Summary
アプリケーション制御の機械的負荷や衝撃の後そのままマウス関節の関節面の細胞傷害/死の空間範囲を評価する方法を提案します。このメソッドは、どのように変形性関節症、遺伝的要因や異なる負荷療法上皮内軟骨細胞の脆弱性に影響を調査するため使用できます。
Abstract
関節軟骨の恒常性は、細胞 (軟骨) の生存率に依存します。残念ながら、機械的外傷関節の不可逆的な破壊と変形性関節症の発症につながる可能性のある広範な軟骨細胞死を引き起こすことができます。さらに、軟骨細胞生存率の維持は、最適な手術成績骨軟骨移植の手順で重要です。アプリケーション制御の機械的負荷や衝撃の後そのままマウス滑膜関節の関節面の細胞傷害/死の空間範囲を評価する方法を提案します。このメソッドは、異なる機械的負荷のレジメン、異なる環境条件や遺伝子操作の効果だけでなく、短期および長期の軟骨変性のさまざまな段階を調査する比較研究で使用できます。その場で関節軟骨の脆弱性。原稿で導入されたプロトコルの目的は、マウス、関節滑膜関節の表面に細胞傷害/死の空間範囲を評価するためです。重要なは、このメソッドは、ネイティブの境界条件を損なうことがなく完全にそのまま軟骨をテストできます。さらに、極めてステンド グラス関節軟骨細胞のリアルタイムの可視化と制御静的および衝撃療法の応用による細胞傷害の単一イメージ ベース解析が可能です。当社の代表的な結果は、健康な軟骨分化の細胞損傷の空間的な範囲に依存する敏感に負荷の大きさと影響の強度を示しています。手法は異なる機械的負荷のレジメン、異なる環境条件やその場で関節軟骨の機械的脆弱性の異なる遺伝的操作の効果を調査するために容易に適応することができます。
Introduction
関節軟骨 (AC) は、荷重をカバーし、滑らかな関節関節を提供する滑膜関節の骨を保護する組織です。組織恒常性は、AC に存在する唯一の細胞型軟骨細胞の生存率に依存しています。しかし、軟骨の外傷 (例えば滝、車両事故やスポーツ傷害) または外傷後関節不安定性による極端な力への暴露はジョイント (関節) の不可逆的な破壊につながる、軟骨細胞の死を引き起こすことができます。1。 さらに、骨軟骨損傷した軟骨の局所欠陥を修復を目指して手続きを移植、移植挿入関連機械外傷は軟骨細胞生存率を低減と手術成績2に有害な影響を及ぼします。
軟骨植モデルは、機械的に誘発される細胞死に関節軟骨細胞の感受性を研究に使用されます。これらのモデルは通常、荷重条件、環境条件、およびセルの脆弱性3,4,5,6,を他の要因の効果を研究する大型動物から植を使用7,8,9,10、11,12,13,14,15。ただし、ネイティブの接合部のサイズが大きいためこれらのモデル一般的にネイティブの境界条件を損なうことにより、そのまま関節の関節面からプラグの取り外しが必要です。また、一般的に細胞傷害を誘発する大きな機械的負荷のアプリケーションが必要です。また、マウスの軟骨植モデルはその場で軟骨の機械的脆弱性の勉強に大規模な動物モデルにいくつかの利点を提供します。特に、自分の小さな寸法のためこれらのモデルはネイティブの組織の整合性を変更することがなく完全にそのまま軟骨のテストを促進します。さらに、マウスの軟骨の読み込みが発生した小さな接触領域に小さな負荷で軟骨細胞死、傷害を誘起すること (< 1 N)。最後に、マウスのゲノムは、どのように特定の遺伝子の影響の場で軟骨の機械的損傷に対する感受性のテストを有効にする簡単に、操作されます。
本稿で紹介したメソッドの全体的な目標を定量化する、視覚化の原細胞死/完全にそのままマウスの軟骨を骨に機械的荷重による損傷のリアルタイム時間の空間範囲が体外を外植体します。このメソッドは、我々 が最近開発したテストプラット フォームに似て顕微鏡マウント デバイスを使用して極めてステンド グラス植の機械試験続いて軟骨細胞生存率を損なうことがなくマウス、関節滑膜を細かくを必要とマウス軟骨の力学特性の16を定量化します。機械試験中に切り裂かれた骨 (そのまま) 関節面の大部分は負荷を適用した後の細胞生存率の迅速分析を有効にする、単一の蛍光顕微鏡写真に表示されます。以前は、なくロード17の同時適用マウス軟骨外植片の表面細胞生存率の同様の分析を行った。本手法の潜在的なアプリケーションは、さまざまな制御環境と力学的条件、関節軟骨細胞の脆弱性だけでなく、スクリーニング感度を減らすことを目的とした治療法の比較研究機械的負荷に軟骨。
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Protocol
すべての動物の仕事は、ロチェスター大学動物資源委員会によって承認されました。
1. ソリューション
- ハンクの平衡塩溶液を準備 (1 X HBSS) カルシウム、マグネシウムおよびないフェノールレッドを含みます。塩酸または水酸化ナトリウムの少量を追加することによって 7.4 に pH を調整します。
- 塩化ナトリウムまたは脱イオン水を追加して 303 mOsm に浸透圧を調整します。解剖標本準備および機械試験中にバッファーを使用します。
2. 大腿骨遠位部、上腕骨近位関節軟骨が完全にそのままでの解剖
- 頚部転位続いて CO2吸入チャンバーを用いた制度ガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。全体の無菌技術に従ってください。
注: 8, 81 週の任意のひずみの古いとセックスの間マウスを使用することがあります。 - 解剖の次の手術器具を使用: マイクロはさみ (切開を作るために使用)、標準的な解剖はさみ (骨を切削加工に使用)、# 11 メス メス刃 (切削軟部組織に使用)、眼科鑷子 (ソフトの除去に使用組織) と通常鉗子 (軟部組織と皮膚を剥離に使用)。
- 大腿骨遠位部の解剖の以下の手順に従います。
- 仰臥位にマウスを置きます。
- 膝の前方部分の皮膚で (~ 5 mm) の小切開を行います。
- 切開膝周りのすべての方法を拡張し、膝の関節と足の筋肉を公開する皮膚を引き戻します。
- 大腿骨の近位端から始まって、遠位方向に沿ってカットするメスのブレード (#11) を使用します。大腿四頭筋腱ユニットと大腿骨の前方側のブレードを配置します。カットの方や過去の膝蓋骨を拡張し、それにより大腿四頭筋腱ユニットの取り外し、膝蓋腱の真ん中を通って切断によって終了します。
- 大腿骨の近位端から始まって、遠位方向に沿ってカットするメスのブレード (#11) を使用します。ハムスト リング筋腱ユニットと大腿骨の後方側のブレードを配置します。カットに近づく膝継手と、メスと大腿骨の遠位顆関節面間の接触を回避する軟部組織を通って切断を開始します。過去の膝関節カットを終了します。
- 大腿四頭筋、ハムスト リング筋、大腿骨を公開するを引き戻します。大腿骨の外側と内側の両側に余分な筋肉を切り取る。
- 脛骨近位端の後方側にふくらはぎの筋肉を切り取って、大腿骨の後方を視覚化する脚を反転させます。
- 膝関節周囲の余分な組織を削除することによって、大腿骨と脛骨の後面の遠位顆を公開します。
- 大腿骨顆から切断、メスを使用して前部と後部の十字靱帯を切った。大腿骨から脛骨を引っ張るし、大腿骨から下の脚を分離するすべての靭帯をカットします。
- 側方からの骨 (脛骨大腿関節の上 8 mm) の近位端に大腿骨を切って標準の解剖はさみを使用して。骨を切断した後拭きなさい任意の目に見える骨髄骨髄細胞から可能な汚染を避けるために骨の外側に。
注: 側面から切削骨き裂伝播のリスクが減ります。 - 宝石商の鉗子を用いた大腿骨から周囲の軟部組織 (すなわち靭帯、余分な筋肉) を削除し、大腿骨の遠位端両方顆に軟骨を公開します。軟骨と鉗子の間の接触を避けます。
- 上腕骨の解剖の以下の手順に従います。
- 仰臥位にマウスを置きます。
- マイクロはさみを使用して肘関節の後方には、皮膚に切開 (~ 5 mm) を行います、肘周り切開を拡張し、腕と肩の筋肉を公開する皮膚を引き戻します。
- 上腕骨の近位端から始まって、遠位方向に沿ってカットするメスのブレード (#11) を使用します。上腕三頭筋腱ユニットと上腕骨の後方側のブレードを配置します。上腕骨の遠位端に向かってカットを拡張し、上腕三頭筋腱を介して切断して終了します。
- 上腕骨の近位端に向かって上腕三頭筋を上腕骨頭が公開されるまで、引き戻します。
- 関節の表面に触れることがなくメスのブレード (#11) を用いた上腕骨頭周囲結合織をカットし、体から四肢 (腕と肩) を削除します。定期的にハイドレイト HBSS と上腕骨頭の関節面。
- 腕から解除して鉗子を使用し、上腕骨の遠位端の周りの結合組織を切断アームの後部側に尺骨の近位端に上腕骨を外します。上腕骨上の任意の余分な組織を削除します。
- 標準的な解剖はさみを用いた上腕骨の後方に三角筋粗面を切った。
- HBSS バッファーを含む 1.5 mL 遠心チューブに切り裂かれた願書を配置します。
3. ライブ (カルセイン AM)/死者 (Propidium ヨウ化) のプロトコルを汚す
- 次のようにカルセイン AM を使用して染色。
- カルセイン AM、4 mg/mL (4.02 mM) のストック濃度が濃くの 50 μ g のバイアルにジメチルスルホキシド (DMSO) の 12.5 μ L を追加することによってカルセイン AM の原液を作る。
- カルシウム分の 10 μ G/ml (:10.05 μ M) の濃度に到達する HBSS でストック カルセイン ソリューション 1: 400 を希釈 (HBSS の 500 μ L に原液の 1.25 の μ L を追加するなど)。
- 5 希釈した染色溶液を遠心管の壁に固執する可能性があります時折、染料のすべてのバッファーとミックスを確保するため 2,000 x g で s。上清を削除しないでください。渦適切な混合を確実に解決します。
- 解剖標本を含む 500 μ L の希釈した染色溶液 1.5 mL 遠心チューブに入れます。800 rpm で攪拌しながら、thermomixer で 30 分の 37 ° C で供試体を孵化させなさい。チューブは、光への暴露から保護するためにアルミ箔で覆われていることを確認します。
- 試料をカルセイン AM 無料 HBSS バッファーに転送します。この時点で、供試体は機械試験の準備ができて。
- Propidium ヨウ化 (PI) を染色液を次のように準備します。
- PI、購入した原液 (1 mg/mL, 1.5 mM) 1:25 HBSS PI の 40 μ g/mL (60 μ M) に到達するために希釈することによって染色液を準備します。たとえば、HBSS の 1000 μ L に原液の 40 μ L を追加します。
- 光への暴露から保護するために PI 染色液をアルミ箔でカバーをしてください。機械試験後即時染色液を使って負傷したセル (セクション 4 を参照) を検出します。
注: 1 つはより厳密、郭清の品質を評価するために、読み込み前に PI 染色を実行できます。
4. 機械的テスト プロトコル
- 後部大腿顆、上腕骨頭の関節面はガラス (図 1) に座っているようなカスタム顕微鏡マウントの機械的テスト デバイスのスライド ガラスの上に試料 (大腿骨や上腕骨) を配置します。
注: 固定 10 mm 長い木製アプリケータ (直径 2 mm の =) 平らな面に供試体を安定させるためにデバイスにそれを配置する前にシアノアクリ レート系接着剤を使用して上腕骨の遠位側に。機械的テスト プラットフォームの詳細については補足のファイル 1を参照してください: セクション 1。 - 検体 HBSS でメタンハイド レートし、蛍光顕微鏡に試料を使用してデバイスを配置します。
- 関節軟骨は、カルセイン AM で染色画像 (励起/蛍光波長 = 495/515 nm) (ベースライン) 4 X 蛍光顕微鏡下で負荷のアプリケーションは、レンズを乾燥する前に (NA = 0.13)。画像品質を最適化する取得設定を調整します。
- 関節軟骨はカバー ガラスに対して圧縮するよう試料上に機械的ロードを適用します。
- 静的載荷、所定の静的負荷 (例えば0.5 N) 供試体 (大腿骨や上腕骨) の上に適用されます。5 分の負荷を保持し、それを削除します。
- 影響のため所定の高さ (例えば、1 cm) から知られている重量 (例えば0.1 N) の円筒インパクターをドロップすることによって試料の上に所定の衝撃エネルギー (例えば、1 mJ) を適用します。影響の後負荷 5 s をリリースします。
注: インパクター (mg) と所定の高さ (h) の重量は次の方程式を使用して衝突エネルギー (E) に変換できる: E = mgh です。
- PI 染色液室温で 5 分間で試験片を孵化させなさい。
- 関節軟骨は、カルセイン AM で染色画像と PI (励起/蛍光波長 = 535/617 nm) 蛍光顕微鏡 (図 2)。
5. データの解析
- 機械的荷重療法による負傷/死細胞の領域を定量化します。
- ImageJ18機械的負荷の前後を取得する関節面の顕微鏡写真を開きます。
- スタックに画像を組み合わせます。
- 画像の解像度に基づく画像のスケールを設定します。
- セルがカルセイン負 (緑の蛍光性の損失) および PI 肯定的な (赤い蛍光性の利得) となった領域を定義するのに多角形ツールを使用します。これらの細胞は、怪我や死亡すると見なされます。
- 測定ツールを使用して負傷/死細胞の領域を決定します。
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Representative Results
六つの異なる適用荷重プロトコル (静的載荷: 0.1 N、0.5 N、5 分; および衝撃荷重の 1 N: 1 mJ、2 mJ と 4 mJ) 8 10 週齢 BALB/c マウス (から得られる大腿骨と上腕骨の軟骨細胞損傷の定量化可能なローカライズされた領域を再現性をもって誘導図 2)。重要なは、関節表面の軟骨損傷の空間的な範囲は ImageJ で迅速かつ容易に測定しました。代表的な結果は、関節軟骨の力学的脆弱性が荷重の大きさと影響の強さの影響を受けたことを示しています。特に、高荷重の大きさと高い衝撃強度大幅悪化細胞傷害大腿骨及び上腕骨 (図 3) の空間的な範囲。
図 1: カスタムの機械的試験装置の概略図。使用を適用する円筒のインパクター (、) 組み立て装置は、機械的負荷および/または片に衝撃エネルギーを規定します。標本なしデバイスで表示されています。(b) 実験の模式図。(例えば0.1 N) 制御静的関節軟骨はカバー ガラスに対して圧縮するよう、解剖標本の上に (例えば、1 mJ) 衝撃荷重を適用ことができますおよび/または。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 有害機械的負荷後関節面の代表的な顕微鏡写真。関節の表面 (、) 遠位大腿骨顆と有害機械後上腕骨頭 (b) 載荷の代表的な顕微鏡写真 (影響 [1 mJ] と静的 [N 1] をそれぞれ読み込む)。緑の細胞がそのまま細胞膜と軟骨を染色極めて赤核はグリセリンの細胞膜を傷つけられた細胞を示している一方で。 (c) 拡大の観負傷/死んだ細胞 (黄色の輪郭) 部の上腕骨頭の関節面。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 負傷/死細胞の領域。遠位大腿骨顆を( b) と上腕骨頭の (c, d) (、 c) 後静的関節表面の負傷/死んだ細胞の領域 (0.1 N、0.5 N と 1 N; n = グループあたり 6) と (b, d)衝撃 (1 mJ、2 mJ と 4 mJ; n = グループあたり 6) を読み込みます。すべての軟骨の骨標本は、雌性 balb/c 8-10 週古いマウスから得られました。データは、平均 + 標準偏差;括弧は統計学的有意 α = 0.05 テューキーアドホックの記事比較に分散分析 (ANOVA) テストによって決定されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
1 の補足ファイル。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
上記の方法は、機械的負荷や衝撃を規定すた後マウスの関節から関節軟骨現実的で負傷/デッドその場を可視化する正常に採用されました。特に、2 つの異なる関節から完全にそのまま軟骨内軟骨細胞の力学的脆弱性を分析することができました: 膝関節 (遠位大腿骨) と肩 (上腕骨)。当社の代表的な結果を示す細胞傷害関節面上の空間範囲が荷重の大きさと影響の強さ (図 3) に敏感に依存します。重要なは、このメソッドを使用して関連する生理学的条件下での機械的負荷に対する細胞の応答の調査が容易になります。つまり、それは、そのまま生理下関節に関節軟骨のテストを有効し、生理学的負荷 (補足のファイル 1を参照してください: セクション 2)。
その場で実行可能なベースライン、いくつかのプロトコルの変更で軟骨細胞を維持し、トラブルシューティングにマウスの滑膜関節と課題の解剖を実行する急な学習曲線を考える必要があります。解剖時に関節軟骨細胞損傷の最大のリスクは、2.3.10 と 2.4.7 を通じて 2.4.5 2.3.5 の手順中に発生します。研究者、解剖中に細胞傷害/死を最小限に抑える手術器具 (例えば、軟組織を除去するとき、組織や宝石商の鉗子をカットするときのメス) と供試体の関節面間の接触を避ける必要があります。.ただし、手袋と関節面に触れて少し細胞傷害/死を誘導します。基準セル実行可能性を改善するために軟部組織、関節から削除の量を削減する必要があります。また、細かいツールを使用しても、解離によって誘導される細胞死は減らす一般的に。最終的には、厳格なベースラインで関節軟骨の解剖関連する損傷の有無の確認が両方透過染料で標本を染色することをお勧めだ (カルセイン AM と PI の読み込み前に)、研究者は、特に中解剖の手順を理解すること (補足のファイル 1を参照してください: 3 セクション)。
マウスモデルは、マウス ジョイントのサイズが小さく、マウスのゲノムの遺伝の可操作性を考えると、関節軟骨の機械的負荷に対する脆弱性を検討する大規模な動物モデルの上の複数の利点を提供します。しかし、筆者の知る限り、研究以前行ったないその場でそのままマウス軟骨の機械的負荷による関節軟骨の損傷/死を定量化します。調査官は、通常、機械的損傷3,4,5,6,7,による細胞死の程度を調査するのに植大動物モデルの関節から削除を使用します。8,9,10,11,12します対照的に、マウス モデルを容易にする 1) 特定のボーンのほぼ全体の関節面の可視化。・ 2) ネイティブの境界条件を損なうことがなくそのまま関節の後読み込みまたはポスト影響の軟骨性の解析。さらに、マウス試験片を圧縮、生成大動物モデルと比較して大幅により小さい接触域したがって、応力は与えられた荷重のマグニチュードの大規模な動物モデルで大幅に上回っています。したがって、細胞損傷がより小さい負荷によることができます。さらに、マウスモデルは軟骨の変性に関する研究を促進し、特に、変形性関節症、この病気として誘起すること簡単に遺伝的19,20,21,をマウスで22、食事23,24または手術操作25,26,,2728。また、BALB/c と C57BL/629,30を含むいくつかのマウス系統において自発性変形性関節症が発生します。
当社の代表的なデータの機械的荷重除去後細胞傷害/死 5 分を定量化するのに生存率 (ライブ/デッド) 汚れを使用しました。死んだ細胞 (完全に破裂膜細胞) から私たちに、これらの実験は負傷した細胞 (一時的に破裂膜細胞) に差別されないかもしれませんを認めます。それは、カルセイン負のセルであり、円周率の肯定的な-を膜が時間をかけて彼らの膜スケールいくつか分31秒に至る以前グリセリン 5 月修理をしたことを示します。実際には、実験の別のセットでがわかります (~ 5%) では、機械的外傷を生き残る「負傷」細胞割合小さいが重要な (補足のファイル 1を参照してください: セクション 4).したがって、常に細胞生存率を示すものではない膜の完全性の直接測定は、ライブ/デッド染色です。特に、「負傷」傷害が機械的外傷によるプラズマ膜の完全性の (可能性のある一時的な) 損失として定義されている、PI 正と負でカルセイン細胞最も適切に定義されます。我々 はまたのみ即時 (壊死) 細胞死が私たちの代表的なデータの可能性がありますに反映していることを認めます。両方の壊死の定量化を有効にする必要がありますイメージ投射標本 (例えば負荷の除去後 48 h) 後の時点で、アポトーシス細胞死。
いくつかの制限は、これらのメソッドを使用するときに考慮されなければなりません。この原稿の試用実験の結果, テスト プラットフォーム (図 3) の機能を示す 8 10 週齢雌性 balb/c マウスを使いました。しかし、高齢のマウス大腿骨における細胞密度の顕著な変化のために負荷による細胞傷害の評価が課題となって (ただし可能) 古い大腿骨で (成功率 = 40%)。対照的に、上腕骨の細胞密度の顕著な変化は認められなかった 61 81 週齢の c57bl/6 マウスの (補足のファイル 1を参照してください: セクション 5)、それによって 8 81 週の年齢に役立つテストのプラットフォームを作るします。別の制限は、大腿骨顆、上腕骨頭の関節面にのみ細胞傷害の空間範囲を分析するメソッドが使用されたことです。ただし、メソッドは、共焦点レーザー顕微鏡による細胞傷害の深さに依存した空間的な広がりを分析するさらに拡張できます。後者の方法より関与し、時間のかかる分析、長い画像の取込時間より高価な機器の使用を必要とする注意してください。最後に、関節軟骨とカバーガラスの間接触の場所マウス32,33の生理学的に関連していた、この位置は変化ないさせた。しかし、私たちのテスト プラットフォームにより連絡先場所の変化回転電機子と大腿骨や上腕骨を掴む場合。
結論としては、制御された機械的負荷および/またはそのまま軟骨の関節面に影響のアプリケーションを可能にする生体外でマウス損傷モデルを開発しました。このモデルは、リアルタイムかつ迅速な単一イメージ ベース解析細胞傷害/死の蛍光に分類された関節軟骨細胞の可視化を実現。 にします。重要なは、この手法を使用して、異なる機械的負荷のレジメン、異なる環境条件や短期的および長期的な軟骨細胞生存率の異なる遺伝的操作の効果をテストできます。したがって、当社のプラットフォームは、基本的な科学の質問および軟骨細胞の機械的脆弱性に関連する治療上のターゲットを画面を調査するためのツールを提供します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、pH メーター、osmometer の寛大な使用のため博士リチャード ・ ウォーとルイス Delgadillo を感謝したいです。さらに、著者はアンドレア ・李のメカニカル テスト システムの初期開発への貢献をありがとうたいと思います。この研究は、NIH P30 AR069655 によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
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