날짜, 우리 자신의^9,10를 포함 하 여 공부 했다. 실제로, 임상의 관점에서 그것은 알려져 그 epididymal 부전 남성 요인 불 임¹¹, 따라서이 전문된 조직의 규칙을 이해의 중요성을 강조 표시의 병 인에 중요 한 기여를 하 게.

그것은 그러므로 유감 epididymal 생리학의 우리의 이해 및 정자 성숙 및이 조직 내에서 스토리지의 순차적 단계를 조절 하는 메커니즘 완전 해결 될 남아 있다. 기여 요인 들 중 epididymal 연구에서 제한 발전이 조직의 전반적인 복잡성과 규제 제어할 자사의 luminal microenvironment 메커니즘의 지식이 있습니다. 해부학, 우리는 caput, 코 퍼스 및 cauda 세그먼트의 구별을 넘어는 epididymis 여러 영역 (그림 1A)로 더 세분화 될 수 있습니다, 알고 각 septa¹² 으로 구분 하 고 개별 프로필 유전자/단백질의 특징 식^{13,14,15,,1617,18}. 실제로, 상세한 transcriptional 프로 파일링에 epididymis 단편 유전자 발현의 기준으로 6 하 고 9 가지 epididymal 영역 각각^19,20마우스와 쥐 모델에서 보고 되었습니다. 이러한 복잡성은 아마도 epididymal 소마, 수많은 다른 세포 유형; 구성 pseudostratified 상피의 구성 반영 각 관의 길이 따라 그들의 풍부, 유통 및 분 비 흡수 성 활동에 대해 서로 다른. 따라서, 주 세포는 지금까지 가장 풍부한 epididymal 셀 유형 구성 모든 상피 세포의 80% 이상. 따라서, 주 셀 epididymal 단백질 생 합성 및 분 비⁵의 대량에 대 한 책임이 있습니다. 대조적으로, epididymal 소마 내에서 두 번째로 가장 풍부한 셀 형식으로 순위, 명확한 세포 인구는 주로 luminal 구성 요소의 선택적 흡수와이 microenvironment⁵의 산성화에 참여. 복잡성의 또 다른 계층을 추가, androgens 및 다른 lumicrine 요인 고환 근원의 이러한 epididymal 종류의 세포는 따라 그들의 위치에 따라 각 차동 제어를 발휘 한다.

이러한 복잡성에 의해 부과 된 한계에도 불구 하 고 뜻깊은 침해 epididymal 함수의 기계적으로 해결로 만들 수 계속. 이러한 연구를 키 고급 질량 분석 전략의 응용 프로그램 이러한 초기 설문 조사 중에서 선택 하는 개별 단백질의 상세한 분석에 epididymal 프로테옴의 대규모 재고 설정 되었습니다. 이 방법의 그림은 마우스 모델²¹에 mechanoenzymes의 DNM 가족의 우리의 최근 특성화. DNM에 우리의 초기 관심 및 endocytotic 프로세스의 결합에서의 듀얼 액션에 의해 연료 했다. 이러한 관측에 건물, 우리 DNM (DNM1-DNM3)의 세 정식 isoforms 높은 마우스 epididymis 표현 되며 단백질 분 비 및 흡수^{21에서 규제 역할을 수행 하기 위해 적절 하 게 위치를 보여줄 수 있었다} . 또한, 우리 수 있었다 명확 하 게 그들의 세포질 부 세포 현지화 기준 각 DNM isoform를 차별화 하는 따라서 그들은 보완, epididymal 상피²¹내 중복 활동 반대로 소유 제안.

우리가 희망이 정보 대체 epididymal 단백질의 특성에서 광범위 한 응용 프로그램을 찾을 것입니다 및 따라서 기여할 마우스 epididymis DNM 식의 연구에 대 한 고용 실험 방법론을 설명 하는 여기, 우리의 남성 생식 관의이 중요 한 요소의 기능의 이해. 특히, 우리는 면역 형광 라벨 파라핀 끼워 넣어진 epididymal 섹션에서 대상 단백질과 면역 형광 검사를 통해 이러한 단백질의 공간 배급의 후속 검색에 대 한 강력한 방법론의 개발을 설명 현미경 검사 법입니다. 우리는 더 격리 및 epididymosomes;의 특성화에 대 한 우리의 최근 최적화 된 프로토콜²² 문서 epididymal 분 비 프로필의 핵심 요소를 구성 하 고 정자 성숙²³홍보에 저명한 역할을 표시 하는 작은 exosome 같은 소포 상호 보완적인 접근, 우리 또한 설명 하는 불멸 하 게 마우스 caput epididymal 상피 (mECap18) 셀 라인에서 대상 단백질의 면역 형광 탐지 및 epididymal의 규정을 탐험 하는 모델로이 리소스를 사용 하 여 분 비 활동 체 외

동물 조직 컬렉션을 포함 하는 모든 실험 절차는 뉴캐슬 대학 동물 관리 및 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 면역 형광 염색 파라핀 끼워 넣어진 Epididymal 섹션 (그림 1 및 2)의

1. CO₂ 흡입 (스위스 쥐, 8 주 이상)를 통해 성인 쥐의 안락사, 직후에 신중 하 게 (를 사용 하 여 수술가 위, 핀셋) epididymis 해 부의 결합 조직 및 지방 overlying 자유롭고 Bouin의 정착 액에 젖어 솔루션 (> 10 배 볼륨/조직 무게) 야간 고정을 위한.
2. 2 일 동안 매일 2 × 변화 70% 에탄올과 조직을 세척 하 고 탈수 등급된 에탄올 (70%, 95% 및 100%)를 통해 침투 하 고 파라핀 블록으로 삽입에 대 한 준비.
3. 섹션 4-6 µ m 및 면역 형광 염색을 위한 준비에서 슬라이드에 한 두께에 파라핀 블록.
4. 증기 두건에서 epididymal 파라핀 섹션을 완전히 조직 섹션 (3 × 5 분 각 시간) 담가 슬라이드 항아리에 크 실 렌의 충분 한 금액을 추가 하 여 dewax.
5. 순화 된 H₂O 희석 등급된 에탄올 솔루션에 침수에 의해 조직 단면도 rehydrate (100% 에탄올 5 분, 100% 에탄올 5 분, 1 분, 80% 에탄올 1 분, 70% 에탄올 90% 에탄올 1 분, 그리고 50% 에탄올 1 분).
6. 슬라이드 단지 충분 한 버퍼링 인산 염 분 완전히 몰입할 전체 조직 섹션 (PBS)와 5 분 동안 한 번에 섹션을 세척 (모든 후속 세척에 대 한 이러한 지침을 따르십시오).
7. 적절 한 항 원 검색 솔루션을 가만히 따르다 (즉., 10 mmol/L 나트륨 시트르산, 50 mmol/L 트리 스 pH 10.5 또는 다른 항 원 검색 솔루션, 검색 항 원에 따라) 슬라이드 랙 및 끓는까지 마이크로파에. 이 솔루션으로 슬라이드를 담가 그리고 열 유발 항 원 검색 조건 ( 표 1참조) 개별 항 체에 대 한 최적화 된 조직 단면도 주제.
   주의: 슬라이드 antigen 검색 과정에서 항 원 검색 솔루션에 완전히 몰입 하 확인 하십시오.
8. 실내 온도에 전자 레인지와 멋진 슬라이드 컨테이너를 제거 합니다.
9. PBS와 슬라이드를 헹 구 고 추적에 액체 방수 제 슬라이드 마커 펜을 사용 하 여 조직 섹션 주위.
10. (컨테이너의 기지에서 moistened 조직에 의해 생성), 습도 컨테이너에 슬라이드를 놓고 차단 솔루션 적용 (3 %BSA / PBS, 이전 필터링 0.45 μ m 필터를 통해) 37 ° c.에 1 시간에 대 한
11. PBS 한번 슬라이드 린스.
12. 필터링 된 1%에서 실험적으로 최적화 된 농도를 희석 하는 적절 한 기본 항 체와 섹션을 품 어 하룻밤에 4 ° C에서 BSA/PBS (1:60 안티-DNM1, DNM2 및 DNM3에 대 한 항 체, 안티-ATP6V1B1 항 체에 대 한 1: 100 테이블의 자료를 참조 항 체 세부 사항을 위해).
    참고: 구별을 일반적인 항 체 바인딩에서 특정 그것은 엄격한 네거티브를 포함 하는 데 필요한 (즉., 이차 항 체만, 1 차 항 체 펩 티 드 면역에 대 한 preabsorbed)와 긍정적인 컨트롤²⁴.
13. 30 분 동안 실내 온도에 배치 하 여 슬라이드를 rewarm.
14. 씻고 10 분 떨고 플랫폼 (60 rpm)에 PBS 가진 슬라이드 3 ×.
15. 1%에 희석 적절 한 이차 항 체와 섹션을 품 어 BSA/PBS (0.45 μ m 필터를 통해 필터링) 1 시간 동안 37 ° C에서 (1:400 희석 모든 이차 항 체에 대 한 항 체 세부 정보에 대 한 재료의 표 참조).
    주의:이 단계 이후부터 어둠 속에서 슬라이드 컨테이너를 유지. 듀얼 라벨에 대 한 2 차 항 체의 호환 조합을 선택 (즉., 2 차 항 체 종에서 제기 되었습니다 해야 합니다).
16. 씻고 10 분 떨고 플랫폼 (60 rpm)에 PBS 가진 슬라이드 3 ×.
17. Propidium 요오드 화물 (PI, 7.48 μmol/L) 또는 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4.37 μmol/L) 세포 핵을 실 온에서 2 분에 대 한 섹션 counterstain
18. 5 분 동안 떨고 플랫폼 (60 rpm)에 PBS 가진 두 번 슬라이드를 씻어.
19. 10 %4-88 Mowiol 0.2 mol/L 트리 (pH 8.5)에 30% 글리세롤의 솔루션에 준비 섹션을 탑재 및 2.5 %1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-옥 탄.
20. 손톱 광택 coverslip 봉인 하 고 미래 관측을 위해 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다.
    주의: 그것은 이미징 슬라이드의 즉시 실용적인 형광의 과도 한 손실을 방지 하기 위해 준비 후 수행 하 고 좋습니다.

2 절연 마우스 Caput Epididymis (그림 3)에서 Epididymosomes의

1. CO₂ 흡입 (스위스 쥐 8 주 이상)를 통해 성인 쥐의 안락사 후 즉시 (미리 예 열 37 ° C에) epididymal 조직의 혈액 오염을 최소화 하기 위해 PBS를 가진 그들의 맥 관 구조를 perfuse.
   주의: 혈장 epididymosomes²⁵비슷한 크기의 exosomes의 다양 한 인구를 포함 합니다. Epididymal 조직에서 혈액 클리어런스의 효능을 액세스할 수 있는 초기 세그먼트의 검사를 통해 매우 vascularized epididymal 세그먼트 caput 세그먼트에 인접 위치 (즉,., 그림 1A에서 1 영역)
2. 조심 스럽게 표면에 대 한 가능성을 줄이기 위해 overlying 및 결합 조직, 지방과 린스 수정 Biggers, Whitten, 및 Whittingham 매체 (BWW; pH 7.4, 300 mmol/kg 물^26,27의 osmolality) 무료로 epididymis 해 부 혈액 오염입니다.
3. 오 점 제거 초과 미디어, 해 부 caput epididymis epididymal 조직 (즉., 2-5에서 그림 1A지역) BWW 매체를 포함 하는 신선한 페 트리 접시 (35 × 10 m m)에 전송. 매체의 양은 최종 복구에 대 한 충분 한 인지 확인 합니다.
   참고: 6 caput epididymides, 그것 것이 좋습니다 ~ 900 µ L 넣고 균일 하 게 분할 (단계 2.9 참조) 2 미리 준비 된 기온 변화도의 위에 적용의 복구에 대 한 허용 하는 매체의 1.1 mL를 사용 하.
4. 면도날으로 caput 조직으로 작은 incisions의 번호를 확인 합니다. 조직 말하다 하지 고 따라서 과도 한 cytosolic 내용으로 샘플을 오염 하지 마십시오. Luminal 내용을 공개 30 분 동안 37 ° C에서 온화한 동요와 조직을 포함 하는 접시를 품 어.
5. 세포질 파편을 제거 하려면 70 µ m 세포 막을 통해 결과 정지를 필터링 합니다.
6. filtrate 수집 및 세포질 파편을 제거 하기 위하여 속도 증가 함께 4 ° C에서 연속 원심 분리 단계에이 대상 (즉,., 500 × g, 2000 × g, 4000 × g, 8000 × g, 5 분 각; 17000 × g 20 분, 그리고 마지막으로 17000 × g 추가로 10 분 또는 아무 펠 릿은 원심 분리 후 형성 될 때까지).
   주의: 그것은 최소한의 혈액 오염 존재가 되도록 초기 500 × g 원심 분리 단계 후 펠 릿의 색상을 평가 하는 것이 중요. 이 펠 릿 핑크 채색을 표시 하는 모든 샘플을 삭제 합니다.
7. 0.25 mol/L 자당 및 10 mmol/L 트리 (pH 7.5)의 솔루션 (60% (w/v) 수성 iodixanol 함유) 밀도 그라데이션 매체를 diluting 하 여 불연속 iodixanol 그라데이션 (구성 된 40%, 20%, 10%, 5% 레이어)를 준비 합니다.
8. 450 µ L (그림 3)의 각 일부와 ultracentrifuge 튜브 (11 × 35 m m), 그라디언트를 준비 합니다. 시각 인터페이스는 성공적으로 epididymal 액체 샘플을 로드 하기 전에 각 계층 사이 형성 되도록 각 분수의 신청 후 그라디언트를 검사 합니다. 그러나 각 그라데이션 신선한 사용, 당일 준비, epididymal luminal 액체 샘플 로드 전에 최대 2 h 4 ° C에서 보존 될 수 있습니다.
9. 신중 하 게 epididymal luminal 유체 (3 epididymides caput에서 수집 된 자료에 해당) 꼭대기의 중단 한 그라데이션의 450 µ L를 추가 합니다.
10. Ultracentrifuge 18 h 4 ° C에서 160000 × g 에서 그라디언트.
    주의:이 원심 분리는 매우 높은 속도에서 실시 하 고, 이후 모든 ultracentrifuge 튜브 한 쌍이 고 정확 하 게 균형 있습니다. 그들은 그들의 무결성을 손상 시킬 수 있는 어떤 보이는 손상을 무료 수 있도록 튜브를 확인 하십시오.
11. (각각 185 µ L의 구성 된) 12 동등한 분수 제거 최상위 계층에서 시작 하 고 그라데이션의 하단 쪽으로 진행. 등가 분수는 해당 하는 경우 각 그라데이션에서 복구 (최대 2 개의 그라디언트) 수영장.
    주: epididymosomes는 가장 높은 분수 9-11²², 농축 마우스 그림 4 와 토론을 참조 하십시오.
12. 복구 및 분수 9-11의 풀링 후 PBS, 그리고 ultracentrifuge의 2 개 mL로 희석 100000 × g h 3 4 ° C에서 (13 × 56 m m 튜브)를 작은 공의 epididymosomes에서 샘플.
    주의: epididymosome 펠 릿 볼 하기가 어려울 수 있습니다, 이후 그들은 회전자에 배치 하 고 튜브를 epididymosome 펠 릿의 기대 위치를 나타내는 표시는 튜브의 방향을 지적 했다 확인 하십시오. 각 튜브에 충분 한 볼륨 포함 되어 있는지 확인 (즉., 전체 용량의 50% 초과) 배제 관 붕괴의 위험에.
13. 신중 하 게 발음 하 고는 상쾌한 epididymosome 펠 렛을 방해 하지 않고 무시.
14. Epididymosome 순도 (그림 4)를 평가 합니다.
15. 다운스트림 응용 프로그램에 따라 원하는 매체로 epididymosome 펠 릿을 resuspend. 예를 들어, BWW 매체 공동 보육 정 충 또는 양자 택일로 SDS-PAGE를 통해 epididymal 프로테옴의 해상도 대 한 준비에 적절 한 세포의 용 해 버퍼와 관련 된 실험에 대 한 일반적으로 사용 됩니다.

3. 면역 형광 mECap18 세포의 얼룩

1. (셀 문화 후드에서 실시)을 살 균 coverslips의 준비
   1. 에탄올 램프 위의 높은 온도에서 건조 하 여 소독와 10 분 동안 70% 에탄올에 coverslips (12 × 12 mm)을 담근 다.
   2. 10 coverslip 쿨 s 12 잘 접시에 전송 하기 전에.
   3. 하는 coverslip 커버 하 고 실 온에서 10 분 동안 정착 멸 균 폴 리-L-리 신 솔루션을 적용 합니다.
   4. 폴 리-L-리 신 솔루션을 삭제 하 고 살 균 H₂O coverslip 린스 또는 적절 한 매체.
2. 준비 mECap18 셀
   1. 포함 하는 coverslips 12 잘 플레이트의 각 음에 2 × 10⁵ mECap18 셀의 aliquots 통로
   2. MECap18 셀 중간 (DMEM와 1 %L-글루타민, 1% 나트륨 pyruvate, 1% 페니실린/스, 50l μmol 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN 보충) 포함 10% 태아 종 아리 혈 청 (FBS) 분위기 5%에서 37 ° C 배양 기에서 셀 문화 CO₂ 하룻밤입니다.
   3. 일단 세포는 coverslip 준수, 매체를 삭제 하 고 PBS로 두 번 셀 린스.
   4. 충분 한 양의 4 %paraformaldehyde (PFA) 전체 coverslip 담가 15 분 동안 실 온에서 셀을 수정 하는 PBS에 희석을 추가 합니다.
   5. PFA 솔루션을 삭제 하 고 두 번 PBS에에서는 coverslips를 씻어.
3. 면역 형광 염색
   1. 0.1%에 침수에 의해 mECap18 세포를 permeabilize 10 분에 대 한 PBS에 트라이 톤 X-100.
   2. PBS 가진 coverslips 린스.
   3. 3 %BSA mECap18 세포를 차단 하 고 immunolabeling epididymal 조직 섹션에 대 한 설명에 해당 프로토콜을 이용 하 여 세포의 진행.

4. 조절된 세포 배양 매체에서 단백질의 격리

1. 배양 조건된 셀의 컬렉션
   1. 6의 각 음에 4 × 10⁵ mECap18 셀의 통로 aliquots mECap18 셀 중간 10% 보충 잘 접시 FBS 24 h에 대 한.
   2. 잔여 FBS 및 모든 관련 제거 하 mECap18 셀 매체 (FBS 없이 준비)와 mECap18 셀 세 번 씻어 단백질 오염 물질.
   3. MECap18 셀 매체 (FBS 없이 준비 하는)의 1.5 mL 각 잘 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 5%에서 12 h에 대 한 mECap18 셀으로 품 어 CO₂.
      참고:이 단계에서 mECap18 셀 실험적인 디자인에 따라 다른 대상 항 원에 대 한 평가 될 수 있다.
   4. 12 h 배양 후 셀 매체와 모든 세포 파편을 제거 하려면 10 분 2000 × g 에서 원심 분리기를 수집 합니다.
      참고: 외피의 기간 및 적용된 여야 하 셀의 허용 오차를 고려 하 여 실험 디자인/끝점 평가 따라 변경 될 수 있다. 최적의 결과 달성을 보장 하기 위해 특정 실험적인 regimens에 따라 보육의 타이밍을 조정 하는 것이 좋습니다.
   5. 표준 trypan 블루 제외 분석 결과²⁸의 응용 프로그램을 통해 mECap18 세포 생존 능력을 평가 합니다. 세포 생존 능력 90% 죽 었 거 나 죽어가는 셀에서 발표 하는 단백질에 의해 소개 하는 바이어스를 제거 하기 위해 거절 했습니다 모든 자료를 삭제 합니다.
   6. 다음과 같이 셀 중간에서 단백질을 분리 또는-80 ° c.에 매체를 보존
2. 단백질 절연 (증기 두건에서 실시)
   1. 80% 볼륨 조절된 세포 매체 교양된 mECap18 세포에서 발표 하는 단백질을 침전의 냉장된 100 %trichloroacetic 산 양의 20%를 추가 합니다. 지속적인 혼합으로 하룻밤 4 ° C에서 품 어.
   2. 부 화 후 원심 분리 하 여 침전 된 단백질을 펠 렛 (17, 000 × g, 10 분 동안 4 ° C).
      주: 매체에 분 비 될 것으로 예상 하는 단백질의 제한 된 수량에 따라 가능 하다는 펠 릿은 하지 쉽게 시각 수 원심 분리 후. 따라서 올바르게 이전에 원심 분리 관을 찾으시는 기대 펠 릿 위치는 상쾌한의 제거 하는 동안 방해을 않도록 주의 하는 것이 필수적 이다.
   3. 상쾌한 무시 하 고 두 번 다시 원심 분리 전에 냉장된 아세톤으로 펠 릿을 세척 (17, 000 × g, 10 분 동안 4 ° C).
   4. 조심 스럽게 제거 하 고 어떤 잔여 아세톤 증기 두건 내 공기 전에 상쾌한 삭제.
   5. 끝점 분석 완전 분 비 단백질 프로 파일 및/또는 개별 대상 단백질을 검출 하기 위한 준비에 적절 한 추출 버퍼에 단백질 펠 릿 resuspend (예., immunoblotting SDS 페이지).

그림 1 그리고 그림 2 마우스 caput epididymis DNM의 면역 형광 지역화의 대표적인 결과 보여줍니다. 각각 3 DNM isoforms의 디스플레이 별개 지역화 프로필 조사. 따라서, DNM1 (그림 2A) 초기 세그먼트 및 caput epididymis 걸쳐 epididymal 셀의 상대적으로 겸손 한 확산 라벨 특징 이다. 대조적으로, DNM2 isoform 처음 발견 되었다 초기 세그먼트에서 셀의 반대 기저와 꼭대기 테두리 주변 인접 한 다운스트림 caput 세그먼트 내의 셀에 supranuclear 도메인에 재배치 되 고 전에 (즉,., 지역 2-5) (그림 1B, C). 그러나 특히,, 점차적으로 라벨 DNM2의 강도 caput epididymis, 본질적으로이 epididymal 세그먼트21 (그림 1B, C)의 분 비 활동을 반영 하는 결과의 영역 2 ~ 5 사이 감소. 따라서, DNM2의 supranuclear 라벨 이후에 표시 했다 Golgi 기구 caput 주 셀21내에서 배포에 해당. 정 충 같은 epididymal 지역에서 고립 된 DNM2에 대 한 강렬한 acrosomal 라벨 보여주었다 (그림 1D). 그러나 경고로, 동등한 DNM2 라벨 하지 정기적으로 감지 되었습니다 우리의 조직 섹션에서 luminal 정 충에. 이 현상은 이다 우리가 몇 가지에 발생 한 경우 다른 epididymal/정자 항을 대상으로 하는 항 체의 범위를 적용 하 고 아마도에 마스킹 및 항 원 프레 젠 테이 션과 관련 된 문제로 인해 발생 합니다 파라핀 끼워 넣어진 조직 섹션입니다. 어떤 경우에, 이러한 차이 epididymal 조직 자체와 함께 고립 된 정 충의 병렬 immunofluorescent 라벨의 중요성 강조. DNM1와 DNM2에서 서로 다른 DNM3 isoform caput 상피 세포 (그림 2B, 녹색 화살표), 명확한 세포 하위 인구에 해당 하는 공동의 라벨에 표시 했다의 적은 수의 꼭대기 도메인에서 주로 검색 되었습니다. 인식 된 명확한 세포 표시, ATP6V1B1와 함께 (그림 2B, 빨간 화살표). 비슷한 방식으로, 다른 epididymal 상피 세포 유형으로 차별화 하는 데 적합 한 입증 된 대표적인 마커 표 229,,3031 에서 요약 된다 , 32 , 33 , 34.

Epididymal 상피 내에서 거주 하는 단백질의 subcellular 지 방화에 대 한 기술 설명, 뿐만 아니라 여기, 우리 또한 보고서 내에 캡슐화 하는 분 비 단백질의 연구에 대 한 우리의 최근 최적화 된 프로토콜 epididymosomes, 작은 세포 외 소포 luminal 환경 정자 성숙 및 스토리지22지원에 대 한 책임의 중요 한 구성 요소를 나타내는 결합, 단계 2 및 그림 3 마우스 caput epididymal 조직에서 epididymosomes의 매우 풍부한 인구의 절연에 사용 하는 방법론의 세부 단계 계정을 제공 합니다. 그러나 특히,, 이러한 방법을 더 원심 epididymal 세그먼트에서 발생 하는 epididymosomes의 대체 인구의 고립에 대 한 즉시 적용 됩니다. 이러한 샘플의 오염 위한 잠재력 때문 우리는 또한 우리가 일상적으로 각 epididymosome 준비를 위해 사용 하는 엄격한 특성화 프로토콜 설명. 크기의 평가 고해상도 전자 현미경 및 동적 산란 기법을 사용 하 여 epididymosome 인구의 포함 됩니다. 에 우리는 또한 평가 인정된 extracellular 소포 마커의 농축 단백질 잠재적인 오염 물질의 특성의 해당 부재 immunoblotting 전략을 활용 (즉,., 반대로 헤모글로빈 (HBB)으로 혈액 오염 및 안티 arachidonate 15-lipoxygenase (ALOX15) 및 세포질 드롭릿 및 정자 오염의 표식으로 안티 IZUMO1 항 체의 표식 각각)22. 비록 우리는 오염 물질 드물다, 그들이 발생 하는 경우 발견 즉시 우리 epididymosome 준비를 삭제 합니다.

Caput epididymis에 DNM isoforms의 겹치지 않는 지역화 epididymal microenvironment 통제에 있는 그들의 잠재적인 역할의 추가 조사를 자극. 이 목적을 위해 불멸 하 게 mECap18 셀 라인 epididymal 세포 분 비 활동 공부를 생체 외에서 모델으로 이용 되었다. 이 셀 라인의 이전 특성 그것 혼합된 셀 인구는 얼룩 중 주 또는 명확한 셀 표식에 대 한 긍정적인 항구 나타났습니다. 또한, mECap18 세포 또한 치료 regimens35다른 시험관에 아래 epididymal 유전자와 단백질 식의 생리 프로필을 보고 적당 한 입증 했습니다. 사용 전에 DNM 지역화 이러한 폴 리-L-리 신 대우 coverslips (그림 5A)에 정착 하 고 그들을 겪고 면역 형광 탐지 하 여 교양된 mECap18 셀에 평가 했다. DNM2 supranuclear의 도메인 내에서 이러한 세포 집중 동안 DNM3 개별 특징 이었다 DNM1 mECap18 세포의 세포질에 걸쳐 발견 되었다 caput epididymal 조직 섹션에 기록 된 분포 패턴 일치, 막 작은 하위 인구 숫자 얼룩의 포커스 (즉., 11%) 인 ATP6V1B1 mECap18 세포의 긍정적인 (그림 5B). 이러한 데이터는 DNM의 역할을 조사 하 고 epididymal 세포 분 비/흡수 활동을 조절에 대 한 귀중 한 자원으로 mECap18 셀 라인의 유틸리티를 긍정 한다.

따라서, 4 단계 mECap18 세포 분 비 활동의 분석을 위한 방법론을 설명 합니다. 광범위 하 게 다양 한 다른 실험 조건에 미치는 영향을 평가 하기 위한 의무가 있는 기술. 우리의 연구에서 우리는 DNM1 및 시각화 이전 DNM2의 활동 및 단백질 조절된 중간21로 mECap18 셀에서 발표 프로 파일의 정량화를 억제 하는 선택적 약리 개입 적용. 그러나이 분석의 중요 한 기능은, mECap18 셀은 철저 하 게 세척 하 고 FBS 보충의 부재에서 경작 했다. 이러한 단계 FBS 파생 단백질 조절된 매체의 오염 배제 필수적 이었다, 하는 동안 그것은 그럼에도 불구 하 고 mECap18 세포 성장 및 생존에 부정적인 영향을의 수행자 위험을 운반 합니다. 이 가능성에 대 한 제어, 우리는 mECap18 셀 라인 용납 FBS 무료 문화와 우리의 부 화 창 동안 DNM 억제제의 도입 지적 했다 (즉., 12 h). 실제로,이 시간 걸쳐 세포 생존 능력에 모든 실험 복제에 90% 이상 남아 있었다. 따라서이 방법은 유전자 조작 전략으로 투자에 투입 하기 전에 특정 epididymal 단백질의 기능을 식별 하는 유용한 개념 증명 전략 될 수 있습니다.

테이블 1 : Epididymal 섹션 파라핀 포함 사용에 대 한 열 유발 항 원 검색 최적화를 위한 일반 조건. 다른 epitopes는 종종 다른 고정 기법, 그로 인하여 이러한 방법론은 각 항 원에 대 한 최적화 된의 사용을 필요로 고정 프로세스 문제가 될 수 있습니다.

테이블 2 : 대표 마커 다른 기본 epididymal 상피 세포 유형의 탐지에 적합.

그림 1: 근 위 마우스 epididymis 내 공간 표현의 DNM 2. (A) 10 영역에 마우스 epididymis에 분할 육체적으로 묘사한 epididymis의 도식 모델 구분 septa 터너와 동료20에서 보고. 이 모델에서는 초기 세그먼트에 해당 하는 영역 1, 영역 2-5 caput epididymis 하, 코 퍼스 epididymis에 해당 하는 영역 6-7 및 해당 영역 8-10 cauda epididymis 대표. (B-C) DNM2의 면역 형광 지역화 영역-특정 메일 패턴을 (흰색 화살표 및 화살표 표시)을 공개 했다. 영역 1과 2 사이의 테두리 점선으로 구분 또는 노란 화살표로 표시 됩니다. (D) DNM2 정 충 caput epididymis에서 고립의 peri acrosomal 도메인도 표현 된다. 그러나, 이러한 얼룩 정기적으로 해당 epididymal 섹션에서 luminal 정 충에서 발견 되었다. ep, 상피 세포; l, 루멘. Neg, 이차 항 체만 제어 실험 3 동물에서 재료에 복제 했다 고 대표적인 면역 형광 이미지 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: DNM 1과 DNM 3 마우스 caput epididymis에서 면역 형광 탐지. (A) DNM136 의 지역화 마우스 caput epididymis에서 시험 되었다. (B) 공동 지역화의 DNM336 그리고 명확한 세포 마커, 마우스 caput epididymis에 ATP6V1B137 . 이 분석 확인 두 DNM3 (녹색 화살표)와 ATP6V1B1 (빨간 화살표) 명확한 세포 하위 인구에만 최소한의 하위 세포 중복 표시. ep, 상피 세포; int, interstitium; l, 루멘. sp, 정자; Neg, 이차 항 체만 제어 세포 핵 DAPI (파란색)와 counterstained 했다. 실험 3 동물에서 재료에 복제 했다 고 대표적인 면역 형광 이미지 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 마우스 caput epididymosomes의 농축에 사용 되는 격리 프로토콜의 도식. 해 부, 후 caput epididymal 조직 BWW 매체의 물방울에 몰입 하 고 출시 luminal 내용을 베. Luminal 액은 70 µ m 멤브레인을 통해 필터링 됩니다 고 결과 중지 작은 어떤 잔여 세포 파편 든 지 위해 속도 증가에서 centrifuged. 허가 정지 불연속 밀도 그라데이션 (iodixanol 솔루션)의 꼭대기 로드 그리고 하룻밤 ultracentrifugation에 복종 이다. 풀링되지 분수 9-11에 Epididymosomes 파티션을 PBS에 희석을 통해 세척 하 고 작은 공의 epididymosomes를 ultracentrifuge에 반환. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: epididymosome 순수성의 평가. 12 개의 동등한 분수 그라데이션 ultracentrifugation와 각각 (A) 단백질에 대 한 준비의 약 수 후 회복 했다 고 RNA 정량화, (B) 동적 산란, 및 를 사용 하 여이 평가 크기 (C). epididymosome 마커 분포의 immunoblot 분석. 추가 특성 단계 포함 (D) 듀얼-라벨 epididymosomes 알데하이드/황산 라텍스, (E) 전송 전자 현미경 검사 법 평가, 구슬과 정 충의 (F) immunoblot 평가에 집중의 (정자)와 안티-arachidonate 15-lipoxygenase (ALOX15, 세포질 방울/정자 오염) 또는 안티 헤모글로빈을 사용 하 여 적혈구 (RBC) 오염 (HBB, RBC 오염). Immunoblots 알려진된 epididymosome 화물 (26S 프로테아좀 비 ATPase 규제 소 단위 7, PSMD7, 열 충격 단백질 90kDa 베타 회원 1, HSP90B1; 및 베타 tubulin, TUBB) 또한 조사 했다. 이러한 데이터는 과학적 보고서에서 원래 간행 되었다 (PMID: 27549865) 여기 게시자, 스프링 거 자연의 허가로 재현 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: mECap18 셀에서 DNM isoforms의 면역 형광 탐지 공개 배포 caput epididymal 조직에서 감지 된와 함께 그 협정을 패턴. (A) 살 균 mECap18 세포 배양을 위한 coverslip 준비의 도식. (B) DNM epididymal 조직 섹션에서 감지 된 미러는 밝혀 세포 분포 패턴 (화살표와 인세트 (DNM3 및 명확한 세포 마커 ATP6V1B1의 이중 라벨)) 얼룩의 대표적인 면역 형광 이미지. 세포 핵 propidium 요오드 화물 (PI; 레드) 또는 DAPI (블루) counterstained 했다. 실험 3 동물에서 재료에 복제 했다 고 대표적인 면역 형광 이미지 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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