Summary
نحن نقدم طريقة لتقييم مدى الضرر/موت الخلايا على السطح المفصلي للمفاصل مورين سليمة المكانية بعد تطبيق الأحمال الميكانيكية التي تسيطر عليها أو الآثار. يمكن استخدام هذا الأسلوب للتحقيق في كيف تؤثر هشاشة العظام، والعوامل الوراثية و/أو تحميل مختلف الأنظمة العلاجية على الضعف في الموقع تشوندروسيتيس.
Abstract
التوازن غضروف مفصلي يعتمد على بقاء خلايا المقيم (تشوندروسيتيس). لسوء الحظ، يمكن للصدمات الميكانيكية حمل الموت تشوندروسيتي على نطاق واسع، يمكن أن يفضي إلى انهيار لا رجعة فيها المشترك وظهور هشاشة العظام. بالإضافة إلى ذلك، المهم الحفاظ على استمرارية chondrocyte في osteochondral الابتزاز الإجراءات للنتائج الجراحية المثلى. نحن نقدم طريقة لتقييم مدى الضرر/موت الخلايا على السطح المفصلي للمفاصل الزلالي مورين سليمة المكانية بعد تطبيق الأحمال الميكانيكية التي تسيطر عليها أو الآثار. يمكن استخدام هذا الأسلوب في الدراسات المقارنة للتحقيق في آثار أنظمة مختلفة تحميل الميكانيكية، وظروف بيئية مختلفة أو التلاعب الجيني، وكذلك مختلف مراحل انحلال الغضروف على قصيرة أو طويلة الأجل ضعف chondrocytes مفصلي في الموقع. وهدف البروتوكول في المخطوطة لتقييم مدى الضرر/موت الخلايا على السطح المفصلي للمفاصل الزلالي موريني المكانية. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب من الاختبار في غضروف سليمة تماما دون المساس بشروط الحدود الأصلية. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح للتصور في الوقت الحقيقي لحيوية الملون chondrocytes مفصلي وتحليل واحد يستند إلى صورة خلية الضرر الناجم عن تطبيق الساكنة التي تسيطر عليها وأثر تحميل أنظمة. تثبت النتائج التي توصلنا إليها الممثل أنه في explants الغضاريف صحية، تعتمد حساسية المكانية مدى إصابة الخلية على كثافة حجم وتأثير الحمل. لدينا طريقة يمكن تكييفها بسهولة للتحقيق في آثار أنظمة مختلفة تحميل الميكانيكية، وظروف بيئية مختلفة أو تلاعب الوراثية المختلفة على ضعف الميكانيكية في الموقع chondrocytes مفصلي.
Introduction
غضروف مفصلي (AC) هو حمل الأنسجة التي تغطي وتحمي العظام في المفاصل الزلالي، توفير سلاسة صياغة مشتركة. التوازن الأنسجة مرهون ببقاء chondrocytes، نوع الخلية الوحيدة المقيمة في التيار المتردد. ومع ذلك، تعرض الغضروف للقوى المتطرفة بسبب الصدمة (مثلاً، شلالات، الإصابات الرياضية أو حادث سيارة) أو بسبب عدم الاستقرار المشترك اللاحق للصدمة يمكن أن يستحث الموت تشوندروسيتي، مما أدى إلى انهيار لا رجعة فيه للمشترك (هشاشة العظام) 1-علاوة على ذلك، في أوستيوتشوندرال تطعيم الإجراءات التي تهدف إلى إصلاح العيوب المحلية في الغضاريف التالفة، الفساد المرتبطة بالإدراج من الصدمات الميكانيكية يقلل من جدوى تشوندروسيتي وله آثار ضارة على نتائج العمليات الجراحية2.
غضروف explant نماذج تستخدم عادة لدراسة قابلية chondrocytes مفصلي لموت الخلايا المستحثة ميكانيكيا. عادة ما تستخدم هذه النماذج explants من الحيوانات الكبيرة لدراسة آثار تحميل الشروط والظروف البيئية والعوامل الأخرى في الخلية الضعف3،4،،من56، 7،،من89،10،11،12،13،،من1415. ومع ذلك، نظراً للحجم الكبير لآلام المفاصل، عموما هذه النماذج تتطلب إزالة المكونات من سطح مفصلي مشتركة سليمة، وبالتالي الإخلال بشروط الحدود الأصلية. وعلاوة على ذلك، أنها تتطلب بشكل عام تطبيق الأحمال الميكانيكية الكبيرة للحث على إصابة الخلية. وبدلاً من ذلك، الغضروف مورين explant النماذج توفر العديد من المزايا على نماذج حيوانية أكبر في دراسة ميكانيكية تعرض في الموقع تشوندروسيتيس. على وجه الخصوص، بسبب أبعادها أصغر، تيسير هذه النماذج اختبار غضروف مفصلي سليمة تماما دون تغيير سلامة الأنسجة الأصلية. وبالإضافة إلى ذلك، يحدث التحميل الغضروف مورين على مناطق الاتصال الصغيرة مثل أن يمكن أن يتسبب chondrocyte الموت/الإصابة مع كميات صغيرة (< 1 N). وأخيراً، جينوم الفأر هو بسهولة التلاعب بها، تمكين اختبار تأثير جينات محددة كيف القابلية في الموقع تشوندروسيتيس للإصابات الميكانيكية.
والهدف العام للطريقة التي أدخلت في هذه المخطوطة كمياً وتصور في الحقيقي مرة-مدى المكانية الموقع في خلية الموت/الإصابة بسبب الأحمال الميكانيكية المطبقة على الماوس سليمة تماما الغضروف في العظام اكسبلانتس في المختبر. يتطلب هذا الأسلوب تشريح دقيق للمفاصل الزلالي الماوس دون المساس بصلاحية تشوندروسيتي، تليها التجارب الميكانيكية لحيوية الملون explants استخدام جهاز شنت مجهر مماثلة إلى منصة اختبار التي قمنا بتطويرها مؤخرا لتحديد الخصائص الميكانيكية الغضروف موريني16. أثناء اختبار الميكانيكية، جزء كبير من سطح مفصلي (سليمة) من عظم تشريح مرئياً على صورة مجهرية صف واحد، مما يتيح التحليل السريع لبقاء الخلية بعد تطبيق حمولة. قد تم إجراء تحليل مماثل لبقاء الخلية السطحية في explants الغضاريف مورين سابقا، ولكن دون التطبيق المتزامن للتحميل17. وتشمل التطبيقات المحتملة لأسلوب لدينا دراسات مقارنة للتحقيق في ضعف chondrocytes مفصلي لمختلف الظروف البيئية والميكانيكية التي تسيطر عليها، وكذلك الفحص من العلاجات التي تهدف إلى الحد من حساسية من تشوندروسيتيس لتحميل الميكانيكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأقر جميع أعمال الحيوانات لجنة جامعة روتشستر "الموارد الحيوانية".
1-الحلول
- إعداد "الملح حل" هانك متوازن (حبس X 1) التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم ولا أحمر الفينول. قم بضبط ال pH إلى 7.4 بإضافة كميات صغيرة من HCl أو هيدروكسيد الصوديوم.
- ضبط الاسموليه لموسم 303 بإضافة كلوريد الصوديوم أو المياه. استخدام المخزن المؤقت أثناء تشريح، وإعداد العينات والاختبارات الميكانيكية.
2-تشريح القاصي عظم الفخذ وعظم العضد الدانية مع غضروف مفصلي سليمة تماما
- Euthanize الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية باستخدام حجرة استنشاق2 CO متبوعاً بخلع عنق الرحم. اتبع الأسلوب العقيم في جميع أنحاء.
ملاحظة: يمكن استخدام الفئران بين 8 و 81 أسبوعا القديمة من أي سلالة ونوع الجنس. - استخدام الأدوات الجراحية التالية لتشريح: الصغرى-مقص (تستخدم في صنع شقوق)، مقص تشريح القياسية (تستخدم لقطع العظام)، دون مشرط مع #11 شفرة المبضع (تستخدم لقطع الأنسجة الرخوة)، الملقط لصائغ (يستخدم لإزالة لينة الأنسجة) والملقط القياسية (تستخدم لتقشير الجلد والأنسجة اللينة).
- اتبع الإرشادات أدناه تشريح لعظم الفخذ البعيدة .
- وضع مؤشر الماوس في موقف ضعيف.
- جعل شق صغيرة (~ 5 مم) في الجلد في الجزء الأمامي من الركبة.
- تمديد شق الطريق حولها الركبة وسحب الجلد لفضح العضلات المشتركة والساق والركبة.
- بدءاً من نهاية عظم الفخذ الدانية، استخدام شفرة المبضع (رقم 11) لقص على طول باتجاه الأعلى. موقف بليد بين وحدة وتر عضلة الفخذ وعلى الجانب الأمامي من رمح فخذي. تمديد الخفض نحو والماضي الرضفة والانتهاء بالقطع من خلال منتصف وتر الرضفة، وبالتالي إزالة وحدة وتر عضلة الفخذ.
- بدءاً من نهاية عظم الفخذ الدانية، استخدام شفرة المبضع (رقم 11) لقص على طول باتجاه الأعلى. موقف بليد بين وحدة وتر أوتار العضلات، وعلى الجانب الخلفي من رمح فخذي. بمجرد اقتراب الخفض الركبة، تبدأ القطع من خلال الأنسجة اللينة، تجنب الاتصال بين دون مشرط وسطح مفصلي على condyles البعيدة لعظم الفخذ. الانتهاء من هذا الخفض في الماضي الركبة.
- التراجع في الفخذ وعضلات الساق لفضح عظم الفخذ. قص بعيداً أي العضلات الزائدة على جانبي الوحشي والانسي من عظم الفخذ.
- قطع عضلة الساق على الجانب الخلفي من الساق الدانية والوجه والساق تصور الجانب الخلفي من عظم الفخذ.
- كشف condyles البعيدة لعظم الفخذ والسطح الخلفي من الساق الدانية بإزالة الأنسجة الزائدة حول الركبة.
- قص الأربطة الصليبي الأمامي والخلفي باستخدام مشرط، قطع بعيداً عن condyles فخذي. سحب الساق بعيداً عن عظم الفخذ وقطع جميع الأربطة لفصل في الساق السفلي من عظم الفخذ.
- باستخدام مقص تشريح القياسية، قطع طريق عظم الفخذ في نهاية الدانية العظم (8 مم أعلاه المشتركة بين فخذي تيبيو) من الجانب الأفقي . بعد قطع العظام، مسح بعيداً أي نخاع مرئية على السطح الخارجي للعظام لتجنب التلوث المحتمل من خلايا نخاع العظام.
ملاحظة: قطع من الجانب الأفقي يقلل من خطر نشر الكراك على طول العظام. - إزالة المحيطة بالانسجة الرخوة (أي، الأربطة والعضلات الزائدة) من عظم الفخذ باستخدام الملقط لصائغ وفضح الغضروف في كلا condyles في النهاية البعيدة لعظم الفخذ. تجنب الاتصال بين الغضاريف والملقط.
- اتبع الإرشادات أدناه تشريح لعظم العضد .
- وضع مؤشر الماوس في موقف ضعيف.
- جعل شق (~ 5 مم) في الجلد على الجانب الخلفي من الكوع باستخدام مقص الصغرى وتمديد الشق حول الكوع وسحب الجلد لفضح عضلات الذراع والكتف.
- بدءاً من نهاية عظم العضد الدانية، استخدام شفرة المبضع (رقم 11) لقص على طول باتجاه الأعلى. موقف بليد بين وحدة وتر عضلة ثلاثية الرؤوس والجانب الخلفي لعظم العضد. تمديد الخفض نحو النهاية البعيدة لعظم العضد والانتهاء بالقطع عن طريق وتر ثلاثية الرؤوس.
- ثم سحب الرؤوس نهاية عظم العضد الدانية حتى يتم كشف الرأس عضدي.
- قص النسيج الضام حول الرأس عضدي باستخدام شفرة المبضع (رقم 11) دون لمس السطح المفصلي وإزالة الطرف المصاب (الذراع والكتف) من الجسم. هيدرات سطح مفصلي عضدي رأسه هبس دورياً.
- قطع عظم العضد من الذراع بكسر الأولى قبالة نهاية الزند على الجانب الخلفي من الذراع باستخدام الملقط وثم قطع النسيج الضام حول النهاية البعيدة لعظم العضد الدانية. قم بإزالة أي أنسجة الزائدة على عظم العضد.
- قطع الاحدوبه الدالية على الجانب الخلفي من عظم العضد باستخدام مقص تشريح القياسية.
- ضع specimen(s) تشريح في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل يحتوي على المخزن المؤقت لحبس.
3-يعيش (كالسين ص)/الميت (يوديد Propidium) تلطيخ البروتوكول
- وصمة عار على النحو التالي باستخدام كالسين صباحا.
- جعل حل أسهم من كالسين صباحا عن طريق إضافة 12.5 ميليلتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) في قنينة من 50 ميكروغرام من كالسين صباحا، أدى إلى تركيز مخزون من 4 ملغ/مل (4.02 مم).
- يضعف الأسهم كالسين الحل 1: 400 في حبس للوصول إلى تركيز من 10 ميكروغرام/مل (10.05 ميكرومتر) من الكالسيوم صباحا (على سبيل المثال، إضافة ميليلتر 1.25 من حل الأسهم إلى 500 ميليلتر من حبس).
- الطرد المركزي الحل المصبوغة المخفف ل 5 s في 2,000 س ز لضمان أن كل من الصبغة، التي قد عصا أحياناً على جدران الأنبوبة، تختلط مع المخزن المؤقت. لا تقم بإزالة المادة طافية. دوامة الحل لضمان خلط السليم.
- وضع تشريح العينة في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل تحتوي على 500 ميليلتر من الحل المصبوغة المخفف. احتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في ثيرموميكسير بينما التحريض 800 لفة في الدقيقة. تأكد من الأنابيب مغطاة برقائق الألومنيوم لحماية من التعرض للضوء.
- نقل العينة إلى المخزن المؤقت لحبس خال ص كالسين. عند هذه النقطة، أن العينة جاهز لاختبار الميكانيكية.
- تحضير يوديد propidium (PI) تلطيخ الحل كما يلي.
- إعداد تلطيخ الحل بتمييع في حل الأسهم المشتراة (1 ملغ/مل، 1.5 مم) 01:25 في حبس تصل إلى 40 ميكروغرام/مل (60 ميكرومتر) بي بي. على سبيل المثال، إضافة 40 ميليلتر من حل الأسهم إلى 1000 ميليلتر من حبس.
- تبقى بي تلطيخ الحل المشمولة في رقائق الألومنيوم لحمايتها من التعرض للضوء. استخدام الحل المصبوغة فورا بعد الاختبار الميكانيكي للكشف عن الخلايا المتضررة (انظر القسم 4).
ملاحظة: واحد يمكن تنفيذ تلطيخ بي قبل التحميل، وكذلك لتقييم أكثر دقة جودة تشريح.
4-الميكانيكية بروتوكول الاختبار
- ضع العينة (عظم الفخذ أو عظم العضد) على شريحة زجاجية لجهاز اختبار الميكانيكية المخصصة المثبتة بالمجهر مثل أن يجلس على سطح مفصلي على condyles فخذي مؤخرة الرأس عضدي على الزجاج (الشكل 1).
ملاحظة: ربط قضيب خشبي مم طوله 10 (القطر = 2 مم) إلى الجهة البعيدة من عظم العضد باستخدام الغراء cyanoacrylate قبل وضعه على الجهاز من أجل تثبيت العينة على سطح مسطح. لوصف مفصل لمنصة الاختبار الميكانيكي انظر التكميلية ملف 1: الجزء 1. - هيدرات العينة مع حبس ووضع الجهاز مع العينة على مجهر الأسفار.
- صورة ملطخة chondrocytes مفصلي كالسين صباحا (أطوال موجية الإثارة/الانبعاثات = 495/515 نانومتر) قبل التطبيق (الأساس) للتحميل تحت مجهر الأسفار مع 4 X الجاف للعدسة (NA = 0.13). ضبط إعدادات اقتناء لتحسين جودة الصورة.
- تطبيق تحميل الميكانيكية على رأس العينة أن يتم ضغط غضروف مفصلي ضد زجاج الغطاء.
- تحميل ثابت، تطبيق حمولة ساكنة المنصوص عليها (مثلاً، 0.5 N) على رأس العينة (عظم الفخذ أو عظم العضد). اضغط تحميل لمدة 5 دقائق وثم إزالته.
- الأثر، تطبيق بأثر المنصوص عليها للطاقة (مثلاً، 1 مللي جول) على العينة بإسقاط المسبار أسطواني من الوزن المعروفة (مثلاً، 0.1 N) من ارتفاع محدد (مثلاً، 1 سم). الإصدار s تحميل 5 بعد الأثر.
ملاحظة: وزن المسبار (mg) وارتفاع المنصوص عليها (ح) يمكن تحويلها إلى تأثير الطاقة (E) باستخدام المعادلة التالية: E = mgh.
- احتضان العينة في PI تلطيخ الحل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- صورة ملطخة chondrocytes مفصلي كالسين صباحا وبي (أطوال موجية الإثارة/الانبعاثات = 535/617 nm) تحت مجهر فلورية (الشكل 2).
5-بيانات التحليل
- تحديد مجال الخلايا جراح الموتى بسبب نظام تحميل الميكانيكية التطبيقية.
- قم بفتح ميكروجرافس سطح مفصلي المكتسبة قبل وبعد التطبيق لتحميل الميكانيكية في إيماجيج18.
- دمج الصور في كومة.
- تعيين حجم الصور استناداً إلى دقة وضوح الصورة.
- استخدم أداة المضلع لتحديد المنطقة حيث أصبحت الخلايا كالسين سالب (فقدان الفلورية الخضراء) وبي-إيجابية (كسب ومضان أحمر). وتعتبر هذه الخلايا الجرحى أو القتلى.
- تحديد مجال الخلايا أصيب الميت باستخدام أداة القياس .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ستة مختلفة تطبيق بروتوكولات التحميل (تحميل ثابت: 0.1 N، 0.5 ن و 1 ن لمدة 5 دقائق؛ وأثر تحميل: 1 mJ، 2 مللي جول ومج 4) الناجم عن تكاثر المناطق المترجمة قابلة للقياس الكمي لإصابة الخلية في غضروف الفخذ وعضدي الحصول عليها من العمر 8-10 أسبوع بالب/ج الفئران ( الشكل 2). الأهم من ذلك، كان قياس مدى الإصابة تشوندروسيتي على سطح مفصلي المكانية بسرعة وسهولة في إيماجيج. وتبين النتائج الممثل أن ضعف الميكانيكية chondrocytes مفصلي تأثرت بشدة حجم وتأثير الحمل. على وجه الخصوص، أعلى تحميل المقادير وأثر ارتفاع الكثافات تفاقم إلى حد كبير مدى المكانية لإصابة الخلية في قصبة وهوميري (الشكل 3).
الشكل 1 : التمثيل التخطيطي لجهاز اختبار الميكانيكية المخصصة. () الجهاز أسيمبليد مع المسبار أسطواني المستخدمة لتطبيق المنصوص عليها الأحمال الميكانيكية و/أو تأثير الطاقات بعينه. ويرد الجهاز دون عينة. (ب) التمثيل التخطيطي للتجربة. ثابت الخاضعة للرقابة (مثلاً، 0.1 N) و/أو تحميل الأثر (مثلاً، 1 مللي جول) يمكن تطبيقها على رأس تشريح العينة أن يتم ضغط غضروف مفصلي ضد الزجاج غطاء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : صورة مجهرية الممثل للسطح المفصلي بعد تحميل الميكانيكية الضارة. صورة مجهرية الممثل مفصلي condyles فخذي السطحية في () القاصي وتحميل (ب) رئيس عضدي بعد الميكانيكية الضارة (أثر [1 مللي جول] وثابت تحميل [1 ن]، على التوالي). الخلايا الخضراء حيوية ملطخة chondrocytes مع أغشية الخلية سليمة بينما الأنوية الحمراء تشير إلى خلايا المصابين مع أغشية الخلايا بيرميبيليزيد. (ج) Zoomed في عرض منطقة إصابة القتلى الخلايا (معالم الأصفر) على سطح مفصلي رئيس عضدي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : منطقة الخلايا أصيب/قتلى- مجال الخلايا أصيب الميت على سطح مفصلي condyles فخذي القاصي (، ب) وعضدي رئيس (ج، د) بعد (، ج) ثابت (0.1 N، 0.5 N و 1 N; n = 6 كل مجموعة) و (ب، د) أثر (1 mJ، 2 مللي جول و mJ 4؛ n = 6 كل مجموعة) تحميل. وتم الحصول على جميع العينات الغضروف في العظام من الفئران الإناث من 8-10 أسابيع من العمر بالب/ج. البيانات هي يعني + الانحراف المعياري؛ أقواس تدل دلالة إحصائية في α = 0.05 يحدده اختبار تحليل التباين (ANOVA) مع مقارنات توكي وظيفة المخصصة . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الملف التكميلي 1. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأساليب المذكورة أعلاه استخدمت بنجاح لتصور قابلة للحياة وأصيب الميت في الموقع chondrocytes مفصلي من مفاصل الماوس بعد المقررة الأحمال الميكانيكية أو الآثار. على وجه الخصوص، كنا قادرين على تحليل الميكانيكية تعرض chondrocytes داخل غضروف مفصلي سليمة تماما من المفاصل الزلالي المختلفة اثنين: الركبة (قصبة القاصي) والكتف (هوميري). تظهر لنا النتائج الممثل أن يتوقف مدى إصابة الخلايا على سطح مفصلي المكانية حس مرهف على تحميل حجم وتأثير كثافة (الشكل 3). الأهم من ذلك، يسهل استخدام هذا الأسلوب التحقيقات الاستجابة الخلوية لتحميل الميكانيكية في ظل الظروف ذات الصلة فسيولوجيا. أي أنه يمكن اختبار غضروف مفصلي في سليمة مشتركة تحت الفسيولوجية، ويحمل سوبرافيسيولوجيكال (انظر التكميلية ملف 1: القسم 2).
ونظرا لمنحنى التعلم حاد في أداء تشريح المفاصل الزلالي مورين وتحديات في الحفاظ على تشوندروسيتيس قادرة على البقاء في الموقع عند خط الأساس، إدخال بعض التعديلات على البروتوكول، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها قد يكون مطلوباً. أعظم خطر chondrocytes مفصلي الضارة أثناء تشريح يحدث أثناء خطوات 2.3.5 2.3.10 و 2.4.5 من خلال 2.4.7. لتقليل الضرر/موت الخلايا أثناء تشريح، الباحث يجب تجنب أي اتصال بين الأدوات الجراحية (مثلاً، دون مشرط عند قطع الأنسجة أو الملقط للصائغ عند إزالة الأنسجة اللينة) والسطح المفصلي للعينة . لمس السطح المفصلي مع قفاز يستحث بيد الإصابة/موت الخلية قليلاً. من أجل تحسين سلامة الخلية خط الأساس، قد يكون أيضا الضرورية لتقليل كمية الأنسجة اللينة إزالتها من المشترك. بالإضافة إلى ذلك، أن استخدام الأدوات الدقيقة سوف يقلل عموما موت الخلايا المستحثة بالتشريح. في نهاية المطاف، لتأكيد دقة عدم الأضرار المرتبطة بتشريح chondrocytes مفصلي في الأساس، من المستصوب وصمة عار العينات مع كلا الأصباغ النفاذية (كالسين صباحا و PI، قبل التحميل) لا سيما حين الباحث أصبحت متمرساً على إجراء تشريح (انظر تكميلية ملف 1: القسم 3).
نظراً لصغر حجم المشترك الماوس ومانيبولابيليتي الجينية لجينوم الفأر، تقديم نماذج موريني مزايا متعددة على نماذج حيوانية كبيرة لدراسة تعرض chondrocytes مفصلي لتحميل الميكانيكية. بيد إلى المعرفة أصحاب، لا سبق أجريت دراسات تحديد مقدار الضرر/وفاة في الموقع chondrocytes مفصلي بسبب تحميل الميكانيكية الغضروف مورين سليمة. المحققون عادة باستخدام explants إزالتها من مفاصل نماذج حيوانية كبيرة للتحقيق في المدى موت الخلايا بسبب الإصابة الميكانيكية3،4،5،،من67، 8 , 9 , 10 , 11 , 12-على النقيض من ذلك، نماذج الماوس تيسير 1) التصور تقريبا كامل سطح مفصلي على العظام معين؛ و 2) التحليلات بعد انتهاء التحميل أو أثر بعد انتهاء الصلاحية تشوندروسيتي في المفاصل سليمة دون المساس بشروط الحدود الأصلية. وعلاوة على ذلك، بينما مضغوط، عينات الماوس تولد مجالات الاتصال أصغر إلى حد كبير بالمقارنة مع النماذج الحيوانية الكبيرة؛ ولذلك، تؤكد تفوق كبير في نماذج حيوانية كبيرة لحجم تحميل معطى. ومن ثم، يمكن الناجم عن إصابة الخلية بكميات أصغر. بالإضافة إلى ذلك، نماذج مورين تيسير البحث عن ضمور الغضاريف، وعلى وجه الخصوص، هشاشة العظام، كهذا المرض يمكن أن تكون بسهولة المستحث في الفئران عن طريق الوراثية19،،من2021، 22، والغذائية23،24 أو المعالجات الجراحية25،26،،من2728. وعلاوة على ذلك، هشاشة العظام العفوي يحدث في عدة سلالات الماوس بما في ذلك بالب/c و29،C57BL/630.
في بياناتنا الممثل، استخدمنا البقع البقاء (العيش/الميت) لتقدير الضرر/موت الخلية 5 دقائق بعد إزالة تحميل الميكانيكية. أننا نعترف أن هذه التجارب قد لا تميز المصابين خلايا (خلايا بشكل مؤقت تمزق الأغشية) من الخلايا الميتة (الخلايا بشكل دائم تمزق الأغشية). أن الخلايا التي يتم كالسين السلبية وبي إيجابية-يشير إلى أن الغشاء الذي كان سابقا بيرميبيليزيد أيار إصلاح جداول الأغشية على مر الزمن بدءاً من ثوان إلى عدة دقائق31. في الواقع، في مجموعة منفصلة من التجارب، قررنا أن جزء صغير خلايا "إصابة" البقاء على قيد الحياة الصدمات الميكانيكية صغيرة (~ 5%) لكن كبيرة (انظر التكميلية ملف 1: القسم 4). ولذلك، يعيش الميت تلطيخ هو مقياسا مباشرا لسلامة الغشاء الذي ليس دائماً مؤشرا لبقاء الخلية. على وجه الخصوص، خلايا بي-الإيجابية والسلبية كالسين أنسب تعرف بأنها "جرح"، حيث يتم تعريف الضرر كفقدان تكامل غشاء البلازما بسبب الصدمات الميكانيكية (يحتمل أن تكون مؤقتة). كما نعترف بأن لدينا بيانات تمثيلية المحتمل يعكس الموت الفوري الوحيد الخلية (نخرية). تصوير العينات في نقاط زمنية لاحقة (مثلاً، ح 48 بعد إزالة الحمولة) ينبغي تمكين التحديد الكمي لكلا نخرية وموت الخلايا أبوبتوتيك.
يجب اعتبار العديد من القيود عند استخدام هذه الأساليب. في تجاربنا للمحاكمة لهذه المخطوطة، استخدمنا العمر 8-10 أسابيع الإناث بالب/ج الفئران لإظهار قدرات منصة الاختبار (الشكل 3). ومع ذلك، نظراً لتغييرات ملحوظة في كثافة الخلية في قصبة من الفئران الأكبر سنا، يصبح تقييم الضرر الناجم عن تحميل الخلية أكثر صعوبة (أن كان ذلك ممكناً) في قصبة كبار السن (نسبة النجاح = 40%). على النقيض من ذلك، لوحظت لا تغييرات ملحوظة في كثافة الخلية في هوميري في الفئران C57BL/6 61-81-أسبوع (انظر التكميلية الملف 1: الجزء 5)، ومن ثم صنع منصة الاختبار مفيداً للذين تتراوح أعمارهم بين 8 81 أسابيع. قيد آخر أن الطريقة التي استخدمت لتحليل مدى إصابة الخلية فقط على سطح مفصلي الفخذ condyles ورئيس عضدي المكانية. ومع ذلك، يمكن تمديد الأسلوب مرة أخرى لتحليل مدى تعتمد على عمق المكانية لإصابة خلية عن طريق استخدام الليزر الفحص المجهري [كنفوكل]. لاحظ أن الأسلوب الأخير الذي يتطلب استخدام معدات أكثر تكلفة ووقتاً أطول من الحصول على صورة، وأكثر من تحليل المعنيين وتستغرق وقتاً طويلاً. أخيرا، على الرغم من أن موقع الاتصال بين غضروف مفصلي والزجاج غطاء فسيولوجيا ذات الصلة للفئران32،33، كان لم تتغير في هذا الموقع. ومع ذلك، لدينا منصة الاختبار يسمح لاختلاف موقع جهة الاتصال إذا هو سيطر على عظم الفخذ أو عظم العضد مع المحرك تناوب.
وفي الختام، قمنا بتطوير نموذج ضرر مورين في المختبر الذي يتيح تطبيق الأحمال الميكانيكية التي تسيطر عليها و/أو الآثار على سطح مفصلي الغضروف المفصلي سليمة. هذا النموذج يمكن تصور المسمى فلوريسسينتلي chondrocytes مفصلي في الوقت الحقيقي والسريع واحد المستندة إلى الصور تحليل للإصابة/موت الخلايا. الأهم من ذلك، يمكن اختبار آثار أنظمة مختلفة تحميل الميكانيكية، وظروف بيئية مختلفة أو التلاعبات الجينية المختلفة على صلاحية chondrocyte قصيرة أو طويلة الأجل باستخدام هذه المنهجية. وهكذا، برنامجنا يتيح أداة لاستجواب أسئلة العلوم الأساسية والأهداف العلاجية الشاشة المتصلة بضعف chondrocytes الميكانيكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
المؤلف يود أن يشكر الدكتور ريتشارد وو ولويس دسلجاديلو لاستخدام السخي من مقياس الأس الهيدروجيني وأوسموميتير. بالإضافة إلى ذلك، المؤلف يود أن يشكر لي أندريا للمساهمة في تطوير نظام الاختبار الميكانيكية الأولى. تم تمويل هذه الدراسة من AR069655 P30 المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
References
- Lotz, M. K., Kraus, V. B. New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211 (2010).
- Pallante, A. L., et al. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).
- Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).
- Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading. Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).
- Goodwin, W., et al. Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death. Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).
- Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).
- Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer. Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).
- Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).
- Lee, W., et al. Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
- Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).
- Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).
- Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).
- Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).
- Martin, J. A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage. Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).
- Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence. Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).
- Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).
- Zhang, M., et al. Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Habouri, L., et al. Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).
- Higuchi, Y., et al. Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model. Scientific Reports. 7 (1), 7028 (2017).
- Zhu, M., et al. Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).
- Hu, K., et al. Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen. Arthritis & Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).
- Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), R198 (2011).
- Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise. Arthritis & Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus. Scientific Reports. 7, 42294 (2017).
- Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).
- Wilhelmi, G., Faust, R. Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside. Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).
- Stoop, R., et al. Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice. Arthritis & Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).
- Adebayo, O. O., et al. Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).
- Vahedipour, A., et al. Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound. Journal of Biomechanics. , (2018).
