Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטת בידול אנדותל עבור ובתאים הלב. הוא מתמקד במיוחד כיצד סרום ריכוז וצפיפות זורעות תא משפיעים על פוטנציאל התמיינות אנדותל.
Abstract
ובתאים הלב (CPCs) ייתכן טיפולית פוטנציאל התחדשות לב לאחר פציעה. בלב יונקים בוגרים, CPCs מהותי נדיר, אך CPCs המורחב יכול להיות שימושי עבור טיפול בתאי. תנאי הכרחי לשימוש שלהם הוא היכולת להתמיין בצורה מבוקרת שושלות לב שונים באמצעות פרוטוקולי מוגדר ויעיל. בנוסף, על הרחבת במבחנה , CPCs מבודדים מחולים או מחלות פרה מודלים עשויים להציע כלי מחקר פורה לחקירה של מנגנוני המחלה.
מחקרים נוכחיים להשתמש סמנים שונים לזיהוי CPCs. עם זאת, לא כולם באים לידי ביטוי אצל בני אדם, אשר מגביל את השפעת translational מחקרים פרה. פרוטוקולים בידול הרלוונטיים ללא קשר ההבעה טכניקה, סמן בידוד יאפשר הרחבת מתוקננת ואת לקרקע של CPCs לצורך טיפול תא. כאן נתאר כי לקרקע של CPCs תחת ריכוז נמוך סרום שור עוברית (FBS) ותנאי צפיפות נמוכה תא מקלה את הבידול אנדותל של CPCs. באמצעות שתי subpopulations שונות של עכבר, חולדה CPCs, אנו מראים ש-laminin את זה יותר המצע מתאימה יותר fibronectin למטרה זו תחת פרוטוקול הבאים: לאחר culturing במשך 2-3 ימים בינוני כולל תוספי תזונה זה לשמור על multipotency ועם 3.5% FBS, CPCs נזרע על laminin ב < 60% הנהרות ותרבותית ב ללא תוספת בינוני עם ריכוזים נמוכים של FBS (0.1%) 20-24 שעות לפני בידול בידול אנדותל בינוני. מאחר CPCs הם אוכלוסיה הטרוגנית, סרום ריכוזים ושעות הדגירה עשוי צריכים להיות מותאמים בהתאם המאפיינים של subpopulation בהתאמה עלות לקליק. בהתחשב בכך, הטכניקה ניתן להחיל על סוגים אחרים של CPCs כמו גם והוא מספק שיטה שימושית כדי לחקור את הפוטנציאל ואת המנגנונים של בידול, כיצד הן מושפעות על ידי מחלת בעת שימוש CPCs מבודד מן המחלה בהתאמה מודלים.
Introduction
מחקרים שנעשו לאחרונה לתמוך את קיומו של תושב ובתאים הלב (CPCs) של הלב יונקים בוגרים1,2,3, CPCs יכול להיות מקור שימושי עבור טיפול בתאי לאחר פציעה לב4, 5. בנוסף, CPCs המורחב עשוי לספק מודל פורה והתרופות הקרנה, החקירה של מנגנוני המחלה כאשר מבודדים מחולים עם cardiomyopathies נדירים, או ממחלת בהתאמה מודלים6,7.
CPCs מבודד בלב למבוגרים בעלי גזע/קדמון תא מאפיינים1,2,3,8 כפי שהם multipotent, clonogenic, יש יכולת התחדשות עצמית. עם זאת, ישנן אוכלוסיות שונות (sub) רבים של CPCs מפגין סמן משטח שונה פרופילים, כולל, למשל, c-kit, Sca-1 ואחרים, או שאוחזרו באמצעות טכניקות שונות בידוד (טבלה 1). מספר פרוטוקולים תרבות ובידול כבר הוקמה1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. פרוטוקולים אלה משתנים בעיקר ביחס גורם גדילה והתוכן סרום, אשר מותאמים בהתאם לצורך culturing, אשר יכול להוביל הבדלי תוצאות ותוצאות, לרבות יעילות בידול.
טכניקות בידוד המבוסס על סמן:
CPCs ניתן לבודד המבוסס על סמן משטח מסוים ביטוי1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. מחקרים קודמים מצביעים כי c-kit, Sca-1 ייתכן הסמנים הכי טוב כדי לבודד תושב CPCs1,11,14,19,20. כי אף אחד סמנים אלה הוא באמת ספציפי CPCs, שילובים של סמנים שונים בדרך כלל מוחלים. לדוגמה, בעוד CPCs אקספרס רמות נמוכות של c-kit21, c-kit מתבטאת גם על ידי סוגי תאים אחרים, כולל תאי פיטום22, תאי אנדותל23של תאי גזע hematopoietic/קדמון24. בעיה נוספת היא העובדה כי לא כל הסמנים מבוטאים על-פני כל המינים. זהו המקרה Sca-1, אשר מבטא את העכבר אך לא אנושי25. לכן, באמצעות פרוטוקולים שאינן תלויות סמני בידוד עשוי להיות יתרון על רקע ניסויים קליניים ומחקרים באמצעות דגימות אנושי.
סמן תלויית בידוד טכניקות:
ישנן מספר טכניקות העיקריים של עלות לקליק בידוד, אשר אינם תלויים בראש ובראשונה ביטוי סמן משטח, אך אשר יכול להיות מעודן על-ידי בחירת ברציפות subfractions סמן-חיובית מסוימת. כנדרש (ראה גם לוח 1). (1) הטכניקה האוכלוסייה (SP) צד במקור מלווה בקרב אוכלוסיה פרימיטיבית של תאי גזע hematopoietic מבוסס על היכולת בזרימת לצבוע דנ א Hoechst 3334226 ב- ATP-איגוד קלטת (ABC) מובילי27. תאי SP לב מבודדת על ידי קבוצות שונות ודיווח לבטא מגוון של סמנים עם כמה הבדלים משניים בין דוחות2,8,13,14. (2) יחידה המושבה יוצרי תאי פיברובלסט (CFU-Fs) במקור הוגדרו בהתבסס על תא סטרומה mesenchymal (MSC)-כמו פנוטיפ. MSCs מבודד מתורבתים על מנות לזירוז הקמת המושבה. כגון המושבה יוצרי MSC דמוי CFU-Fs ניתן לבודד מהלב למבוגרים, והם מסוגלים להתמיין שושלות לב15. (3) Cardiosphere נגזר תאים (CDC) הם תאים בודדים נגזר אשכולות של התאים גדלו של ביופסיות רקמות או explants28,29,30,31. זה הוצג לאחרונה זה בעיקר את CD105+/CD90–/c-kit– תא שבר מוצגים cardiomyogenic, פוטנציאל הרגנרציה32.
כאן, אנו באמצעות SP-CPCs מבודד מן העכברים, מספקים פרוטוקול אינדוקציה יעיל של השושלת אנדותל מבוסס על מחקר קודם CPCs חולדה, עכבר SP-CPCs33. הפרוטוקול מכיל עיבודים ספציפית לתרבות, טכניקה הרחבה לגבי צפיפות התאים, התוכן סרום של המדיום, ואת המצע. זה יכול לחול לא רק על העכבר SP-CPCs אך לסוגים שונים של CPCs למטרה לזירוז מתג גורל מ הגברה ל CPC אנדותל שבוצעו, יהיה זה על רקע השתלת תאים אלה או השימוש בהם ללימודי מכניסטית במבחנה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השימוש של עכברים תא בידוד מטרה לפי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה ועם חוק ההגנה שוויצרי, אושרה על-ידי השלטונות הקנטונים שוויצרי.
הערה: את ניתוקה של Sca-1+/CD31– SP-CPCs מהלב עכבר נעשה בעיקרו של דבר כפי שתואר לעיל34 עם מספר שינויים. החומרים והשירותים ריאגנטים בשימוש, ראה טבלה של חומרים. עבור כל הניסויים, הלב SP-CPCs מבודד מן העכברים היו מוגבר, passaged, שימוש באופן קו דמוי תא. פסוקים 7-20 השתמשו במחקר זה.
1. רקמות הכנה
הערה: כל ניסויים שימוש בעכברים צריך להתבצע על פי הנחיות תקנות. פרוטוקול זה משתמש ארבעה עכברים. צלחות תרבות כי הם 100 מ מ קוטר מתוארים P100, צלחות תרבות המהווים 60 מ מ קוטר מתוארים P60 בחלקים הבאים של הפרוטוקול.
- להזריק כל עכבר עם 200 מ"ג/ק"ג של פנטוברביטל intraperitoneally (i.p.) ולחכות עד זה הוא מורדם לחלוטין על-ידי בדיקת תגובתה שאורך צובט.
- נגב את החזה עם 70% אתנול. חותכים את העור ואת בית החזה קיר עם מספריים כדי לחשוף את חלל בית החזה.
- הרם את הלב עם מלקחיים, לחתוך אותו בבסיס באמצעות מספריים. לשים את הלב P100 25 מ ל (5 מ"ל עבור P60) של קרות באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) (שלוש עד חמש לבבות לכל P100) או לבבות אחד או שניים לכל P60.
- משאבת הלב עם מלקחיים כדי להוציא את הדם החללים (איור 1 א').
- לשים את הלב P100 25 מ ל (5 מ"ל עבור P60) ל- PBS קר לרחצה. הסר את אטריה בעזרת מספריים קטנות. לחתוך את הלב לתוך שתי חתיכות האורך ולשטוף אותם שוב ב- PBS קר כקרח (25 מ ל/P100, 5 מ ל/P60).
- להעביר את החתיכות P100 חדש עם 25 מ ל (5 מ"ל עבור P60) של PBS קר. לחתוך את החלקים לחלקים קטנים יותר בעזרת מספריים קטנות (איור 1B). להוסיף טיפה של 1 מ"ג/מ"ל collagenase B מדולל של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS), מינצ את חתיכות קטנות ביסודיות עם סכין גילוח סטרילי (איור 1C).
2. מערכת העיכול
- להוסיף 10 מ ל (2.5 mL עבור P60) של הפתרון B collagenase 1 מ"ג/מ"ל למנה מהשלב 1.6.
- לשים את הפתרון collagenase B המכיל את השברים הלב טחון מוטה (כ-30 מעלות) P100 (או P60) בחממה של 37 ° C (איור 1D).
- דגירה החלקים הלב טחון לתקופה מקסימלית של 30 דקות; homogenize על ידי שוב ושוב הכנסתם פיפטה פסטר כל 10 דקות במהלך הדגירה (איור 1E).
הערה: חשוב לא תעלה על 30 דקות של דגירה סה עבור שלב 1.3.
3. סינון
- להוסיף 10 מ ל (5 מ"ל עבור P60) של HBSS קר בתוספת 2% FBS ליצירות לב טחון הומוגני.
הערה: HBSS בתוספת 2% FBS המרווה פעילות collagenase B. - לסנן את החתיכות הלב דרך מסנן 100 מיקרומטר להסיר את רקמת מעוכל צנטריפוגה ב x 470 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) (איור 1F, מסננים צהוב).
- למחוק את תגובת שיקוע resuspend בגדר ב 5 מ ל (3 מ"ל של P60) של תאי הדם האדומים פירוק מאגר ו דגירה בגדר במשך חמש דקות עם רועדת פה ושם על קרח.
- להוסיף 10 מ ל (5 מ"ל עבור P60) ל- PBS (להפסיק את תגובת פירוק) ולסנן את הדגימה דרך מסנן 40 µm כדי לא לכלול תאים גדולים יותר, כולל שיורית cardiomyocytes (איור 1F, מסננים כחול).
- Centrifuge את הצינור ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב RT (ללא בלימה). למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 1 מ"ל של DMEM כולל 10% FBS.
- לספור את התאים aliquot עם hemocytometer. Resuspend התאים עם DMEM כולל 10% FBS, מכוון ריכוז התא האחרון של עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל....
הערה: בערך 5 x 106 תאים cardiomyocyte, כדוריות דם אדומות-מדולדל יכול להיות המשוער העכבר. - להפיץ את התאים לתוך שני צינורות (איור 2): שפופרת A, להוסיף 1.5 mL עבור Hoechst 33342 מכתים עם verapamil; הרכבת התחתית B, להוסיף 18.5 מ עבור צביעת Hoechst 33342 והמשך כתם ולמיין תאי SP לב (שלבים 4.1 ו- 4.2) על ידי cytometry זרימה.
4. מיון תאי הלב SP מאת Cytometry זרימה
הערה: Verapamil מעכב Hoechst בזרימת על ידי חסימת multidrug ההתנגדות פעילות טרנספורטר (MDR) ABC. Hoechst 33342 הוא צבע DNA מחייב כי ניתן להשתמש בתאים חיים כדי לזהות את מחזור התא כמו זה קשור עם תוכן ה-DNA. תאים Hoechst-33342-הבלטת ממד מופיעים בחלק Hoechst נמוכה בשני ערוצים פליטה (450 nm, כחול Hoechst; 650 nm, Hoechst אדום), בצד של Hoechst תמך "האוכלוסייה העיקרית", נותן להם השם "לצד האוכלוסייה שלהם". SP התאים מועשרים בתאים בעלי תכונות קדמון, הצג ביטוי גבוהה של מובילי ABC multidrug עמידים (כגון MDR1 ו ABCG2). Hoechst 33342 נכתב כ/כפי Hoechst בחלקים הבאים של הפרוטוקול. חשוב להגן על חומרים רגישים לאור תוצאות אידיאלי.
-
צביעת עם Hoechst נוכחות, היעדר verapamil
- להוסיף הפתרון תא verapamil (עם ריכוז סופי של 83.3 מיקרומטר) ו Hoechst (עם ריכוז הסופי של 5 µg/106 תאים). שפופרת A, השתמש Verapamil Hoechst; הרכבת התחתית B, השתמש Hoechst בלבד. דגירה באמבט מים (ב 37 ° C) במשך 90 דקות ולחזור הצינורות כל 20 דקות (איור 1 ג'י).
- Centrifuge הצינורות ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב RT. להשליך תגובת שיקוע, resuspend כל גלולה ב- HBSS (1 x 106 תאים/mL).
- . קח mL 1.5 aliquot stainings יחיד ובקרה שלילי הרכבת התחתית B (איור 2): (i) fluorescein isothiocyanate (FITC)-מצומדת אנטי-Sca-1; (ii) allophycocyanin (APC)-מצומדת anti-CD31; (iii) תאים nonstained (בקרה שלילית).
הערה: Isotype פקדים משמשים כאן עבור הגדרת פרוטוקול בידוד. - צנטריפוגה צינורות A ו- B , את aliquots מכתים בודד ושלילית שליטה ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב RT לכביסת Hoechst, verapamil.
- למחוק את תגובת שיקוע resuspend כדורי של שפופרת A וכן (iii) הפקד שלילי ב 250 µL של HBSS, לשמור אותם על קרח בחושך עד מיון.
- Resuspend בגדר של הרכבת התחתית B 200 µL של HBSS, בגדר של (i, ii) את aliquots מכתים יחיד ב- 100 µL של HBSS. הוסף FITC מצומדת אנטי-Sca-1 (0.6 µg/107 תאים) מצומדת APC אנטי-CD31 (0.25 µg/107 תאים). דגירה כדורי במשך 30 דקות על קרח ומנערים אותם מפעם לפעם בחושך.
- להוסיף 2 מ של HBSS הצינורות. Centrifuge הצינורות ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב- RT.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend כל החבילות עם 1 מ"ל של HBSS, צנטריפוגה כמו לעיל. למחוק את supernatants. Resuspend בגדר של aliquots מכתים יחיד ב- 200 µL של HBSS. Resuspend בגדר של הרכבת התחתית B ב- HBSS (20 x 106 תאים/mL).
- שומרים את הדגימות על קרח, מוגן מפני אור עד מיון.
-
מיון עם cytometry זרימה
- להכין סטרילי mL 1.5 מיון צינורות עם 500 µL של HBSS כולל 2% FBS.
- כתם התאים עם 7-aminoactinomycin D (7-מ) (0.15 µg/106 תאים) על קרח למשך 10 דקות כדי לא לכלול תאים מתים.
- למיין את SP הלב באמצעות ההגדרות הבאות: לרגש Hoechst באמצעות עירור 350 nm (UV), לאסוף את פליטת קרינה פלואורסצנטית עם 450/50 ננומטר הלהקה לעבור סינון (Hoechst כחול) ועם 670/30 ננומטר הלהקה לעבור סינון (Hoechst אדום) ולהשתמש בגודל החרירים של 100 מיקרומטר ואת הלחץ 15 psi.
- לניתוח, להקליט 5 x 10 אירועים5 על הדגימות המיון ואירועים5 עונה 1 פרק 10 עבור שליטה שלילי, verapamil שליטה, מכתים בודדת דגימות.
הערה: הלב SP הוא כ- 0.5% - 2% (איור 1 H) אבל עשוי להשתנות בין המעבדות מבודד. /CD31 Sca-1+– שבר הוא סביב 1% - 11% של SP לב מוחלט (איור 1I) אבל עשויים להשתנות בין המעבדות מבודד. Sca-1+/CD31– SP-CPCs נכתבות כמו SP-CPCs בחלקים הבאים של הפרוטוקול.
5. ראשי תרבות של SP מבודד-CPCs
הערה: שלושה סוגים שונים של מדיה שימשו פרוטוקול זה. הם מכונים בינוני 1 (לפי נוזדה. et al.) 8, 2 בינוני, ו 3 בינוני והם המתוארות בטבלה של חומרים לגבי הרכב שלהם.
- לחמם בינוני 1 ל 37 ° C לפני השימוש ולהרגע לצנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס. Centrifuge צינורות המיון ב 4 ° C ו- x 470 גרם במשך 6 דקות, resuspend תאי 1 בינוני.
- לשים את התאים על מאכל P60 חדיר גז עם 4 מ ל 1 בינוני. לשנות את המדיום בכל בתלת-ממד עד התאים הגיעו למפגש 70% - 80%.
הערה: שלב 5.2 עשויה להימשך בסביבות 2-3 שבועות.
6. הרחבת ובידול של SP-CPCs
-
תרבית תאים
- תרבות 3 x 105 SP-CPCs 8 מ ל 1 בינוני בבקבוקון T75.
- דגירה SP-CPCs ב 37 ° C עם 5% CO2 עד 70% - 80% הנהרות, שינוי המדיום d כל 2-3.
הערה: המספר התא צריך להיות שונה לפי סוג CPCs בשימוש זמן ההכפלה, גודל התא.
-
SP-CPC הצמיחה ואת הכדאיות תחת ריכוזים שונים בסרום
- תרבות SP-CPCs במשך 2-3 d ב- T75 מבחנות עם 8 מ ל 1 בינוני. בזהירות תשאף המדיום ולשטוף בעדינות עם 5 מיליליטר (37 ° C) HBSS חמות.
- לטיפול תאי עם 5 מ של טריפסין-EDTA עבור 5 דקות בחממה תא, הוסף 5 מ של בינוני 1 להפסיק את הפעילות טריפסין, ולהעביר התליה תא לרכבת התחתית 15 מ"ל.
- Centrifuge התאים ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב- RT.
- Resuspend התאים בינוני 1 או 2 בינוניים (שושלת היוחסין אינדוקציה בינוני), צלחת 2.5 10x5 SP-CPCs על P60 מנות עם 3 מ"ל של מדיום המכילים ריכוזים שונים בסרום.
- לאסוף את המדיום המנה של צעד 6.2.4 עבור האוסף של תאים מתים לתוך צינור 15 מ"ל לאחר 2 ד' של culturing בינוני 1 או 2 בינוניים.
- Trypsinize תאים חסיד כמו שלב 6.2.2 ולאסוף התליה תא לתוך הצינור 15 מ"ל של צעד 6.2.5. Centrifuge התאים ב x 840 גרם במשך 5 דקות ב- RT.
- וארוקן את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל של בינוני 1 או 2 בינוניים לספירת תאים. כתם SP-CPCs עם trypan blue (0.4%) ו- count trypan blue-חיוביות (המלח) ותאים trypan blue-שלילי (מעשית).
הערה: הכדאיות תא (שלב 6.2.7) ניתנת כמספר trypan-כחול התא שלילי ביחס המספר בתא סכום.
-
אינדוקציה של בידול אנדותל
- Precoat צלחת תרבות (6-טוב) עם µg/mL 10 laminin (LN) או fibronectin (FN).
- להפוך את פתרון מצע המכיל 10 µg/mL של LN או FN עם F12 בינוני (או PBS). להוסיף 2 מ"ל של המצע פתרון טוב לכל. לשמור על הלוח למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- האחות הפתרון מהצלחת ולהוסיף 2 מ של PBS מכל קידוח עד השימוש בו.
- האחות המדיום מתאי מהשלב 6.1.2 לשטוף אותם בעדינות עם 5 מיליליטר (37 ° C) HBSS חמות, להתייחס אליהם עם 5 מ של טריפסין-EDTA עבור 5 דקות בחממה תא, הוסף 5 מ של בינוני 1 להפסיק את הפעילות טריפסין, להעביר התליה תא צינור 15 מ"ל.
- Centrifuge התאים ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב RT. לשאוב תגובת שיקוע והוסף בינוני 2 לספירת תאים.
- 4 תאי זרע 8 x 10 טוב על צלחת מצופה עם 3 מ"ל של 2 בינוני ולשמור אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20-24 ח' שינוי המדיום עד 3 מ"ל של 3 בינוני.
הערה: אנו ממליצים על שימוש בינוני המכילים ריכוז נמוך סרום — וללא תוספי מזון — עבור ה 20-24 הראשון. המלצנו באמצעות < הנהרות תא 60% (כלומר, המספר הנייד של שלב 6.3.4 יש יותאם בהתאם גודל התא וקצב גדילה). - התרבות התאים עבור 21 d ושנה המדיום בכל בתלת-ממד.
- לוודא הטבע אנדותל של תאים על-ידי מכתימה אותם עם סמן אנדותל כגון Willebrand פון פקטור (vWF), מיקרוסקופיה פלורסצנטיות ביצוע.
- לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS ולתקן את התאים ב- 3.7% פורמלדהיד למשך 2 דקות ב- RT.
- Permeabilize התאים עם 0.1% X טריטון ddH2O (או PBS) במשך 30 דקות, לחסום את זה עם נסיוב עז 10% 1 h RT.
- דגירה התאים עם אנטי-פון Willebrand גורם נוגדנים (1: 100) במשך 48 שעות ב 4 ° C
- לשטוף את התאים 3 x עם 1 מ"ל ל- PBS, 10 דקות בכל פעם. תקופת דגירה אותם עם אלקסה עבור חיל הים 546 עז ארנב אנטי משני נוגדנים (שבערך) של h 1 ב RT בחושך.
- תשטוף שוב 3 x, למשך 10 דקות כל אחד, עם 1 מ"ל ל- PBS. כתם גרעינים תא עם 4'6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (דאפי; שבערך) עבור 5 דקות ב RT בחושך.
- לשטוף את התאים 3 x, למשך 5 דקות כל אחד, עם 1 מ"ל ל- PBS. הר התאים ואחסן אותם ב 4 ° C
הערה: התנאים culturing (המצע, בינוני, ריאגנטים משלימה, וריכוז FBS) של שלבים 6.1 ו- 6.3 מתוארים באיור3.
- Precoat צלחת תרבות (6-טוב) עם µg/mL 10 laminin (LN) או fibronectin (FN).
-
צינור היווצרות assay
- מטריצה קרום המרתף (למשל, Matrigel, המכונה מעתה ואילך מטריקס) להכין צלחת.
- הפשרת המטריצה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- המעיל צלחת 96-ובכן עם 100 µL המטריקס על קרח.
הערה: חשוב להימנע בועות במטריקס. לוחיות הרישוי חייב להיות מצופה בקרח כדי למנוע את jellification של המטריקס. - לשמור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- האחות המדיום מתאי (לאחר סיום שלב 6.3.5) לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר (37 ° C) HBSS חמות ובעדינות לטפל בהם עם טריפסין-EDTA בשביל 5 דקות בחממה התא. להוסיף 3 בינוני להפסיק את הפעילות טריפסין ולהעביר התליה תא ל צינור 15 מ"ל.
- Centrifuge התאים ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב RT. לשאוב תגובת שיקוע, להוסיף 1 מ"ל של 3 בינוני, ו pipet בעדינות.
- לסנן את התאים עם מסננת תא מיקרומטר 35, אם התאים נצברות.
- לספור את התאים, זרע 2 x 103 כדי 4 x 103 תאים µL 100 של 3 בינוני בכל מטריצה מצופים היטב. לקחת את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס בחממה תא עבור 16 h.
- צלם תמונה עם מיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה X 2.
הערה: במקרה של trypsinization לא שלם, להאריך את זמן החשיפה כדי טריפסין-EDTA למקסימום של 7-8 דקות.
- מטריצה קרום המרתף (למשל, Matrigel, המכונה מעתה ואילך מטריקס) להכין צלחת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בידוד SP-CPC העכבר:
במחקר זה, השתמשנו CPCs העכבר מבודד על פי פנוטיפ SP, ואילו תוצאות של עכברוש CPCs ששינה והוסיף מן הדוח הקודם עם הרשאה (איור 8)33.
התפשטות תאים מתחת הצפיפויות גבוהות ונמוכות תא, עם ריכוזים שונים בסרום:
שלנו מחקר קודם הראה כי הביטוי mRNA של סמנים השושלת הלב שונה בתוך 24 השעות הראשונות culturing שלב. זה ידוע כי מטריצות משפיעה על החלטות גורל התא, לרבות בידול אנדותל35. לחקור תנאים מתאימים להנחיה של השושלת אנדותל המחויבות של CPCs, היינו FN ו- LN (שני 10 µg/mL) על צלחת. ובכן 6 (אזור גידול: 9.6 ס מ2/טוב) במחקר זה. כי החלטות גורל מחזור התא והתא הדוק, אנו מחפשים אחר התנאי תערוכות קצב התפשטות התאים נמוך בהיעדרו של מוות של תאים, וככזה תנאי עשוי לשקף המעבר התפשטות תאים בידול. לפיכך, אנו, החלת התנאים הבאים, לעומת המחירים התפשטות תאים: תא צפיפות, confluency גבוהה (80% - 90%), נמוך (< 60%) confluency, ועבור סרום ריכוז, תרבות נורמלי בתנאים (זה ללמוד 3.5% FBS), סרום נמוך תנאים (≤ 0.1% FBS). ראשית, בדקנו את תנאי צפיפות התאים נמוך. היו אין הבדלים משמעותיים של הכדאיות תא והתפשטות בצפיפות נמוכה תא עם 3.5% FBS בין LN FN, ואילו צפיפות התאים נמוך עם 0.1% FBS הראו שגשוג תאים ירד בעוד בהשוואה FN אבל אין עלייה מוות תאי ( איור 4). לעומת זאת, בתנאים של צפיפות גבוהה תא, סרום ריכוזים של 3.5% ו- 0.1% הראו אין הבדלים בהתפשטות תא וב -מוות של תאים בין סובסטרטים שני (איור 5).
תוצאות אלו מצביעות על צפיפות נמוכה תא ב- LN עם סרום 0.1% מקטין התפשטות מבלי להשפיע על יכולת הקיום של CPC.
שינויים במצב תא במדיום בידול אנדותל:
למרות הדורשים יותר מחקרים כדי להבין את המשמעות ואת מנגנוני הבסיסית, שינויים בצורת התא מופיעים להיות אינדיקטור של תנאים מתאימים תרבות כמו שינויים ספציפיים יכול להיות שנצפו מוקדם בתרבויות, שבו אנדותל בידול זה הולך להיות מוצלחת (איור 6). כפי שמוצג העיגולים הלבנים מקווקווים באיור 6, תוך 7-14 d במדיום בידול אנדותל, תרבויות מוצלחת הכיל תאים שהיו גדולים יותר ושונה ב מורפולוגיה תאים אחרים. מעניין, תאים אלה נעלם לקראת סוף השלב בידול, הופיעו גם במספרים נמוכים, בנקודות זמן מאוחר יותר בתרבויות בצפיפות גבוהה LN, FN. ואילו אנחנו לא לאפיין עוד תאים אלה, פרוטוקול זה מרמז מעקב אחר הצורה תא כל 2-3 d עד סביב היום ה-14. אם אין תאים כאלה מופיע, צריך להיות ירד מספר התאים נזרע.
הערכת היכולת אנדותל עם Assay היווצרות צינור:
צינור היווצרות וזמינותו היא טכניקה שימושית כדי להעריך את היעילות של אנדותל הבידול של CPCs על ידי מדידת הקיבולת היווצרות שפופרת של תאים. לכן, ביצענו וזמינותו היווצרות צינור עם תאים הבדיל בהתאם לתנאים המתוארים. מעניין, שפופרת מוצלחת היווצרות הוצגה באופן עקבי על-ידי תאי ציפוי על צפיפות נמוכה, הבדיל ב- LN, ואילו צינור היווצרות נכשל בעיקר בתאים מצופה ב- LN-צפיפות גבוהה (איור 7 א). באופן דומה, שפופרת היווצרות הצליחה בעיקר בתאים תרבותי על FN ללא התחשבות צפיפות התאים, למרות תאים הבדיל על FN-צפיפות נמוכה לפעמים נוצר צינורות בסיסי, תלוי במצבו תא (למשל, ולבודד ו/או המעבר מספר, איור 7 ב). כדי לאשר את מהות תאי אנדותל, התאים מצופה על coverslips היו הבדיל לפי הפרוטוקול המתואר, מוכתם vWF. שוב, הביטוי vWF הומוגנית, יותר ביכולת CPCs הבדיל ב- LN בהשוואה FN (איור 7Cיח). איור 8 מציגה את התוצאות של שפופרת היווצרות וזמינותו כפי שבוצע עבור מחקרים קודמים באמצעות עכבר CPCs תחת באותו הפרוטוקול כמו כאן תיאר33. תוצאות אלו מראות צינור מערך יעיל יותר בתאים הבדיל ב- LN לעומת FN כאשר מצופה בתנאי צפיפות התאים נמוך ועם בסרום נמוך (0.1% FBS) עבור 20-24 שעות לפני בידול בידול אנדותל בינוני. תוצאות אלו מראים כי פרוטוקול זה יכול להיות שימושי עבור סוגי תאים שונים ועצמאית של מינים.
איור 1: איור של בידוד מסוים צעדים כדי לקבל השעיה מדולדל cardiomyocyte תא מבודד העכבר לבבות וזרימה נציג cytometry המפרט של SP. לב (א) לוח זה מראה הפליטה של משקעי דם חללים הלב דרך חזר קלה הלחץ המופעל באמצעות מלקחיים קטנים. (B) לוח זה מראה את החיתוך של הלבבות לחתיכות קטנות בעזרת מספריים קטנות. (ג) לוח זה מראה את הא חלקי הלב באמצעות סכין גילוח. (ד) לוח זה מציג הדגירה של לבבות עוף טחון עם collagenase B צלחות מוטה ב- 37 מעלות צלזיוס. (E) לוח זה מראה את המגון של לבבות עוף טחון באמצעות פיפטה של פסטר במהלך שלב הדגירה. (F) לוח זה מראה את הסינון של הרקמה מתעכל דרך מסנן 100 מיקרומטר (צהוב) ו 40 מסנן מיקרומטר (כחול) להסרת שאריות רקמת מעוכל cardiomyocytes. (G) חלונית זו מציגה היפוך עדין של צינור חרוטי 50 מ ל המכיל התליה תא cardiomyocyte מדולדל והגלישה בנייר להגנה אור לאחר התוספת של Hoechst. (H) לוח זה מראה זרימה נציג cytometry המפרט של תאים שהוכתמו Hoechst נוכחות, היעדר verapamil מעכב טרנספורטר ABC לצורך זיהוי SP. (אני) לוח זה מציג מגרש נקודה נציג של SP תאים על פי הגישה החיובית CD31 ו- Sca-1 לצורך זיהוי /CD31 Sca-1+– subfraction. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: סקירה סכמטי של הכנת המדגם שהובילו המיון SP לב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הפרוטוקולים של השושלת אנדותל אינדוקציה ובידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: התפשטות העכבר SP-CPC כאשר מצופה ב צפיפות התאים נמוך תחת ריכוזים שונים בסרום LN, FN. (A ו- B) אלה מראות את מספרי הטלפון הנייד-יום 2. (C ו- D) אלה מראות את הכדאיות ביום 2. הנתונים מוצגים זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM); N = 5; מעברים שונים; p < 0.05 מאת הסטודנט t-מבחן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: התפשטות העכבר SP-CPC כאשר מצופה ב צפיפות גבוהה תא תחת ריכוזים שונים בסרום LN, FN. (A ו- B) אלה מראות את מספרי הטלפון הנייד-יום 2. (C ו- D) הלוחות הללו מראים את הכדאיות ביום 2. הנתונים מוצגים זאת אומרת ± ה-SEM; N = 5; מעברים שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: מורפולוגיה-14 ו- 17-d במהלך תהליך התמיינות תא. איור זה מציג בהיר-שדה (BF) תמונות של העכבר SP-CPCs נזרע על מנות LN או FN-מצופה עם נמוך (נמוך) או צפיפות גבוהה התא (הגבוה ביותר) ואת בינונית 2 עבור 20 h, ואחריו בינוני 3 עבור ד 14 או 17 לבן מקווקו עיגולים לסמן את האזורים המכילים תאים בצורת עגול שנינות h מידה תא גדול יותר. ההדמיה בוצעה עם מיקרוסקופיית שדה בהיר. ההגדלה = 2 X; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: צינור היווצרות, vWF מכתים לאחר הבידול אנדותל של SP-CPCs LN, FN. (A ו- B) לוחות אלה מראים היווצרות שפופרת. (C ו- D) אלה מראות ההכתמה vWF. התאים היו נזרע על µg/mL 10 של LN או FN-מצופים מנות עם צפיפות התאים נמוך או גבוה ועם בינוני 2 עבור 20 h, ואחריו בינוני 3 עבור 21 d, נקצרו עם טריפסין ואז נזרע על המטריקס קרום המרתף. כל התמונות צולמו לאחר 16 שעות. ההדמיה בוצעה עם מיקרוסקופיית שדה בהיר, ההגדלה = 2 X עבור לוחות A ו- B. ההדמיה מתבצע באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ההגדלה = 10 X עבור לוחות C ו- D. A ו- C מראות כלים מצופים LN. B ו- D מראות כלים מצופים FN. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: צינור היווצרות לאחר הבידול אנדותל של עכברוש CPCs. עכברוש CPCs היו נזרע על צפיפות נמוכה תא-µg/mL 10 מנות LN או FN-מצופים 0.1% FBS המכילות F12 בינונית עבור 20 h, ואחריו עוד 21 d 3 בינוני ולאחר מכן שנקטפו עם טריפסין. על המטריצה קרום המרתף על צלחת 96-ובכן, 4 x 104 תאים היו נזרע ב 100 μL של 3 בינוני. ההדמיה בוצעה עם מיקרוסקופיית שדה בהיר. ההגדלה = 2 X; סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. נתון זה משתנה בהתבסס על המחקר הקודם33. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מינים | בידוד, זיהוי סמן | הפניה |
| אנושי, החולדה, העכבר | c-kit+/Lin-, /CD45 c-kit+-, c-kit+/CD45 /CD31–– | Beltrami, 2003 תא; Bolli, Lancet 2011; אליסון, תא 2013; סמית, 2014 Protoc נט; Vicinanza, מוות של תאים שונים 2017 |
| כלבי תערובת | לין-, פלוס: c-kit+, MDR1+ או Sca-1+ | החיבור, PNAS 2005 |
| העכבר | Sca-1+ | . הו, PNAS 2003 |
| העכבר | לצד האוכלוסייה, פלוס: Abcg2+, Sca-1+/CD31-, Sca-1+/PDGFRa+ | Hierlihy, FEBS שמאלית 2002; . מרטין, Dev Biol 2004; בית פיסטר, עיגולים Res 2005; נוזדה, Nat Commun 2015 |
| העכבר | המושבה ויוצרים יחידה-פיברובלסט, פלוס: CD45-, CD31-, Sca-1+, PDGFRa+ | Pelekanos, גזע תא Res 2012 |
| עכבר, עכבר, אדם | Isl-1+ *, ובנוסף: CD31-, c-kit-, Sca-1-, Gata4+, Nkx2.5+ | Laugwitz, 2005 הטבע; Bu, טבע 2009 |
| * Isl-1 נמצא בשריר עובריים או עוברי, לא בלב למבוגרים. | ||
טבלה 1: בידוד טכניקות וסמנים של ובתאים הלב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היתרונות של פרוטוקול זה:
פרוטוקול זה מספק טכניקה בידול אנדותל של CPCs. מצאנו כי ריכוז בסרום נמוכה בעלת צפיפות נמוכה תא יכול לשפר את היעילות של בידול אנדותל, לפיה LN נוכחו להיות מצע מתאים יותר מאשר FN בתנאים אלה. . היינו שני סוגים שונים של CPCs: עכברוש CPCs, אשר היו בשימוש של התא, כמו קו באופן, ועכבר SP-CPCs, אשר היו מבודדים והתרחבה. ראוי לציין, הפרוטוקול הייתה ישימה על שני הסוגים של זרם CPCs. טכניקות לאפשר המדענים לבודד ולהרחיב את CPCs הראשית של עכברים מהונדסים מן המחלה פרה מודלים, כמו גם מן בני28,36. באמצעות פרוטוקול זה על CPCs מבודדים יכולים להיות לעזר החקירה מנגנוני המחלה לא רק אלא גם על חקר הרומן מטרות טיפוליות.
CPCs נמצאים כיום ניסויים קליניים עבור תא טיפול4,5, לפיה תאים הם בודדו אותנו מהמתרחש חולים ובחזרה המושתלים לאחר הגברה במבחנה . בהקשר זה, פרוטוקול המובאת כאן יכול לעזור לזהות אסטרטגיות לשיפור פוטנציאל התמיינות של CPCs כזה לפני השתלת. עם זאת, טיפול בתאי עדיין סובל יעילות מוגבלת עקב השמירה נמוך, הישרדות, engraftment של התאים המושתלים. מכניסטית במבחנה מחקרים המבוססים על פרוטוקול זה או על עיבודים הימנו יש פוטנציאל לתרום הבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים נהיגה התהליך-in של בידול מסוים, מנגנונים הקשורים צפיפות תא , המצע, גורמי גדילה. ידע חדש שאוחזר ממחקרים כאלה עשויים בסופו של דבר לשמש עבור תא התכנות ויישם להשפיע ישירות על CPCs תושב להבדיל לאחר פציעה.
מגבלות של פרוטוקול זה:
CPCs העיקרי מבודדים הם אוכלוסיות הטרוגניות המציגים פנוטיפים שונים גודל התא, התא שיעור הצמיחה בהתאם הבידוד, גם כאשר באמצעות סמנים באותה טכניקה בידוד זהים. לפיכך, שלוש הנקודות הבאות צריכה להיות מוגדרת: (1) תא זריעה מספרים על פי גודל תא, (2) את הריכוז סרום אידיאלי (< 0.5%), ו- (3) זמן הדגירה עבור השלב הראשון (אינדוקציה של שושלת היוחסין) עם ריכוז נמוך מאוד סרום. כאן, אנו מראים הבדלים בידול יעילות בהתאם צפיפות התאים. עם זאת, למרות השווינו בסרום נמוך (0.1% FBS) לעומת תרבות סרום ריכוזי (3.5% FBS), לא נבחן ריכוזים אחרים בתוך < 0.5% FBS טווח. בנוסף, בהתאם את סמני בידוד המשמש את המין, היעילות של אינדוקציה שושלת היוחסין המחויבות עשויים להשתנות. לכן, צריך להיות מוטבת הפרוטוקול עבור כל סוג התא.
עיכוב/אינדוקציה תרופתי ותעשיה טכניקות יכול לשמש לבחינת מנגנוני המחלה עם פרוטוקול זה, במקום מהונדסים גנטית או מחלת חייתיים. במקרה זה, כדאי להיות מחדש את הפרוטוקול: לפני הטיפול בינונית-נמוכה-סרום-המכיל, התאים יטופלו עם ריאגנטים ספציפיים או כלים גנטיים. כתוצאה מכך, תאי עשוי להיות פגיע יותר מאשר תאים nontreated. שימוש בסרום נמוכה בשלב הראשון הוא נקודת המפתח של פרוטוקול זה. לכן, אימות זהיר של ריכוז סרום וזמן הדגירה על הצעד הראשון לאפשר להאט את התפשטות תאים תוך שמירה על הכדאיות תחת מניעת סרום הוא קריטי אם פרוטוקול זה יכול להיות סיפור הצלחה או לא.
תקציר:
לסיכום, CPCs מבודדים של מודלים בעלי חיים מספקים כלי רב ערך עבור לימודים קרדיולוגיים מחלות והתחדשות. על הרחבה, CPCs האדם עשוי ישירות לשמש גם לטיפול התא. אנחנו, כאן, לספק פרוטוקול עבור אינדוקציה השושלת אנדותל יעיל, הבידול של CPCs מבוסס על עיבודים זהיר של ריכוזים צפיפות, סרום התא. היתרון של פרוטוקול זה הוא את תחולתן לסוגים שונים של CPCs, את הפוטנציאל לתרום בסיס המחקר ו/או הקמת כלים חדשניים התחדשות לב אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים תודה ורה לורנץ את תמיכתה מועיל במהלך הניסויים, והעובדים מהמתקן Flow Cytometry מן המחלקה וההתערבות (DBM), האוניברסיטה אוניברסיטת בית החולים באזל. עבודה זו נתמכה על ידי השהייה בעל המסלול לתוכנית של אוניברסיטת בזל (Michika מוצ'יזוקי). גבריאלה מ Kuster נתמך על ידי מענק של קרן המדע הלאומית השוויצרית (310030_156953 מספר גרנט).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
| Thrombin | 0.0005 U/mL | All necessary components included in the kit | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | All necessary components included in the kit |
References
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
- Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
- Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930 (2015).
- Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
- El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
- Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
- Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
- Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
- Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
- Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
- Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
- Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
- Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
- Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
- Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
- Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
- Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).
- Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).
- Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
- Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).
- Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
- Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).
