Summary
Presenteren we een methode voor de beoordeling van de ruimtelijke omvang van verwonding/dood van de cel op het gewrichtsoppervlak van intact lymfkliertest gewrichten na toepassing van gecontroleerde mechanische belastingen of effecten. Deze methode kunt u nagaan hoe artrose, genetische factoren en/of verschillende laden regimes van invloed zijn op de kwetsbaarheid van in situ chondrocyten worden gebruikt.
Abstract
Homeostase van articulair kraakbeen, is afhankelijk van de levensvatbaarheid van resident cellen (chondrocyten). Helaas, mechanische trauma kan veroorzaken wijdverspreide chondrocyten dood, mogelijk leiden tot onomkeerbare uitsplitsing van het gewricht en het begin van artrose. Onderhoud van chondrocyten levensvatbaarheid is bovendien belangrijk in osteochondrale graft procedures voor optimale chirurgische resultaten. Presenteren we een methode voor de beoordeling van de ruimtelijke omvang van verwonding/dood van de cel op het gewrichtsoppervlak van intact lymfkliertest synoviale gewrichten na toepassing van gecontroleerde mechanische belastingen of effecten. Deze methode kan worden gebruikt in vergelijkende studies te onderzoeken van de effecten van verschillende mechanische belasting regimes, verschillende milieuomstandigheden of genetische manipulaties, evenals verschillende stadia van degeneratie van het kraakbeen op korte - en/of op lange termijn kwetsbaarheid van in situ articulaire chondrocyten. Het doel van het protocol geïntroduceerd in het manuscript is te beoordelen van de ruimtelijke omvang van verwonding/dood van de cel op het gewrichtsoppervlak van lymfkliertest synoviale gewrichten. Nog belangrijker is, is deze methode kan testen op volledig intact kraakbeen zonder afbreuk te doen aan de inheemse randvoorwaarden. Bovendien zorgt het voor visualisatie in real time van vitaal gebeitst articulaire chondrocyten en één beeld-gebaseerde analyse van cel letsel veroorzaakt door toepassing van gecontroleerde statische en effect laden regimes. Onze representatieve resultaten tonen aan dat in gezond kraakbeen explantaten, de ruimtelijke omvang van cel schade gevoelig belasting omvang en het effect intensiteit hangt. Onze methode kan gemakkelijk aangepast worden aan onderzoeken van de effecten van verschillende mechanische belasting regimes, verschillende milieuomstandigheden of verschillende genetische manipulaties op de mechanische kwetsbaarheid van in situ articulaire chondrocyten.
Introduction
Articulair kraakbeen (AC) is een dragende weefsel dat behandelt en beschermt botten in synoviale gewrichten, verstrekken van vlotte gezamenlijke articulatie. Weefsel homeostase is afhankelijk van de levensvatbaarheid van de chondrocyten, de enige celtype die woonachtig zijn in AC. Echter kan Gasbedwelming met behulp van kraakbeen extreme krachten als gevolg van trauma (bijv, falls, voertuig ongeval of sport letsel) of als gevolg van post-traumatische gezamenlijke instabiliteit veroorzaken chondrocyten dood, wat leidt tot onomkeerbare uitsplitsing van het gewricht (artrose) 1. bovendien in osteochondrale enten procedures die gericht zijn op plaatselijke gebreken in beschadigd kraakbeen, graft invoeging-geassocieerde mechanische trauma vermindert chondrocyten levensvatbaarheid en heeft nadelige gevolgen voor chirurgische resultaten2.
Kraakbeen explant modellen worden gebruikt bij het bestuderen van de gevoeligheid van de articulaire chondrocyten voor mechanisch-veroorzaakte celdood. Deze modellen gebruiken meestal explantaten van grote dieren te bestuderen van de gevolgen van het laden van de voorwaarden, de omgevingsomstandigheden en andere factoren op cel beveiligingslek3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Echter, als gevolg van de grote omvang van de inheemse gewrichten, deze modellen in het algemeen vereisen verwijdering van een stekker uit het gewrichtsoppervlak van een intact gewricht, waardoor afbreuk te doen aan inheemse randvoorwaarden. Bovendien, ze over het algemeen vergt toepassing van grote mechanische belastingen voor het opwekken van cel letsel. U kunt ook bieden lymfkliertest kraakbeen explant modellen verschillende voordelen ten opzichte van grotere dierlijke modellen bij het bestuderen van de mechanische kwetsbaarheid van in situ chondrocyten. Met name als gevolg van hun kleinere afmetingen vergemakkelijken deze modellen testen van volledig intact articulair kraakbeen zonder te veranderen van inheemse weefsel integriteit. Bovendien, laden van lymfkliertest kraakbeen vindt plaats via kleine contact gebieden zodanig dat chondrocyten dood/letsel kan worden opgewekt met kleine lastdragers (< 1 N). Tot slot, het genoom van de muis wordt gemakkelijk gemanipuleerd, waardoor testen van hoe specifieke genen invloed op de gevoeligheid van in situ chondrocyten voor mechanische schade.
Het algemene doel van de methode geïntroduceerd in dit manuscript is te kwantificeren en visualiseren-in real-tijd-de ruimtelijke omvang van in situ cel dood/letsel als gevolg van de toegepaste mechanische belastingen op volledig intact muis kraakbeen-op beendermeel explants in vitro. Deze methode vereist zorgvuldige dissectie van muis synoviale gewrichten zonder afbreuk te doen aan de levensvatbaarheid van de chondrocyten, gevolgd door mechanische beproeving van vitaal gebeitst explantaten met behulp van een Microscoop gemonteerde apparaat vergelijkbaar met een test platform dat we onlangs ontwikkeld te kwantificeren lymfkliertest kraakbeen mechanische eigenschappen16. Tijdens het testen van de mechanische, is een groot deel van de (intacte) gewrichtsoppervlak van het bot ontleed zichtbaar op een opname van één fluorescentie, waardoor snelle analyse van de levensvatbaarheid van de cellen, nadat een belasting is toegepast. Een soortgelijke analyse van de levensvatbaarheid van de cellen van de oppervlakte in lymfkliertest kraakbeen explantaten is uitgevoerd eerder, maar zonder gelijktijdige toepassing van belasting17. Potentiële toepassingen van onze methode omvatten vergelijkende studies om te onderzoeken van de kwetsbaarheid van de articulaire chondrocyten aan verschillende gecontroleerde milieu- en mechanische omstandigheden, alsmede screening van behandelingen gericht op het verminderen van de gevoeligheid van chondrocyten aan mechanische belasting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke werk werd goedgekeurd door het Comité van de Universiteit van Rochester voor dierlijke middelen.
1. oplossingen
- Henks evenwichtig zoutoplossing bereiden (1 X HBSS) met calcium, magnesium en geen fenol-rood. Breng de pH op 7.4 door het toevoegen van kleine hoeveelheden van HCl en NaOH.
- Het aanpassen van de osmolariteit tot 303 mOsm door NaCl of gedeïoniseerd water toe te voegen. Gebruik de buffer tijdens de ontledingen, specimen voorbereiding en mechanische testen.
2. ontledingen van de distale Femur en de proximale Humerus met volledig Intact articulair kraakbeen
- De muis volgens institutionele richtlijnen met behulp van een CO2 inademing kamer gevolgd door cervicale dislocatie euthanaseren. Volg aseptische techniek in.
Opmerking: Muizen tussen 8 en 81 weken oud van elke stam en seks kunnen worden gebruikt. - Gebruik de volgende chirurgische hulpmiddelen voor ontledingen: micro-schaar (gebruikt voor het maken van insnijdingen), standaard ontleden schaar (gebruikt voor het snijden van het bot), scalpel met #11 scalpel blad (gebruikt voor snijden weke delen), juwelier pincet (gebruikt voor verwijdering van soft weefsel) en standaard pincet (gebruikt voor peeling van het zachte weefsel en de huid).
- Volg de onderstaande instructies voor ontledingen van de distale femur .
- Plaats de muis in een liggende positie.
- Maak een kleine (~ 5 mm) incisie in de huid op het voorste gedeelte van de knie.
- Uitbreiden van de incisie helemaal rond de knie en het terugtrekken van de huid om de knie gewricht en been spieren bloot te stellen.
- Vanaf het proximale einde van het dijbeen, gebruik een scalpel blad (#11) te snijden langs de distale richting. Plaats het mes tussen de quadriceps spier-pees eenheid en de voorste zijde van het femur schacht. Uitbreiden van de cut naar en voorbij de knieschijf en eindigen door te snijden door het midden van de Patellaire pees, daardoor verwijderend de quadriceps spier-pees eenheid.
- Vanaf het proximale einde van het dijbeen, gebruik een scalpel blad (#11) te snijden langs de distale richting. Plaats het mes tussen de hamstring spier-pees eenheid en de posterieure zijde van de femorale schacht. Zodra de cut het kniegewricht nadert, beginnen snijden door het zachte weefsel, vermijden van contact tussen de scalpel en het gewrichtsoppervlak op de distale condyles van het dijbeen. Afwerking van de snede langs het kniegewricht.
- Het terugtrekken van de quadriceps en de hamstrings spieren aan het blootstellen van het dijbeen. Eventuele overtollige spier aan de laterale en mediale zijkanten van het dijbeen weggesneden.
- Snij de kuitspier aan de posterieure zijde van de proximale tibia en spiegelen het been om te visualiseren van de posterieure zijde van het bovenbeen.
- De distale condyles van het bovenbeen en achterste oppervlak van de proximale tibia bloot door het verwijderen van overtollige weefsel rond het kniegewricht.
- Snijd de anterieure en posterieure cruciate ligamenten met behulp van een scalpel, snijden uit de buurt van het femur condyles. Trek het scheenbeen uit de buurt van het dijbeen en snijd alle de ligamenten om te scheiden van de onderste poot van het dijbeen.
- Met behulp van standaard ontleden schaar, doorsnijden het dijbeen proximale eind van het bot (8 mm boven het tibio-femorale gewricht) van de laterale kant. Na het snijden van het bot, veeg weg zichtbare merg aan de buitenkant van het been om mogelijke verontreiniging van beenmergcellen te voorkomen.
Opmerking: Snijden van laterale kant vermindert het risico van spleet propagatie langs het bot. - Verwijder omringende zachte weefsels (dat wil zeggen, ligamenten en overtollige spier) uit het dijbeen met behulp van juwelier pincet en bloot het kraakbeen op beide condyles DISTAAL eind van het dijbeen. Vermijd contact tussen het kraakbeen en pincet.
- Volg de onderstaande instructies voor ontledingen van de bovenarm .
- Plaats de muis in een liggende positie.
- Maak een incisie (~ 5 mm) in de huid van de posterieure zijde van de elleboog met behulp van de micro-schaar, uitbreiden van de incisie rond de elleboog en terugtrekken van de huid om de spieren van de arm en de schouder bloot te stellen.
- Vanaf het proximale einde van het opperarmbeen, gebruik een scalpel blad (#11) te snijden langs de distale richting. Plaats het mes tussen de triceps spier-pees eenheid en de posterieure zijde van de bovenarm. Uitbreiden van de cut DISTAAL eind van het opperarmbeen en eindigen door doorsnijden de triceps pees.
- Dan trek terug de triceps proximale eind van het opperarmbeen totdat de humeruskop is blootgesteld.
- Snij het bindweefsel rond de humeruskop met behulp van een scalpel blad (#11) zonder het aanraken van het gewrichtsoppervlak en verwijder de ledematen (arm en schouder) uit het lichaam. Periodiek hydrateren het gewrichtsoppervlak van de humeruskop met HBSS.
- Het opperarmbeen verbreken door de arm door het breken van de eerste uit het proximale einde van de ellepijp aan de posterieure zijde van de arm pincet gebruiken en vervolgens het snijden van het bindweefsel rond de distale einde van de bovenarm. Verwijder alle overtollige weefsel op de bovenarm.
- De deltaspier radii aan de posterieure zijde van de humerus met behulp van standaard ontleden schaar afgesneden.
- Plaats de ontleed typebeproevingen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge met HBSS buffer.
3. live (calceïne AM) / Dead (Propidium jodide) kleuring Protocol
- Vlek met calceïne AM als volgt.
- Maken van een stamoplossing calceïne AM door toevoeging van 12,5 µL van dimethylsulfoxide (DMSO) in een flesje van 50 µg calceïne AM, resulterend in een voorraad concentratie van 4 mg/mL (4.02 mM).
- Verdun de voorraad calceïne oplossing 1:400 in HBSS tot een concentratie van 10 µg/mL (10.05 µM) van calcium AM (bijvoorbeeld het toevoegen van 1,25 µL van stockoplossing aan 500 µL van HBSS).
- Centrifugeer het verdunde kleurstofoplossing voor 5 s bij 2.000 x g om ervoor te zorgen dat alle van de kleurstof, die af en toe aan de muren van de buis vasthouden kan, vermengt zich met de buffer. Verwijder het supernatant niet. Vortex de oplossing om goede mengen.
- Zet de ontleed specimen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge met 500 µL van de verdunde kleurstofoplossing. Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 30 minuten in een thermomixer terwijl het schudden bij 800 rpm. Zorg ervoor dat de buizen zijn bekleed met aluminiumfolie om te beschermen tegen blootstelling aan licht.
- Breng het specimen in calceïne AM-vrije HBSS buffer. Op dit moment is het model klaar voor mechanische testen.
- Propidium jodide (PI) kleurstofoplossing als volgt voorbereiden.
- Bereiden de kleurstofoplossing door verdunning van de gekochte stockoplossing (1 mg/mL, 1.5 mM) 1:25 in HBSS tot 40 µg/mL (60 µM) PI PI. Bijvoorbeeld, 40 µL van stockoplossing aan 1000 µL van HBSS toevoegen.
- De PI kleurstofoplossing bedekt met aluminiumfolie om het te beschermen tegen blootstelling aan het licht te houden. Gebruiken de kleurstofoplossing onmiddellijk na de mechanische test voor het detecteren van gewonde cellen (zie punt 4).
Opmerking: Een kunt uitvoeren de PI kleuring vóór het laden evenals aan de kwaliteit van de ontledingen strenger te beoordelen.
4. mechanische testen Protocol
- Plaats het specimen (dijbeen of opperarmbeen) op het glasplaatje van een aangepast Microscoop gemonteerde mechanische testen apparaat zodanig dat het gewrichtsoppervlak op de achterste femur condyles of humeruskop op het glas (Figuur 1 zit).
Opmerking: Zet een 10 mm lange houten applicator (diameter = 2 mm) naar de distale zijde van het opperarmbeen met behulp van Cyanoacrylaat lijm alvorens het te plaatsen op het apparaat om te stabiliseren van het model op de vlakke ondergrond. Zie voor een gedetailleerde beschrijving van de mechanische testen platform aanvullende bestand 1: deel 1. - Het model met HBSS hydrateren en plaats het apparaat met het model op een fluorescentie Microscoop.
- Afbeelding van de articulaire chondrocyten gekleurd met calceïne AM (excitatie/emissie golflengten = 495/515 nm) voordat (basislijn) toepassing van de belasting onder een fluorescentie Microscoop met een 4 X droge lens (NB = 0.13). Pas de overname-instellingen voor het optimaliseren van de beeldkwaliteit.
- Toepassing mechanische laden op de top van het model zodanig dat articulair kraakbeen tegen het glas cover is gecomprimeerd.
- Voor statische laden, een voorgeschreven statische belasting (bijvoorbeeld0,5 N) op de top van het model (dijbeen of opperarmbeen) van toepassing. Houd de belasting gedurende 5 minuten en verwijder het.
- Toepassing voor effect, een voorgeschreven botsenergie (bijvoorbeeld, 1 mJ) op het model door het neerzetten van een cilindrische botslichaam van bekend gewicht (bijvoorbeeld0,1 N) van een voorgeschreven hoogte (bijvoorbeeld, 1 cm). Laat de lading 5 s na de botsing.
Opmerking: Het gewicht van het botslichaam (mg) en de voorgeschreven hoogte (h) kan worden omgezet in botsenergie (E) met de volgende vergelijking: E = mgh.
- Incubeer het monster in PI kleurstofoplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Afbeelding van de articulaire chondrocyten gekleurd met calceïne AM en PI (excitatie/emissie golflengten = 535/617 nm) onder een fluorescentie Microscoop (Figuur 2).
5. de gegevensanalyse
- Het gebied van gewond/dode cellen als gevolg van de toegepaste mechanische belasting regime te kwantificeren.
- Open de microfoto van het gewrichtsoppervlak verworven vóór en na toepassing van mechanische belasting in ImageJ18.
- Combineer de afbeeldingen in een stapel.
- De schaal van de afbeeldingen op basis van de resolutie van de afbeelding instellen.
- Gebruik het gereedschap veelhoek om het gebied waar de cellen werd calceïne-negatief (verlies van groene fluorescentie) en PI-positieve (winst van rode fluorescentie) te definiëren. Deze cellen worden beschouwd als gewonde of dode.
- Het bepalen van het gebied van gewond/dode cellen en bereiken met het meetgereedschap .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zes verschillende toegepast laden protocollen (statische lading: 0,1 N, 0,5 N en 1 N voor 5 min; en gevolgen laden: 1 mJ, 2 mJ en 4 mJ) reproducibly geïnduceerde kwantificeerbare gelokaliseerde gebieden van cel letsel in het kraakbeen van het femur en humerus verkregen 8-10-week-oude BALB/c muizen ( Figuur 2). Nog belangrijker is, was de ruimtelijke omvang van chondrocyten letsel op het gewrichtsoppervlak snel en eenvoudig gemeten in ImageJ. Representatieve resultaten tonen aan dat de mechanische kwetsbaarheid van articulaire chondrocyten werd beïnvloed door de omvang en het effect intensiteit van de belasting. In het bijzonder verergerd hogere belasting grootheden en hogere intensiteiten van de gevolgen aanzienlijk de ruimtelijke omvang van cel letsel in zowel dijbeen en humeri (Figuur 3).
Figuur 1 : Schematische weergave van de aangepaste mechanische beproevingstoestel. (een) Assembled apparaat met het cilindrische botslichaam gebruikt om te passen voorgeschreven mechanische belastingen en/of gevolgen energieën met een model. Het apparaat wordt weergegeven zonder een specimen. (b) Schematische weergave van het experiment. Gecontroleerde static (bijvoorbeeld0,1 N) en/of effect (bijvoorbeeld, 1 mJ) laden kan worden toegepast op de top van de ontleed specimen zodat articulair kraakbeen tegen het glas cover is gecomprimeerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Opname van de vertegenwoordiger van het gewrichtsoppervlak na het schadeveroorzakende mechanische laden. Opname van de vertegenwoordiger van het articulaire oppervlak op (een) de distale femur condyles en (b) de humeruskop na schadeveroorzakende mechanische laden (effect [1 mJ] en statische laden [1 N], respectievelijk). Groene cellen zijn vitaal chondrocyten met intact celmembranen gekleurd, terwijl de rode kernen geven aan gewonde cellen met celmembranen permeabel. (c) Zoomed-in uitzicht op het gebied van gewond/dode cellen (gele contouren) op het gewrichtsoppervlak van de humeruskop. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Gebied van gewond/dode cellen. Gebied van gewond/dode cellen in het gewrichtsoppervlak van de distale femur condyles (a, b) en de humeruskop (c, d) na (een, c) statisch (0,1 N, 0,5 N en 1 N; n = 6 per groep) en (b, d) gevolgen (1 mJ, 2 mJ en 4 mJ; n = 6 per groep) laden. Alle kraakbeen-op beendermeel specimens werden verkregen van vrouwelijke BALB/c 8-10 weken oude muizen. Gegevens zijn gemiddelde + standaardafwijking; haakjes duiden statistische significantie op α = 0,05 bepaald door variantieanalyse (ANOVA) test met Tukey post hoc vergelijkingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende bestand 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierboven beschreven methoden werden met succes ingezet om te visualiseren van levensvatbare en gewond/dode in situ articulaire chondrocyten van muis gewrichten nadat voorgeschreven mechanische belastingen of effecten. In het bijzonder, konden we voor het analyseren van de mechanische kwetsbaarheid van chondrocyten binnen volledig intact articulair kraakbeen uit twee verschillende synoviale gewrichten: het kniegewricht (distale dijbeen) en schouder (humeri). Onze representatieve resultaten tonen aan dat de ruimtelijke omvang van cel letsel op het gewrichtsoppervlak gevoelig hangt met lading omvang en het effect intensiteit (Figuur 3). Nog belangrijker is, vergemakkelijkt het gebruik van deze methode onderzoeken van de cellulaire reactie op mechanische belasting fysiologisch relevante omstandigheden. Dat wil zeggen, het stelt testen van articulair kraakbeen op een intact gezamenlijke onder fysiologische en supraphysiological ladingen (Zie aanvullende bestand 1: sectie 2).
Gezien de steile leercurve bij het uitvoeren van ontledingen van lymfkliertest synoviale gewrichten en uitdagingen in het behoud van levensvatbare in situ chondrocyten op basislijn, sommige protocol-wijziging en probleemoplossing kan worden verlangd. Het grootste risico van schadelijke articulaire chondrocyten tijdens dissectie optreedt tijdens stappen 2.3.5 via 2.3.10 en 2.4.5 via 2.4.7. Om te minimaliseren van schade/celdood tijdens dissecties, moet de onderzoeker vermijden elk contact tussen chirurgische instrumenten (bijvoorbeeld, de scalpel wanneer het snijden van het weefsel of de juwelier pincet bij het verwijderen van de weke delen) en het gewrichtsoppervlak van het specimen . Aanraken van de articulaire oppervlak met een handschoen induceert echter weinig schade/celdood. Ter verbetering van de levensvatbaarheid van de cellen van de basislijn, kan het ook nodig om de hoeveelheid zacht weefsel verwijderd uit het gewricht te verminderen zijn. Bovendien, vermindert fijnere hulpprogramma's in het algemeen dissectie-veroorzaakte celdood. Uiteindelijk, Controleer nauwgezet de afwezigheid van de dissectie-geassocieerde schade van articulaire chondrocyten op basislijn, is het raadzaam om de exemplaren met beide permeabiliteit verf vlek (calceïne AM en PI, vóór het laden) vooral wanneer de onderzoeker zich vertrouwd te maken met de dissectie-procedure (Zie aanvullende bestand 1: hoofdstuk 3).
Gezien de geringe omvang van het gewricht van de muis en de genetische oorlogsmachinerie van het genoom van de muis, bieden lymfkliertest modellen meerdere voordelen ten opzichte van grote diermodellen om de studie van de kwetsbaarheid van de articulaire chondrocyten voor mechanische belasting. Echter tot de auteurs kennis, zijn geen studies eerder uitgevoerd om te kwantificeren verwonding/dood van in situ articulaire chondrocyten als gevolg van mechanische belasting intact lymfkliertest kraakbeen. Onderzoekers gebruiken meestal explantaten verwijderd uit gewrichten van grote dierlijke modellen om te onderzoeken welke celdood als gevolg van mechanische schade3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12. daarentegen Muismodellen vergemakkelijken 1) visualisatie van bijna de gehele gewrichtsoppervlak op een bepaalde bone; en 2) analyses van post laad- of posttraumatische chondrocyten levensvatbaarheid in intact joints zonder afbreuk te doen aan de inheemse randvoorwaarden. Bovendien, terwijl gecomprimeerd, muis specimens genereren aanzienlijk kleinere contact gebieden ten opzichte van grote dierlijke modellen; Daarom zijn benadrukt aanzienlijk hoger dan in grote diermodellen voor een gegeven belasting magnitude. Vandaar, cel letsel kan worden veroorzaakt door kleinere ladingen. Bovendien lymfkliertest modellen vergemakkelijken onderzoek naar degeneratie van het kraakbeen en in het bijzonder artrose, als deze ziekte kan worden gemakkelijk geïnduceerd in muizen door middel van genetische19,20,21, 22, dieet23,24 of chirurgische manipulaties25,26,27,28. Bovendien, spontane artrose treedt op in verschillende muis stammen, met inbegrip van de BALB/c en C57BL/629,30.
In onze representatieve gegevens gebruikten we levensvatbaarheid (leven/dood) vlekken te kwantificeren verwonding/dood van de cel 5 min na de verwijdering van de mechanische belasting. Wij erkennen dat deze experimenten gewonde cellen (cellen met tijdelijk gescheurde membranen) niet mag discrimineren uit dode cellen (cellen met permanent breuken membranen). Dat is, cellen die calceïne negatieve en PI positieve-die aangeeft dat het membraan was eerder permeabel-mei reparatie hun membranen na verloop van tijd schalen variërend van seconden tot verscheidene minuten31. In feite, in een aparte reeks van experimenten, hebben wij vastgesteld dat de Fractie van "verwond" cellen die mechanische trauma overleven is klein (~ 5%) maar significante (Zie aanvullende bestand 1: punt 4). Daarom, wonen/dode kleuring is een directe maat voor de membraan integriteit, dat is niet altijd een indicatie van de levensvatbaarheid van de cellen. PI-positieve en calceïne-negatieve cellen worden in het bijzonder, meest adequaat gedefinieerd als "geblesseerd", waar de schade is gedefinieerd als een (mogelijk tijdelijk) verlies van plasma membraan integriteit als gevolg van mechanische trauma. Wij erkennen ook dat onze representatieve gegevens waarschijnlijk alleen onmiddellijke (necrotisch) celdood weerspiegelt. Kwantificering van beide necrotische Imaging monsters bij latere tijdstippen (bijvoorbeeld48 uur na verwijdering van belasting) moet inschakelen en de dood van de cel van de apoptotic.
Verschillende beperkingen moeten worden overwogen bij het gebruik van deze methoden. In onze proef experimenten voor dit manuscript gebruikten we 8-10 weken-oude vrouwelijke BALB/c muizen om aan te tonen de mogelijkheden van het testen platform (Figuur 3). Als gevolg van merkbare veranderingen in de celdichtheid in dijbeen van oudere muizen, de beoordeling van de belasting-geïnduceerde cel schade wordt echter meer uitdagend (al haalbaar) in oudere dijbeen (slagingspercentage = 40%). Daarentegen geen merkbare veranderingen in de celdichtheid op humeri werden waargenomen in 61-81-week-oude C57BL/6 muizen (Zie aanvullende bestand 1: sectie 5), en daarmee handig voor het maken van het testen platform leeftijden 8-81 weken. Een andere beperking is dat de methode voor het analyseren van de ruimtelijke omvang van cel schade alleen op het gewrichtsoppervlak van het femur condyles en humeruskop is gebruikt. Verder echter de methode zou kunnen worden uitgebreid analyseren diepte-afhankelijke ruimtelijke omvang van cel letsel door gebruik van laser scanning confocal microscopie. Merk op dat de laatste methode gebruik van duurdere apparatuur, afbeelding overname langer en meer betrokken en tijdrovend analyse zou vereisen. Tot slot, hoewel de contact ligging tussen het articulaire kraakbeen en het glas cover fysiologisch relevant voor muizen32,33 was, deze locatie was niet gevarieerd. Echter zorgt ons testen platform voor variatie op de contact locatie als het dijbeen of de bovenarm met een roterende armatuur is gegrepen.
Tot slot hebben we een in vitro lymfkliertest letsel model waarmee de toepassing van de gecontroleerde mechanische belastingen en/of effecten op het articulaire oppervlak van intact articulair kraakbeen. Dit model biedt een mogelijkheid van visualisatie van fluorescently geëtiketteerde articulaire chondrocyten in real time en snelle één beeld-gebaseerde analyse van verwonding/dood van de cel. Nog belangrijker is, kunnen de effecten van verschillende mechanische belasting regimes, verschillende milieuomstandigheden of verschillende genetische manipulaties op korte - en/of lange termijn chondrocyten levensvatbaarheid worden getest met behulp van deze methode. Ons platform biedt dus een instrument om te ondervragen basiswetenschap vragen en therapeutische doelen scherm aan de mechanische kwetsbaarheid van chondrocyten gerelateerde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank Dr. Richard Waugh en Luis Delgadillo voor het royale gebruik van hun pH-meter en osmometer. Bovendien, bedank de auteurs Andrea Lee bij te dragen tot de initiële ontwikkeling van de mechanische testsysteem. Deze studie werd gefinancierd door de NIH P30 AR069655.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
References
- Lotz, M. K., Kraus, V. B. New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211 (2010).
- Pallante, A. L., et al. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).
- Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).
- Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading. Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).
- Goodwin, W., et al. Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death. Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).
- Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).
- Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer. Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).
- Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).
- Lee, W., et al. Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
- Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).
- Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).
- Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).
- Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).
- Martin, J. A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage. Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).
- Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence. Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).
- Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).
- Zhang, M., et al. Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Habouri, L., et al. Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).
- Higuchi, Y., et al. Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model. Scientific Reports. 7 (1), 7028 (2017).
- Zhu, M., et al. Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).
- Hu, K., et al. Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen. Arthritis & Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).
- Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), R198 (2011).
- Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise. Arthritis & Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus. Scientific Reports. 7, 42294 (2017).
- Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).
- Wilhelmi, G., Faust, R. Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside. Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).
- Stoop, R., et al. Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice. Arthritis & Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).
- Adebayo, O. O., et al. Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).
- Vahedipour, A., et al. Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound. Journal of Biomechanics. , (2018).
