검색 및 Apoptotic 몸 높은 순도 절연

Apoptosis, 프로그램 된 세포 죽음의 잘 공부 형태를 생리 적 항상성 유지 하 고 인체¹내에서 잠재적으로 유해한 세포를 제거 해야 합니다. Apoptosis 유도 후 apoptotic 세포 (ApoCells) 일련의 형태학 적 변화를 받아야 하 고 ApoBDs 되 나 작은 막 도약 vesicles로 분해 수 있습니다. 전반적으로,이 과정 apoptotic 세포 분해로 알려져 있으며 형태^2,3에 따라 3 가지 단계로 나눌 수 있습니다. 단계 1 (플라즈마 멤브레인 blebbing) 풍선 모양의 구조 blebs^4,5로 알려진 세포 표면에 형성 특징 이다. 단계 2 (apoptotic 돌출 형성) apoptopodia, 파란색 apoptopodia 및 microtubule 스파이크^6,,78등 긴 막 돌출의 형성을 포함합니다. 마지막으로, 3 단계 (ApoBD 형성) apoptotic 돌출 ApoBDs^6,9를 생성 하는 ApoCells의 파편을 포함 한다. 이전 연구 결과 apoptotic 세포 클리어런스를 방 조 하 고 세포 통신을 중재에 ApoBDs의 역할을 제안 했다. 예를 들어 ApoBDs에는 ApoCell의 분열 식 세포^2,10,11을 둘러싼에 의해 쉽게 제거 될 수 있는 작은 ' 입 크기 ' 조각 생성 수는 제안 합니다. 또한, ApoBDs DNA, RNA 및 단백질, 셀 통신^12,,1314를 촉진 하기 위하여 주변 셀에는 인신 매매 수 등 생체의 일련을 항구 수 있습니다. 기능적으로이 프로세스를 조사, apoptosis 유도 및 ApoBD 형성의 유효성 검사 (i), (ii) ApoBDs, 절연 및 (iii) ApoBD 순수성의 확인을 포함 하 여 세 가지 주요 매개 변수를 확인 하는 생명 이다.

이전에, cytometry 등 전자 현미경 검사 법 방법의 수 ApoBDs^15,16,,1718apoptosis를 공부 하 고 사용 되었습니다. 그러나, ApoBD 검출 및 정량화는 종종 어려운 또는 간과. 가장 일상적으로 사용 되는 흐름 cytometry 기반 apoptosis 고용 annexin V를 시험 하는 예를 들어, (A5, 단백질은 외부화는 ' 먹고-나 ' 신호 phosphatidylserine (PtdSer))과 핵 산 얼룩 propidium 요오드 화물 (PI)¹⁹. 그러나,이 범용 얼룩 조합을 사용 하 여 분석 가정 샘플에서 셀 하위 (가능한 셀, ApoCells 및 회 저 성 세포)의 3 종류가 있습니다. 또한, 비록 apoptosis에 대 한 많은 연구자에 의해 "금 표준"으로 간주, cytometry 분석 실험 및 후속 데이터 분석은 종종 FSC/SSC^중간-높 은 이벤트를 선택 하는 초기 제어 단계를 통해 ApoBDs을 제외. 따라서, 우리는 최근에 a 5와 TO-프로-3를 사용 하 여 새로운 흐름 cytometry 분석 결과 개발, caspase 3/7-활성화 pannexin 1 (PANX1)에 의해 선택적으로 촬영 될 수 있는 또 다른 핵 얼룩 채널^7,20. Caspase 3 유도 PANX1 활성화 apoptosis의 초기 단계에서 PtdSer 노출 앞로 TO-프로-3 차동 apoptotic 및 회 저 성 세포를 얼룩. 또한, 전략 게이팅 우리의 소설과 결합 된이 접근 데이터 분석 중 모든 획득된 이벤트를 포함 하 고 그 결과, 6 셀/입자 하위 집합 식별 됩니다, 포함 하 여: (i) 가능한 셀 (FSC/SSC^중간/높은, A5^낮은 , TO-프로-3^낮은), (ii) A5^- 초기 ApoCells (FSC/SSC^중간/높은, A5^낮은,^중간에-프로-3), (iii) A5⁺ ApoCells (FSC/SSC^중간/높은, A5^높은 ,^중간에-프로-3), (iv) 회 저 성 세포 또는 늦은 ApoCells (FSC/SSC^중간/높은 A5^높은,^높은TO-프로-3), (v) ApoBDs (FSC/SSC^낮은, A5^중간, TO-프로-3^{낮은 중간 /}), 그리고 (vi) 파편 (FSC/SSC^낮은,^낮은A5, TO-프로-3^낮은)²⁰. 우리의 접근 방식은 모든 셀/입자 하위 집합 및, 더 중요 한 것은, 세포와 파편²⁰에서 ApoBDs의 분리 분석의 중요성을 강조 한다. 따라서,이 방법은 apoptosis와 ApoBD 형성의 유도 동시에 확인 하는 효율적인 기법을 보여 줍니다.

전통적으로, ApoBDs는 ApoBDs 셀 또는 밀도에 따라 다른 세포 외 소포에서 분리 될 수 있다 그것에 의하여 차별 원심 분리 방식의 다양 한 격리 되었습니다. 그러나, 이러한 원심 분리 방법은 종종 낮은 ApoBD 순수성, 샘플 순도 및 셀 형식 관련 ApoBDs^17,,2122분리를 확인 정량화 단계의 부족에 의해 제한 됩니다. 따라서, 우리 최근 두 가지 방법, FACS 기반 및 새로운 차등 원심 분리-기반 접근 apoptosis와 샘플 순도²³의 유도 확인 하기 위해 우리의 이전 설립된 흐름 cytometry 방법으로 결합 될 수 있는 개발. FACS 기반 접근을 통해 ApoBD 절연 99% 순도, 최대 ApoBDs을 풍요롭게 수 있습니다 하 고 혼합된 셀 인구, 조직 샘플 및 체액²³에서 ApoBDs을 셀 유형 특정 항 체의 다양 한 결합 될 수 있다. 또한, 우리의 개정된 차등 원심 분리 방식을 보여줍니다 ApoBDs를 분리 하는 효율적인 방법 > 90% 순도²³.

이 종이, 우리가 자세히 설명 apoptosis 유도, 유효성을 검사 하 고 검색 하 고 ApoBD 형성 계량 우리의 실험 절차. FACS 기반 및 차등 원심 기반 방법을 사용 하 여 ApoBD 절연 워크플로 또한 정교 하 고 비교. 대표적인 데이터 설명된 방법론 미래 ApoBD 연구에 대 한 효과적인 첨단 도구를 제공 합니다 보여줍니다.

1입니다. Apoptosis 유도

1. 5 분 및 모든 기존의 세포 파편을 제거 하려면 삭제 상쾌한 300 x g에서 원심 분리기 셀 샘플.
   참고: 부착 셀을 사용 하는 경우 사전에 셀 씨 고 apoptosis 유도 전에 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS) x 1 씻어.
2. 휴대폰 번호를 확인 하 고 세포를 수집 합니다.
   참고: 분석 결과 후 절연에 따라 좋습니다 적어도 1 x 10의 시작 셀 번호⁷ 셀을.
3. 1 x 10⁶ 셀/mL의 최종 농도 대 한 완전 한 미디어 (10% (vol/vol) 태아 송아지 혈 청, 50 IU/mL 페니실린, 50 µ g/mL 스 혼합물을 포함 하는 각 매체)에서 resuspend.
4. Aliquot ~ 10⁶ 셀 6 잘 플레이트의 당 x 2.
5. Apoptosis를 유도 하는 접시 뚜껑을 제거 하 고 150 mJ/cm² UV irradiator를 사용 하 여 셀을 비추는. 이 약 30-60 s를 취해야 한다.
   참고: 이전에 방사선,⁶ 셀 ~0.5 x 10 'Untreated' 셀 컨트롤에 대 한 유지 됩니다 확인 합니다.
   참고: Apoptosis 또한 안티 Fas 또는 혈 청 기아⁶등 다른 방법을 통해 유도 될 수 있다.
6. 37 ° C, 5% CO₂ 셀 라인에 따라 2-8 시간 동안에 품 어.
7. 벤치 가기 가벼운 현미경을 사용 하 여, 시각화 apoptotic 형태학, blebbing, apoptopodia 형성, ApoBD 형성 등의 존재를 확인 하는 세포.
   참고: 40 X 확대는 충분 한
8. P1000 피 펫을 사용 하 여, 플라스틱 및 apoptotic 샘플을 수집 합니다.
9. 1 x PBS 가진 접시를 세척 하 고 나머지 샘플 최대 수확량을 위해 결합.
10. 수집 ~1/10^th '전체 Apoptotic 샘플' (WAS)를 제어 합니다.
11. '치료' 샘플을 수집 합니다.
12. 3000 x g 6 분에 WAS 및 Untreated 샘플 원심
13. 1 x PBS의 1 mL에 resuspend 하 고 얼음에 따로.
14. ApoBD 절연, 어느 2 또는 3 단계 나머지 apoptotic 샘플 계속.

2. ApoBD FACS 통해 격리

1. 3000 x g 6 분에 전체 샘플 원심
2. 펠 릿을 중단 하지 않고는 상쾌한의 대부분을 제거 합니다.
3. 1 x A5 바인딩 버퍼, A5 FITC의 75 µ L 당 1 x 10⁷ 셀에-프로-3의 2 µ L의 1 mL를 포함 하는 얼룩 솔루션에서 resuspend.
4. 10 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 샘플을 품 어.
5. 1 x A5 바인딩 버퍼의 1-2 mL을 추가 하 고 원심 3000 x g 6 분 초과 얼룩 제거에서 샘플.
   참고: 혼합된 셀 인구 또는 조직 샘플에 대 한 수행 단계 1 x A5 바인딩 버퍼에 셀 유형 전용 표식의 조합을 사용 하 여 얼룩이 지는 항 체와 3000 x g 6에서 원심 분리 하기 전에 (또는 제조 업체의 프로토콜에 의하여) 20 분 동안 얼음에 품 어 분입니다.
6. FACS 버퍼의 3 ml에서 샘플 펠 릿 resuspend (1x PBS, 1 x A5 바인딩 버퍼, 10 %FSC, 2 mM EDTA) 1 x 10⁷ 셀 당.
7. 라운드-하단, 폴 리 프로필 렌 (cytometry) 튜브로 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터 및 샘플 얼음에, 어둠 속에서 계속.
8. FACS 기계와 100 µ m 노즐을 사용 하 여 표준 설치를 수행, 드롭 지연 수행을 켜고 안정적인 흐름을 보장 합니다.
9. 샘플을 로드 하 고 ~ 1000 이벤트/s 수집 속도 설정 합니다.
10. FSC, SSC, APC (TO-프로-3) 조정 하 고 (A5) FITC 전압 및 인구를 보장 하기 위해 FACS 플롯 내의 위치 이벤트 명확 하 게 분리 될 수 있다.
11. 20000 이벤트를 기록 합니다.
12. 제 4 부로 제어 전략을 설정 합니다.
13. 정렬 레이아웃에서 원하는 정렬 인구로 최종 ApoBD 게이트를 추가.
14. 샘플 수집 시작 되 고 ~ 250 µ L FACS 버퍼를 포함 하는 새로운 관으로 5000-10000 ApoBDs를 수집 하 여 테스트 정렬을 수행.
15. 뒤 시스템을 수행 하 고 정렬된 ApoBDs을 로드 합니다.
16. 취득 및 테스트-정렬 ApoBDs을 기록.
17. ApoBD 순도 FSC (y 축) 대 a 5를 비교 하 여 ~ 99% 인지 확인 (x 축 이벤트).
    참고: 다시 레이저 표백으로 인해 샘플을 분석 하는 경우에 약간 줄일 수 있습니다 A5 얼룩.
18. 고 순도 달성 되 면 원래 샘플을 로드 하 고 정렬 ApoBDs의 원하는 숫자를 얻을 때까지 계속.
    참고: 필요한 경우 듀얼 정렬을 수행할 수 있습니다 동시에 ApoCells 및 ApoBDs를 분리.
    참고: 시간의 긴 기간 동안 정렬할 때 좋습니다 잠복기 4 ° c.에 컬렉션 튜브
19. 정렬이 완료 되 면 정렬 후 ApoBDs의 작은 부분을 수집, ApoCells, Untreated, 및 WAS apoptosis의 유효성을 검사 하 여 정렬 후 순도 확인 후 정렬.
    참고: 테스트 정렬 및 정렬 후 순도 크게 차이가 안 한다, 비록이 스트림 설정 및 안정성에 기반입니다.

3. ApoBD 절연 차등 원심 분리를 통해

1. 10 분에 대 한 300 x g에서 나머지 apoptotic 샘플 원심
2. ~ 500 µ L 셀 펠 렛을 방해 하지 않으려면 떠나 상쾌한 수집 하 고 새로운 15 mL 원뿔 튜브로 추가.
3. 나머지 500 µ L을 제거 하 고 (이 'ApoCell 농축 비율'을 나타냅니다 1 x PBS의 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend.
4. 3000 g에서 20 분에 대 한 수집된 상쾌한 원심
5. 펠 릿에 대 한 확인 하 고 조심 스럽게 제거 상쾌한 (는 상쾌한 microvesicles 및 exosomes를 포함 하 여 작은 세포 외 소포를 포함할 수 있습니다).
6. 1 x PBS (이 대표는 ' ApoBD-농축 ' 분수)의 1 mL에 펠 릿 resuspend
7. 각 실용적, WAS, ApoCell-농축, 및 새로운 라운드-하단, 폴리스 티 렌 (cytometry) 튜브 샘플 ApoBD 농축의 100 µ L를 수집 합니다.
8. 2 x A5 바인딩 버퍼, 1: 100 A5-FITC, 및 1:1,000에-프로-3를 포함 하는 얼룩의 100 µ L를 추가
9. 어둠 속에서 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
10. Cytometry, apoptosis의 성공적인 유도 및 ApoBD 농축 분수의 순도 확인 하기 위해 위에서 설명한 제어 전략을 사용 하 여 샘플을 분석 합니다.

4. Cytometry 전략 게이팅

1. 플롯을-프로-3 (y 축) FSC (x 축) 모든 다른 비-permeabilized 이벤트 (TO-프로-3^{낮은/중간})에서 괴 사 성 세포 (TO-프로-3^높은) 분리에 대 한.
2. 모든 비 permeabilized 이벤트를 선택 하 고 a 5에 대 한 SSC 플롯. 두 개의 인구 인구 1 (P1), SSC^중간/높은,^{낮은/중간} 셀 A5 및 인구 2 (P2), 다른 모든 이벤트를 포함 하 여 게이트.
3. P2에서 TO-프로-3 a 5에 대 한 플롯 하 고 A5^중간/높 은 이벤트 모든 세포 파편을 제외를 선택 합니다.
4. 모든 A5 긍정적인 이벤트를 선택 하 고 a 5에 대 한 FSC 플롯. ApoCells (FSC^중간/높은)에서 ApoBDs (FSC^낮은)을 구분 합니다.
   참고: ApoBDs FACS 기반 접근을 통해 ApoBD 절연을 위한 게이팅, 좋습니다 마지막 단계를 ApoBDs를 선택 하 고 비교를-프로-3 a 5에 모든 이벤트를 선택 하 여. 이렇게 마지막 정렬 게이트 형광 보다는 FSC/SSC 매개 변수를 사용 하면.
5. 실행 가능한 세포 분석에 대 한 P1을 선택 하 고 두 가지 제어 전략 중 하나를 수행 합니다. 일반 실행 가능한 세포 분석, a 5에 대 한 FSC 플롯 고 따라서 나머지 세포 파편을 제거 하는 모든 FSC^중간/높 은 셀을 선택 합니다. 또는, 심층 분석에 대 한 실행 가능한 세포 분리 될 수 있다 a 5에서^- 에-프로-3 금감위에 대 한 플롯에 의해 초기 ApoCells. 선택에-프로-3^낮은, FSC^{중간/높은} 실행 가능한 세포와 TO-프로-3^중간, FSC^중간/높 은 A5^- 초기 ApoCells.

여기에 설명 된 절차를 사용 하 여, THP 1 monocyte apoptosis 유도 되었다 그리고 ApoBDs 탐지 되 고 고립 FACS 기반 또는 차등 원심 분리 방식 (그림 1)를 통해. 첫째, apoptosis UV 방사선에 의해 유도 되었다 및 샘플 셀 apoptotic 형태학, blebbing, apoptotic 막 돌출 형성 및 ApoBDs6의 세대를 포함 하 여 전시 하는 때 외피의 2-3 h 후 수집 된. TO-프로-3와 A5 기반 흐름 cytometry 방법은 monocyte apoptosis와 ApoBD 형성의 유도 가능한 셀, 회 저 성 세포, 초기 ApoCells, ApoCells, ApoBDs 및 파편 (그림 2)을 분리 하 여 확인을 위해 사용 되었다. 함께 찍은, 교류 cytometry 분석 ~ 20%의 자외선 치료 결과 표시 ApoCells (그림 3).

THP 1 monocyte ApoBDs은 다음 두 가지 방법을 통해 WAS에서 격리. 첫째, 샘플 순도 FACS 기반 접근만 단일 원심 분리 단계는 얼룩이 지기 전에 전체 apoptotic 샘플 작은 필요가 대 한 준비 및 FACS. 이 메서드는 기능 분석에 대 한 적절 한 때 크게 높은 샘플 순도 (예: 정량 분석), ApoBDs 특정 수는 필요, 또는 필요한 경우 복잡 한 샘플에서 형식별 ApoBDs 셀 인수. 이 방법론을 사용 하 여, ApoBDs ~ 99% 순도 (그림 4)를 격리 했다.

다음, THP 1 monocyte ApoBDs는 또한 2 단계, 차등 원심 분리 방식을 통해 격리. 첫 번째 단계는 가능한 셀, ApoCells 및 회 저 성 세포의 포함 되어 있습니다. 두 번째 단계는 microvesicles 같은 작은 세포 외 소포에서 더 큰 ApoBDs의 분리 및 exosomes, g. cytometry x 3000에서 수송과 될 수 없습니다 다음 apoptosis 유도 및 ApoBD 샘플 순도 확인을 수행 하 고 시연 ~ 97%를 포함 하는 ApoBD 농축 샘플 ApoBDs (그림 4). 이 상대적으로 높은 순도에 ApoBD를 격리 하기 위해 신속 하 고 효과적인 기술을 선물 이며 적절 한 단일 셀 형식을 포함 하는 샘플에서 ApoBDs를 정화 하는 때.

그림 1 . 어느 FACS 기반 또는 차등 원심 분리 방식을 통해 ApoBD 절연의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 . Flow cytometry 전략 게이팅. 6 셀/입자 하위 집합 (가능한 셀, a 5를 포함 하 여- 초기 ApoCells, A5+ ApoCells, ApoBDs, 회 저 성 세포, 파편) 식별 및 FACS 기반 격리에 대 한 ApoBD를 선택 하는 데 사용 했다. (a) 막 permeabilised 회 저 성 세포 비 permeabilised 이벤트에서 분리 됩니다. (b) A5낮은 중급, SSC낮은 높 은 셀 A5로우가 이벤트에서 분리 됩니다. (b.i) 깊이 분석, TO-포-3낮은 실행 가능한 세포를-프로-3중간 A5에서 분리 될 수 있다에 대 한- 초기 ApoCells. (b.ii) 또는 단순히 ApoBD 순도 계산, 실행 가능한 세포에서에서 분리 수 있습니다 FSC낮은 이벤트. (c) A5낮은 파편 제외 됩니다. (d) FSC중간/높 은 ApoCells FSC낮은 ApoBDs에서 분리 된다. (e) 모든 A5-프로 3중간/높 은 ApoBDs 정렬 선택 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

그림 3 . THP 1 monocyte apoptosis의 유효성 검사. 치료 또는 UV 방사선 THP 1 monocytes의 흐름 cytometry 분석 가능한 셀 a 5의 수준을 결정 하 수행 했다- 초기 ApoCells, A5+ ApoCells, 회 저 성 세포.

그림 4 . THP-1 정화 monocyte 파생 ApoBDs. 교류 cytometry 분석 격리 THP 1 monocyte 파생 된 ApoBDs 중 FACS 기반 또는 차등 원심 기반 접근을 통해 가능한 셀, ApoCells 및 회 저 성 세포에서 ApoBDs의 농축을 보여주는에서 수행 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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