Summary
Denne protokollen beskriver en endothelial differensiering teknikk for cardiac progenitor celler. Det fokuserer spesielt på hvordan serum konsentrasjonen og celle-såing tetthet påvirker potensial endothelial differensiering.
Abstract
CARDIAC progenitor celler (CPC) kan ha terapeutisk potensial for cardiac regenerasjon etter skade. I voksen pattedyr hjertet, iboende CPC er svært knappe, men utvidet CPC kan være nyttig for cellen terapi. En forutsetning for deres bruk er deres evne til å skille på en kontrollert måte i de forskjellige cardiac linjene bruker definerte og effektiv protokoller. I tillegg i vitro ekspansjon, CPC isolert fra pasienter eller prekliniske sykdom modeller kan tilby fruktbart forskningsverktøy for etterforskningen av sykdom mekanismer.
Aktuelle studier bruker forskjellige markører for å identifisere CPC. Men er ikke alle av dem uttrykt i mennesker, som begrenser translasjonsforskning virkningen av noen prekliniske studier. Differensiering protokoller som gjelder uansett isolasjon teknikk og markør uttrykket vil tillate standardisert ekspansjon og fylling av CPC for cellen terapi formål. Her beskriver vi at fylling av CPC under en lav fosterets bovin serum (FBS) konsentrasjon og lav celle tetthet forhold forenkler endothelial differensiering av CPC. bruke to forskjellige subpopulasjoner av mus og rotten CPC, viser vi at laminin er en mer egnet substrat enn fibronectin for dette formålet under følgende protokollen: etter dyrking for 2-3 dager i medium inkludert kosttilskudd som opprettholde multipotency og med 3,5% FBS, CPC er seeded på laminin på < 60% samløpet og kultivert i supplement-fri medium med lave konsentrasjoner av FBS (0,1%) for 20-24 timer før differensiering i endothelial differensiering medium. Fordi CPC er en heterogen befolkning, må serum konsentrasjonen og inkubasjon ganger justeres avhengig av egenskapene til de respektive CPC-subpopulasjon. Vurderer dette, teknikken kan brukes på andre typer CPC samt og gir en nyttig metode for å undersøke muligheter og mekanismer for differensiering og hvordan de påvirkes av sykdom ved CPC isolert fra respektive sykdom modeller.
Introduction
Nyere studier støtter eksistensen av bosatt cardiac progenitor celler (CPC) i den voksne pattedyr hjerte1,2,3og CPC kan være en nyttig kilde for cellen terapi etter hjertestans skade4, 5. I tillegg utvidet CPC kan gi en fruktbar modell for narkotikarelaterte screening og etterforskning av sykdom mekanismer når isolert fra pasienter med sjeldne cardiomyopathies eller fra respektive sykdom modeller6,7.
CPC isolert fra voksen hjertet har stammen/stamfar celle egenskaper1,2,3,8 som de er multipotent, clonogenic, og har kapasitet for selvtillit fornyelse. Men er det mange forskjellige (sub) bestander av CPC viser forskjellige overflaten markør profiler, inkludert, for eksempel c-kit, Sca-1, og andre, eller hentet av ulike isolasjon teknikker (tabell 1). Flere kultur og differensiering protokoller har vært etablert1,2,8,9,10,11,12, 13,,14,,15,,16,,17,,18. Disse protokollene varierer hovedsakelig med hensyn til vekst faktor og serum innhold, som justeres etter dyrking og som kan føre til forskjellene i resultater og resultater, inkludert differensiering effektivitet.
Indikator-baserte isolasjon teknikker:
CPC kan isoleres basert på en bestemt overflaten markør uttrykk1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Tidligere studier tyder på at c-kit og Sca-1 kan være den beste markører isolere bosatt CPC1,11,14,19,20. Fordi ingen av disse markørene er virkelig gjelder CPC, brukes vanligvis kombinasjoner av ulike markører. For eksempel, mens CPC uttrykke lave nivåer av c-kit21, er c-kit også uttrykt ved andre celletyper, inkludert mastceller22og endotelceller23blodkreft stem/stamfar celler24. Et ytterligere problem er det faktum at ikke alle markører uttrykkes på tvers av alle arter. Dette er tilfelle for Sca-1, som uttrykker i mus, men ikke i menneskelig25. Derfor kan bruker protokoller som er uavhengige av isolasjon indikatorer være fordelaktig i lys av kliniske forsøk og studier med prøver fra mennesker.
Markør-uavhengig isolasjon teknikker:
Det er flere store teknikker CPC isolasjon, som primært uavhengig av overflaten markør uttrykk, men som kan være raffinert av påfølgende valg av bestemte markør-positive subfractions etter behov (se tabell 1). (1) side befolkningen (SP) teknikk har opprinnelig vært preget i primitive innbyggere blodkreft stamceller basert på evnen til å middelklasseinnbyggere DNA fargestoff Hoechst 3334226 av ATP-bindende kassett (ABC) transportører27. CARDIAC SP celler er isolert av ulike grupper og rapportert å uttrykke en rekke indikatorer med noen mindre forskjeller mellom rapporter2,8,13,14. (2) colony-forming enhet fibroblast celler (CFU-Fs) er opprinnelig definert basert på en mesenchymal stromal celle (MSC)-som fenotypen. Isolert MSCs er kultivert retter å skape koloni. Slike colony-forming MSC-lignende CFU-Fs kan isoleres fra voksen hjertet og er i stand til å skille ut cardiac overleveringslinjer15. (3) Cardiosphere-avledet celler (CDC) er avledet fra klynger av celler vokst fra vev biopsier enkeltceller eller explants28,29,30,31. Det ble nylig vist at det meste av CD105+/CD90-/c-kit- celle brøkdel utstillinger cardiomyogenic og regenererende potensielle32.
Her gir vi bruker SP-CPC isolert fra mus, en protokoll for effektiv induksjon av endothelial avstamning basert på en tidligere studie i rotte CPC og mus SP-CPC33. Protokollen inneholder spesifikke tilpasninger til kultur og utvidelse teknikk med hensyn til celle tetthet, serum innholdet i mediet, og underlaget. Det kan brukes ikke bare mus SP-CPC, men til ulike typer CPC for formålet å indusere en skjebne bytte fra en forsterke til en endothelial forpliktet CPC, det være seg i lys av transplantasjon av disse cellene eller bruk for mekanistisk i vitro studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruk mus for cellen isolasjon formål var i samsvar med veiledningen og bruk av forsøksdyr og med sveitsiske dyr beskyttelse loven og ble godkjent av den sveitsiske Cantonal myndigheter.
Merk: Isolering av Sca-1+/CD31- SP-CPC fra musen hjertet ble i hovedsak gjort som beskrevet tidligere34 med noen modifikasjoner. For materialer og anvendte reagensene, kan du se Tabellen for materiale. For alle eksperimenter, ble hjerte SP-CPC isolert fra mus forsterket passaged og brukes i en celle linje-lignende måte. Avsnitt 7-20 ble brukt for denne studien.
1. vev forberedelse
Merk: Alle eksperimenter ved hjelp av mus må utføres i henhold til retningslinjer og regler. Denne protokollen bruker fire mus. Kultur-plater som er 100 mm i diameter er beskrevet som P100 og kultur plater som er 60 mm i diameter er beskrevet som P60 for følgende deler av protokollen.
- Injisere hver musen med 200 mg/kg av pentobarbital intraperitoneally (IP) og vent til den er fullt anesthetized ved å sjekke sin reaksjon tåen knipe.
- Tørk brystet med 70% etanol. Skjære i hud og thoracic veggen med saks å avsløre bryst hulrom.
- Løft hjertet med tang og kutt det ved hjelp av saks. Legg hjertet i en P100 med 25 mL (5 mL for P60) kaldt fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) (tre til fem hearts per P100) eller en til to hjerter per P60.
- Pumpe hjertet med tang å kaste ut blodet av hulrom (figur 1A).
- Legg hjertet i en P100 med 25 mL (5 mL for P60) av kaldt PBS for vask. Fjerne atria med liten saks. Skjær hjertet i to langsgående biter og vaske dem igjen i iskalde PBS (25 mL/P100, 5 mL/P60).
- Overføre bitene til en ny P100 med 25 mL (5 mL for P60) kaldt PBS. Kutt stykker i mindre biter med liten saks (figur 1B). Legg en dråpe 1 mg/mL collagenase B fortynnet i Hanks balansert salt løsning (HBSS) og hakke det lite stykker grundig med et sterilt barberblad (figur 1 c).
2. fordøyelse
- Legge 10 mL (2.5 mL for P60) av 1 mg/mL collagenase B løsningen til parabolen fra trinn 1.6.
- Sette collagenase B løsningen inneholder hakket hjertet bitene i en skrå (ca 30°) P100 (eller P60) i en 37 ° C inkubator (figur 1 d).
- Inkuber hakket hjertet bitene for maksimalt 30 min; homogenize ved å gjentatte ganger sende dem gjennom en Pasteur pipette hvert 10 min under incubation (figur 1E).
Merk: Det er viktig å ikke overskride 30 min med inkubering totalt for trinn 1.3.
3. filtrering
- Legge 10 mL (5 mL for P60) kaldt HBSS med 2% FBS for hakket og homogenisert hjerte brikker.
Merk: HBSS med 2% FBS slukker collagenase B aktivitet. - Filtrere hjertet bitene gjennom 100 µm fjerne ufordøyd vev og sentrifuge 470 x g for 5 min ved romtemperatur (RT) (figur 1F, gul filtre).
- Forkaste nedbryting resuspend pellet i 5 mL (3 mL for P60) av røde blodlegemer lyseringsbuffer og ruge pellet i 5 min med sporadisk riste på is.
- Legg til 10 mL (5 mL for P60) på PBS (for å stoppe lysis reaksjonen) og filtrere utvalget gjennom en 40 µm utelate større celler, inkludert gjenværende cardiomyocytes (figur 1F, blå filtre).
- Sentrifuge røret 470 x g etter 5 min på RT (uten brems). Forkaste nedbryting og resuspend pellet i 1 mL av DMEM inkludert 10% FBS.
- Tell cellene i en aliquot med en hemocytometer. Resuspend cellene med DMEM inkludert 10% FBS, sikte på en siste celle konsentrasjon av 1 x 106 celler/mL.
Merk: Omtrent 5 x 106 cardiomyocyte - og røde blodlegemer-utarmet celler kan beregnes per musen. - Distribuere cellene i to rør (figur 2): tube A, legge til 1,5 mL til Hoechst 33342 farging med verapamil; i rør B, Legg 18.5 mL til Hoechst 33342 farging og flekker og sortere (trinn 4.1 og 4.2) cardiac SP celler av flowcytometri.
4. sortering av Cardiac SP celler av flowcytometri
Merk: Verapamil hemmer Hoechst middelklasseinnbyggere blokkerer multidrug motstand (MDR) ABC transporter aktivitet. Hoechst 33342 er et DNA-bindende fargestoff som kan brukes i levende celler for å oppdage cellen syklus som relaterer med DNA innholdet. Hoechst-33342-ekstrudering celler vises i Hoechst lav del av både utslipp kanaler (450 nm, Hoechst blå; 650 nm, Hoechst rød), som er, bortsett fra det Hoechst-beholdt "Hovedformålet befolkningen", gi dem navn "siden befolkningen". SP celler er beriket i celler med stamfar egenskaper og viser en høy uttrykk for multidrug-resistente ABC transportører (som MDR1 og ABCG2). Hoechst 33342 skrives som Hoechst for følgende deler av protokollen. Det er viktig å beskytte lys-sensitive materialer for perfekt resultat.
-
Farging med Hoechst i tilstedeværelse og fravær av verapamil
- Legge til verapamil (med en siste konsentrasjon av 83.3 µM) og Hoechst (med en siste konsentrasjon av 5 µg/106 celler) i celle løsningen. For rør A, bruk Verapamil og Hoechst; rør B, bruke Hoechst bare. Inkuber i et vannbad (på 37 ° C) i 90 minutter og tilbake rør hvert 20 min (figur 1G).
- Sentrifuge rør 470 x g i 5 min på RT. Forkast nedbryting og resuspend hver pellet i HBSS (1 x 106 celler/mL).
- Ta en 1,5 mL aliquot for enkel stainings og negativ kontroll fra rør B (figur 2): (i) fluorescein isothiocyanate (FITC)-konjugert anti-Sca-1; (ii) allophycocyanin (APC)-konjugert anti-CD31; (iii) nonstained celler (negativ kontroll).
Merk: Isotype kontroller brukes her for å sette opp isolasjon protokollen. - Sentrifuge rør A og B og enkelt flekker og negative dele 470 x g i 5 min på RT for å vaske ut Hoechst og verapamil.
- Forkaste nedbryting og resuspend pellets tube A og (iii) kontrollen negative i 250 µL av HBSS og holde dem på isen i mørket til sortering.
- Resuspend pellets rør B i 200 µL av HBSS og pellets for (i, ii) de enkelt flekker dele i 100 µL av HBSS. Legge til FITC-konjugerte anti-Sca-1 (0,6 µg/107 celler) og APC-konjugerte anti-CD31 (0,25 µg/107 celler). Inkuber pellets i 30 min på is og rist dem fra tid til annen i mørket.
- Legg 2 mL HBSS til rør. Sentrifuge rør 470 x g i 5 min på RT.
- Forkast nedbryting og resuspend alle pellets med 1 mL av HBSS og sentrifuger som ovenfor. Kast supernatants. Resuspend pellets av dele én flekker i 200 µL av HBSS. Resuspend pellets rør B i HBSS (20 x 106 celler/mL).
- Holde prøvene på is og beskyttet fra lys til sortering.
-
Sortering med flowcytometri
- Forberede bakteriefri 1.5 mL sortering rør med 500 µL av HBSS inkludert 2% FBS.
- Stain cellene med 7-aminoactinomycin D (7-AAD) (0,15 µg/106 celler) på is 10 min å ekskludere døde celler.
- Sortere cardiac SP med følgende innstillinger: opphisse Hoechst bruker 350 nm (UV) eksitasjon, samle fluorescens utslipp med en 450/50 nm båndpass (Hoechst blå) og en 670/30 nm bånd-pass filter (Hoechst rød) og bruke en dyse størrelse på 100 µm og trykk på 15 psi.
- Registrere 5 x 105 hendelser for sortering prøvene og 1 x 105 hendelser for negativ kontroll, verapamil kontroll og enkelt flekker for analyse, prøver.
Merk: Cardiac SP er rundt 0,5% - 2% (figur 1 H) men kan variere mellom laboratorier og isolerer. Sca-1+-/CD31- brøkdel er rundt 1 – 11% av den totale cardiac SP (figur 1I) men kan variere mellom laboratorier og isolerer. SCA-1+/CD31- SP-CPC skrives som SP-CPC for følgende deler av protokollen.
5. primære kultur isolert SP-CPC
Merk: Tre forskjellige medietyper ble brukt i denne protokollen. De kalles Medium 1 (ifølge Noseda et al.) 8, medium 2, og Medium 3 og er beskrevet i Tabellen for materiale om sammensetningen.
- Varme opp Medium 1 til 37 ° C før bruk og kjøle ned sentrifuge til 4 ° C. Sentrifuge sortering rørene på 4 ° C og 470 x g for 6 min og resuspend cellene i Medium 1.
- Sette cellene på en gass permeabel P60 parabolen med 4 mL Medium 1. Endre mediet hver 3 d til cellene har nådd 70% - 80% samløpet.
Merk: Trinn 5.2 kan ta ca 2-3 uker.
6. ekspansjon og differensiering av SP-CPC
-
Cellekultur
- Kultur 3 x 105 SP-CPC i 8 mL Medium 1 i en MT75 bolle.
- Inkuber SP-CPC-er på 37 ° C med 5% CO2 til 70% - 80% samløpet, endre mediet hver 2-3-d.
Merk: Hvor cellen skal endres etter hvilken CPC brukes, dobling tid og cellestørrelsen.
-
SP-CPC vekst og levedyktighet under forskjellige serum konsentrasjonen
- Kultur SP-CPC for 2-3 d i MT75 flasker med 8 mL Medium 1. Nøye Sug opp mediet og skyll forsiktig med 5 mL av varm (37 ° C) HBSS.
- Behandle cellene med 5 mL av Trypsin-EDTA i 5 min i cellen inkubator, legge til 5 mL Medium 1 å stoppe Trypsin aktiviteten og overføre celle suspensjon slik 15 mL.
- Sentrifuge cellene 470 x g i 5 min på RT.
- Resuspend cellene i Medium 1 eller middels 2 (avstamning induksjon medium) og plate 2.5 x 105 SP-CPC P60 retter med 3 mL medium som inneholder forskjellige serum konsentrasjoner.
- Samle mediet fra parabolen trinn 6.2.4 for innsamling av døde celler i en 15 mL tube etter 2 d av dyrking i Medium 1 eller middels 2.
- Trypsinize tilhenger celler som i trinn 6.2.2 og samle celle suspensjon i 15 mL tube trinn 6.2.5. Sentrifuge cellene på 840 x g i 5 min på RT.
- Sug opp nedbryting og tilsett 1 mL av Medium 1 eller middels 2 for cellen opptelling. Flekken SP-CPC med trypan blå (0,4%) og antall trypan blå-positive (død) og trypan blå-negativ (levedyktig) celler.
Merk: Cellen levedyktighet (trinn 6.2.7) gis som trypan-blå negativ celle nummer i forhold til hvor total-cellen.
-
Induksjon av endothelial differensiering
- Precoat en (6-brønnen) plate med 10 µg/mL av laminin (LN) eller fibronectin (FN).
- Gjør et substrat løsning som inneholder 10 µg/mL LN eller FN med F12 medium (eller PBS). Legg 2 mL substratløsningen i hver brønn. Vedlikeholde platen i 30 min på 37 ° C.
- Sug opp løsningen fra platen og tilsett 2 mL PBS hver brønn før bruk.
- Sug opp mediet cellene fra trinn 6.1.2, skyll forsiktig med 5 mL av varm (37 ° C) HBSS, behandle dem med 5 mL av Trypsin-EDTA i 5 min i cellen inkubator, legge til 5 mL Medium 1 å stoppe Trypsin aktiviteten og overføre celle suspensjon slik 15 mL.
- Sentrifuge cellene 470 x g i 5 min på RT. leveringstanken nedbryting og legge til middels 2 for cellen opptelling.
- Frø 8 x 104 celler per godt på bestrøket tallerkenen med 3 mL Medium 2 og holde det ved 37 ° C i 20-24 h. endring mediet til 3 mL Medium 3.
Merk: Vi anbefaler å bruke mediet som inneholder en lav serum konsentrasjon- og uten kosttilskudd-for første 20-24 h. Ved å bruke < 60% celle samløpet (dvs., celle antall trinn 6.3.4 har justeres avhengig celle størrelse og vekst). - Kultur celler for 21 d og endre mediet hver 3 d.
- Kontrollere endothelial natur differensierte celler ved farging dem med en endothelial markør som von Willebrand faktor (vWF) og utføre fluorescens mikroskopi.
- Vask cellene med 1 mL av PBS og fikse cellene i 3,7% formaldehyd i 2 minutter på RT.
- Permeabilize cellene med 0,1% Triton X i ddH2O (eller PBS) i 30 min, og blokker den med 10% geit serum 1t på RT.
- Inkuber cellene med anti-von Willebrand faktor antistoff (1: 100) for 48 timer på 4 ° C
- Vask cellene 3 x med 1 mL av PBS, i 10 minutter hver gang. Inkuber dem med Alexa Fluor 546 geit anti-kanin sekundære antistoff (1:500) 1 h på RT i mørket.
- Vask igjen 3 x, i 10 minutter hver, med 1 mL av PBS. Stain celle kjerner med 4'6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI; 1:500) i 5 min på RT i mørket.
- Vask cellene 3 x, i 5 minutter hver, med 1 mL av PBS. Montere cellene og lagre dem på 4 ° C
Merk: Culturing forholdene (substrat, medium, supplerende reagenser og FBS konsentrasjon) i trinn 6.1 og 6.3 er beskrevet i Figur 3.
- Precoat en (6-brønnen) plate med 10 µg/mL av laminin (LN) eller fibronectin (FN).
-
Rør formasjon analysen
- Forberede en kjeller membran matrise (f.eksMatrigel, heretter referert til som matrise) plate.
- Tine matrisen ved 4 ° C over natten.
- Coat en 96-brønns plate med 100 µL av matrix på is.
Merk: Det er viktig å unngå bobler i matrisen. Platene må være belagt på is å unngå jellification av matrix. - Vedlikeholde platen på 37 ° C i 30 min.
- Sug opp mediet cellene (etter ferdigstillelse av trinn 6.3.5), forsiktig rense cellene med 5 mL av varm (37 ° C) HBSS og behandle dem med Trypsin-EDTA i 5 min i cellen inkubator. Legge til middels 3 for å stoppe Trypsin aktiviteten og overføre celle suspensjon slik 15 mL.
- Sentrifuge cellene 470 x g i 5 min på RT. leveringstanken nedbryting, Legg 1 mL av Medium 3 og Pipetter forsiktig.
- Filtrere cellene med en 35 µm celle sil, hvis cellene er akkumuleres.
- Telle celler og frø 2 x 103 til 4 x 103 celler i 100 µL av Medium 3 i hver matrise-belagt godt. Holde platen på 37 ° C i cellen inkubator 16 h.
- Ta et bilde med lyse-feltet mikroskop på 2 X forstørrelse.
Merk: I tilfelle av en ufullstendig trypsinization, forlenge eksponeringstid til Trypsin-EDTA opptil 7-8 minutter.
- Forberede en kjeller membran matrise (f.eksMatrigel, heretter referert til som matrise) plate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Musen SP-CPC isolasjon:
I denne studien brukte vi musen CPC isolert ifølge SP fenotypen, mens resultater fra rotte CPC er endret og lagt til fra en tidligere rapport med tillatelse (Figur 8)33.
Celle spredning Under høye og lave celle tettheter og med forskjellige Serum konsentrasjonen:
Vår forrige studie viste at mRNA uttrykket av cardiac lineage markører endret innen de første 24 timer dyrking trinn. Det er kjent at den ekstracellulære matrisen påvirker celle skjebne beslutninger, inkludert endothelial differensiering35. For å utforske passende forhold for tilrettelegging av endothelial avstamning forpliktelse CPC, vi brukte FN og LN (både 10 µg/mL) på en 6-vel plate (vekstområde: 9,6 cm2/vel) i denne studien. Fordi cellen syklus og celle skjebne beslutninger er nært knyttet, vi søker betingelsen som har en lav cellehastighet for spredning i fravær av celledød, slik betingelse kan gjenspeile overgangen fra celle spredning til differensiering. Vi er derfor brukes følgende og sammenlignet celle spredning priser: for cellen tetthet, høye (80% - 90%) confluency og lav (< 60%) confluency, og for serum konsentrasjonen, normal kultur forhold (i denne studien 3,5% FBS) og lav serum betingelser (≤0.1% FBS). Først testet vi lav celle tetthet tilstanden. Det var ingen vesentlig forskjell av cellen levedyktighet og spredning i lav celle tetthet med 3,5% FBS mellom LN og FN, mens en lav celle tetthet med 0,1% FBS viste en redusert celle spredning på LN forhold til FN men ingen økning i celledød ( Figur 4). Derimot under høyt tetthet forhold, serum konsentrasjoner av både 3,5% og 0,1% viste ingen forskjeller i celle spredning og celledød mellom de to underlag (figur 5).
Disse resultatene indikerer at en lav celle tetthet på LN med 0,1% serum reduserer spredning uten at det påvirker CPC levedyktighet.
Endringer i celle-figuren i Endothelial differensiering mediet:
Selv om krever videre studier for å forstå betydningen og underliggende mekanismene, vises endringer i celle figuren skal angir passende oppdrettsforholdene som bestemte endringer kan observeres tidlig i kulturer, der endothelial differensiering skal være vellykket (figur 6). Som vist i de hvite stiplede sirklene i figur 6, innen 7-14 d i endothelial differensiering medium, inneholdt vellykkede kulturer celler som var større og annerledes i morfologi til de andre cellene. Interessant, antyder disse cellene forsvant mot slutten av differensiering fase og også dukket opp i tallene og senere tidspunkt i høy tetthet kulturer på LN og FN. mens vi ikke ytterligere karakterisere disse cellene, denne protokollen sporing celle figuren hver 2-3 d til rundt dag 14. Hvis ingen slike celler vises, bør antall celler seeded reduseres.
Evaluering av Endothelial evnen med en Tube formasjon analysen:
Rør formasjon analysen er en nyttig teknikk å vurdere effektiviteten av endothelial differensiering av CPC måle tube formasjon kapasiteten av differensierte celler. Vi derfor utført tube formasjon analysen med celler differensiert i henhold til beskrevet vilkårene. Interessant, var vellykket tube formasjon konsekvent vist av cellene belagt på lav tetthet og differensiert på LN, mens tube formasjon hovedsakelig mislyktes i celler belagt på LN på en høy tetthet (figur 7A). Tilsvarende tube formasjon var mest mislykket i celler kultivert på FN uansett celle tetthet, selv om celler differensiert på FN på lav tetthet noen ganger dannet rudimentære rør, avhengig av cellen tilstand (f.eksisolere og/eller passasje nummer, figur 7B). For å bekrefte endothelial natur celler, celler belagt på coverslips differensiert etter beskrevet protokollen og farget for vWF. Igjen vWF uttrykket var mer homogen og mer uttalt i CPC differensiert på LN forhold til FN (figur 7CD). Figur 8 viser resultatene fra rør formasjon analysen som utført tidligere studier med rotte CPC under den samme protokollen som her beskrives33. Disse resultatene viser at rør formasjon er mer effektiv i celler differensiert på LN i forhold til FN når belagt under lav celle tetthet forhold og med lav serum (0,1% FBS) for 20-24 h før differensiering i endothelial differensiering medium. Disse resultatene tyder på at denne protokollen kan være nyttig for ulike celletyper og uavhengig av arter.
Figur 1: illustrasjon av bestemte isolasjon trinn for å få en cardiomyocyte-utarmet celle suspensjon fra isolert musen hjerter og representant flyt cytometri readouts cardiac SP (A) dette panelet viser utløsing av gjenværende blod fra hjertet hulrom gjennom gjentatt liten press påføres ved hjelp av små pinsett. (B) dette panelet viser kutte hjerter i små biter med liten saks. (C) dette panelet viser hakking hjertet stykker med et barberblad. (D) dette panelet viser inkubasjonstiden for hakket hjerter med collagenase B i skrå plater på 37 ° C. (E) dette panelet viser homogenisering av hakket hjerter bruker en Pasteur pipette under inkubasjon trinnet. (F) dette panelet viser filtrering av fordøyd vev gjennom en 100 µm filter (gul) og en 40 µm filter (blå) for fjerning av ufordøyd vev rester og cardiomyocytes. (G) dette panelet viser mild reversering av en 50 mL konisk rør som inneholder cardiomyocyte-utarmet celle suspensjon og innpakning i tinn folie for lett beskyttelse etter tillegg av Hoechst. (H) dette panelet viser representant flyt cytometri readouts Hoechst-farget celler i tilstedeværelse og fravær av ABC transporter hemmer verapamil for identifikasjon av SP. (jeg) dette panelet viser en representant dot tomt SP celler i henhold til CD31 og Sca-1 positivitet for identifikasjon av Sca-1+-/CD31- subfraction. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk oversikt over eksempel forberedelse fører til hjerte SP sorteringen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: protokoll for endothelial avstamning induksjon og differensiering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: mus SP-CPC spredning når belagt på en lav celle tetthet under forskjellige serum konsentrasjoner på LN og FN. (A og B) Disse skjermbildene viser cellen tallene på dag 2. (C og D) Disse panelene Vis levedyktigheten til dag 2. Dataene vises som gjennomsnittlig ± standard feil av gjsnitt (SEM); N = 5; ulike passasjer; p < 0,05 av Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: mus SP-CPC spredning når belagt på et høyt tetthet under forskjellige serum konsentrasjoner på LN og FN. (A og B) Disse skjermbildene viser cellen tallene på dag 2. (C og D) Vis disse panelene levedyktigheten til dag 2. Dataene vises som gjennomsnittlig ± SEM; N = 5; ulike passasjer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: celle morfologi på 14 og 17 d under av differensiering. Denne illustrasjonen viser lyse-feltet (BF) bilder av musen SP-CPC seeded LN - eller FN-belagt retter med lav (Low) eller en high (høy) cellen tetthet og med Medium 2 for 20 h, etterfulgt av Medium 3 for 14 eller 17 d. hvite stiplede sirkler merke områder som inneholder rund-formet celler vidd h større cellen. Avbilding ble utført med lyse-feltet mikroskopi. Forstørrelsen = 2 X; baren skala = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Tube dannelse og vWF flekker etter endothelial differensiering av SP-CPC på LN og FN. (A og B) Disse skjermbildene viser rør dannelsen. (C og D) Disse skjermbildene viser den vWF flekker. Celler ble sådd på 10 µg/mL LN - eller FN-belagt retter med en lav eller høy tetthet og middels 2 20 h, etterfulgt av Medium 3 for 21 d, høstet med Trypsin og seeded på kjeller membran matrisen. Alle bildene ble tatt etter 16 h. Avbilding ble utført med lyse-feltet mikroskopi og forstørrelsen = 2 X for paneler A og B. Avbilding utføres med fluorescerende mikroskopi og forstørrelsen = 10 X for paneler C og D. Paneler A og C viser LN-belagt retter. Paneler B og D viser FN-belagt retter. Baren skala = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: Tube formasjon etter endothelial differensiering av rotte CPC. Rotte CPC var frø på en lav celle tetthet på 10 µg/mL LN - eller FN-belagt retter med 0,1% FBS inneholder F12 medium for 20 h, etterfulgt av en annen 21 d i Medium 3, og deretter høstet med Trypsin. På kjeller membran matrisen på en 96-brønnen-tallerken, var 4 x 104 celler frø inne 100 μL Medium 3. Avbilding ble utført med lyse-feltet mikroskopi. Forstørrelsen = 2 X; baren skala = 50 µm. Dette tallet er endret basert på en tidligere studie33. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Arter | Isolasjon, oppdagelsen markør | Referanse |
| Menneskelig, rotte, mus | c-kit+/Lin-, c-kit+/CD45-, c-kit+/CD45-/CD31- | Beltrami, celle 2003; Bolle, Lancet 2011; Ellison, celle 2013; Smith, Nat Protoc 2014; Vicinanza, celledød avvike 2017 |
| Kjøter hunder | Lin-, pluss: c-kit+, MDR1+ eller Sca-1+ | Linke, PNAS 2005 |
| Mus | SCA-1+ | Oh, PNAS 2003 |
| Mus | Siden befolkningen, pluss: Abcg2+, Sca-1+/CD31-, Sca-1+/PDGFRa+ | Hierlihy, FEBS Lett 2002; Martin, Dev Biol 2004; Pfister, rundp Res 2005; Noseda, Nat kommunisert 2015 |
| Mus | Kolonien danner enhet-fibroblast, pluss: CD45-, CD31-, Sca-1+, PDGFRa+ | Pelekanos, Stem celle Res 2012 |
| Mus, rotte, menneskelige | ISL-1+ *, pluss: CD31-, c-kit-, Sca-1-, Gata4+, Nkx2.5+ | Laugwitz, natur 2005; Bu, natur 2009 |
| * Isl-1 finnes i embryonale eller fosterets myokard, ikke i voksen hjertet. | ||
Tabell 1: Isolasjon teknikker og markører av cardiac progenitor celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordeler med denne protokollen:
Denne protokollen gir en endothelial differensiering teknikk av CPC. Vi fant at en lav serum konsentrasjonen og lav celle tetthet kan forbedre effektiviteten av endothelial differensiering, der LN viste seg for å være en mer passende substrat enn FN under disse forholdene. Vi brukte to forskjellige typer CPC: rotte CPC, som ble brukt på en celle linje-lignende måte, og musen SP-CPC, som var isolert og utvidet. Spesielt protokollen var gjelder for begge typene av CPC. gjeldende teknikker tillater forskere å isolere og utvide primære CPC fra genmodifiserte mus og fra prekliniske sykdom modeller, samt fra mennesker28,36. Bruke denne protokollen på isolerte CPC kan være nyttig å undersøke ikke bare sykdommen mekanismer, men også til utforskning av romanen terapeutiske mål.
CPC er i klinisk testing for cellen terapi4,5, der celler er isolert fra pasienter og transplantert tilbake etter i vitro forsterkning. I denne forbindelse kunne protokollen presenteres her hjelpe identifisere strategier for å styrke differensiering potensialet i slike CPC før transplantasjon. Men lider cellen terapi fortsatt av begrenset effekt lav oppbevaring, overlevelse og engraftment av transplantert celler. Mekanistisk i vitro studier basert på denne protokollen eller avpasningene derav har potensial til å bidra til en bedre forståelse av molekylære mekanismer kjører prosessen-i differensiering spesielt mekanismer knyttet til celle tetthet , substrat og vekstfaktorer. Ny kunnskap Hentet fra slike studier kan til slutt brukes cellen omprogrammere og brukes til å direkte påvirke bosatt CPC å skille etter skader.
Begrensninger i denne protokollen:
Isolert primære CPC er heterogene populasjoner som viser Norge med hensyn til Cellestørrelse og celle vekst avhengig av isolering, selv når du bruker samme markører og identiske isolasjon teknikk. Derfor følgende tre punkter må være definert: (1) cellen seeding tall etter Cellestørrelse (2) ideelle serum konsentrasjonen (< 0,5%), og (3) inkubasjon tid for det første skrittet (induksjon av avstamning) med en svært lav serum konsentrasjonen. Her viser vi forskjeller i differensiering effektivitet avhengig av cellen tetthet. Men selv om vi sammenlignet lav serum (0,1% FBS) versus kultur serum konsentrasjonen (3,5% FBS), vi ikke undersøke andre konsentrasjoner i den < 0,5% FBS rekkevidde. I tillegg avhengig av isolasjon markører brukes og arter, kan effektiviteten av induksjon av avstamning forpliktelse variere. Derfor skal protokollen være optimalisert for hver celle.
Farmakologiske og genetiske hemming/induksjon teknikker kan brukes for å undersøke sykdom mekanismer med denne protokollen, i stedet for genmodifiserte eller sykdom dyr modeller. I dette tilfellet protokollen bør være redesignet: før behandling med lav serum-inneholder medium, cellene behandles med bestemte reagenser eller genetisk. Som en konsekvens, kan cellene være mer utsatt enn nontreated celler. Bruke lav serum i det første trinnet er hovedpoenget i denne protokollen. Derfor er en forsiktig validering av serum konsentrasjonen og inkubasjon tiden for første skritt for å tillate bremse celle spredning samtidig levedyktighet under serum deprivasjon avgjørende for om denne protokollen kan bli en suksess eller ikke.
Sammendrag:
I sammendraget gir isolerte CPC fra dyremodeller et verdifullt verktøy for hjerte sykdom og regeneration studier. Ved utvidelse, kan menneskelige CPC også direkte brukes for cellen terapi. Vi gi her en protokoll for effektiv endothelial avstamning induksjon og differensiering av CPC basert på forsiktig tilpasninger for cellen tetthet og serum. Fordelen med denne protokollen er brukbarheten til forskjellige typer CPC og dets muligheter til å bidra grunnlag for studiet av og/eller etablering av andre romanen cardiac gjenfødelse verktøy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Vera Lorenz for hennes nyttig støtte under forsøkene og ansatte fra funksjonen Flow cytometri fra Institutt for biomedisin (DBM), University og University Hospital Basel. Dette arbeidet ble støttet av oppholdet på sporet skal fra universitet i Basel (Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster støttes av et stipend fra det sveitsiske National Science Foundation (gi nummer 310030_156953).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
| Thrombin | 0.0005 U/mL | All necessary components included in the kit | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | All necessary components included in the kit |
References
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
- Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
- Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930 (2015).
- Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
- El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
- Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
- Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
- Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
- Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
- Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
- Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
- Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
- Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
- Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
- Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
- Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
- Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).
- Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).
- Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
- Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).
- Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
- Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).
