Summary
אנו מציגים שיטה להערכת מידת המרחבי פציעה/מות תאים על המשטח במפרק של המפרקים מאתר ללא פגע לאחר היישום של המון מכני מבוקר או השפעות. בשיטה זו יכול לשמש כדי לחקור כיצד דלקת מפרקים ניוונית, גורמים גנטיים ו/או משטרי העמסה שונים משפיעים על פגיעות בחיי עיר chondrocytes.
Abstract
הומאוסטזיס של הסחוס במפרק תלוי הכדאיות של תושב תאים (chondrocytes). למרבה הצער, טראומה מכני יכול לגרום מוות chondrocyte נרחבת, שעלול כדי התמוטטות בלתי הפיכה של המפרק ואת תחילתה של דלקת מפרקים ניוונית. בנוסף, תחזוקה של הכדאיות chondrocyte חשוב בהליכים שתל osteochondral לקבלת תוצאות אופטימליות כירורגי. אנו מציגים שיטה להערכת מידת המרחבי פציעה/מות תאים על משטח שלם המפרקים synovial מאתר במפרק לאחר היישום של המון מכני מבוקר או השפעות. בשיטה זו ניתן להשתמש במחקרים השוואתיים כדי לחקור את ההשפעות של משטרי שונים העמסה מכנית, תנאים סביבתיים שונים או מניפולציות גנטיות, כמו גם בשלבים שונים של ניוון סחוס קצר - ו/או לטווח ארוך פגיעות של chondrocytes במפרק באתרו. המטרה של פרוטוקול הציג בכתב היד הוא להעריך את מידת פגיעה/מות תאים על המשטח במפרק של המפרקים synovial מאתר המרחבי. חשוב לציין, שיטה זו מאפשרת בדיקה על סחוס תקין לחלוטין מבלי להתפשר על תנאי גבול מקורית. יתר על כן, היא מאפשרת הדמיה בזמן אמת של chondrocytes במפרק המוכתם ביותר וניתוח יחיד המבוססת על תמונה של תא פגיעה הנגרמת על-ידי יישום של חשמל סטטי מבוקר ואת ההשפעה טעינת משטרי. התוצאות נציג שלנו להפגין כי בריא הסחוס explants, מידת פגיעה תא המרחבי תלוי ברגישות עוצמת הגודל וההשפעה עומס. השיטה שלנו ניתן להתאים בקלות לחקור את ההשפעות של משטרי שונים העמסה מכנית, תנאים סביבתיים שונים או מניפולציות גנטיות שונות על הפגיעות מכני של בחיי עיר chondrocytes במפרק.
Introduction
הסחוס במפרק (AC) הוא עומס הנושאת מרקמת מכסה ומגן עצמות המפרקים synovial, מתן חלקה היגוי משותפת. הומאוסטזיס רקמות תלויה הכדאיות של chondrocytes, סוג התא הבלעדית המתגוררים AC. עם זאת, חשיפה של הסחוס כוחות קיצוניים עקב טראומה (למשל, נופל, פציעות תאונה או ספורט רכב) או עקב אי-יציבות משותפת פוסט-טראומטי יכול לגרום מוות chondrocyte, המוביל אל התמוטטות בלתי הפיכה של המפרק (דלקת מפרקים ניוונית) 1. יתר על כן, ב- osteochondral הרכבה הליכים שמטרתם לתקן פגמים המקומי סחוס פגום, ההכנסה-הקשורים לטראומה מכנית שתל מפחית את הכדאיות chondrocyte ויש לו השפעות מזיקות על תוצאות ניתוח2.
סחוס explant מודלים משמשים כדי ללמוד את הרגישות של chondrocytes במפרק למוות תא מכנית-induced. מודלים אלה בדרך כלל להשתמש explants של חיות גדולות כדי לחקור את ההשפעות של טעינת תנאים, תנאי הסביבה וגורמים אחרים על התא פגיעות3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. עם זאת, בשל גודלו של המפרקים מקורית, מודלים אלה דורשים בדרך כלל הסרת פקק מפני השטח במפרק של המפרק ללא פגע, ובכך להתפשר על תנאי גבול מקורית. יתר על כן, הם בדרך כלל דורשים יישום של המון מכני גדול כדי לגרום פגיעה בתא. לחלופין, סחוס מאתר explant מודלים מספקים מספר יתרונות על פני דגמים בעלי חיים גדולים בלימוד פגיעות מכניות בחיי עיר chondrocytes. בפרט, עקב שלהם בממדים קטנים יותר, מודלים אלה מאפשרים בדיקה של הסחוס במפרק ללא פגע באופן מלא מבלי לשנות את תקינות מקורית רקמות. בנוסף, הטעינה של הסחוס מאתר מתרחשת מעל אזורים קטנים קשר כזה chondrocyte מוות/פציעה יכולה להיגרם עם המון קטן (< 1 N). לבסוף, הגנום העכבר בקלות מטופל, הפיכת בדיקות הפגיעה גנים כמה ספציפית את הרגישות של chondrocytes בחיי עיר לפגיעה מכנית.
המטרה הכוללת של השיטה הציג כתב יד זה לכמת, באופן חזותי ב- real-זמן-המרחבי היקף באתרו בתוך תא מוות/פציעה עקב המון מכני שהוחלו על העכבר שלם מלא סחוס-על-עצם explants חוץ גופית בתוך. שיטה זו דורשת ניתוח זהיר של המפרקים synovial העכבר מבלי להתפשר על הכדאיות chondrocyte, ואחריו בדיקות מכניות של ויטראז'ים חיוני explants שימוש בהתקן רכוב מיקרוסקופ הדומה פלטפורמה בדיקות שפיתחנו לאחרונה כדי לכמת תכונות מכניות הסחוס מאתר16. במהלך בדיקות מכניות, חלק גדול של המשטח מפרקיות (שלם) של העצם והטרף הוא גלוי על מיקרוסקופ פלורסצנטיות יחיד, המאפשרים ניתוח מהירה של התא הכדאיות אחרי עומס מוחל. ניתוח דומה של תא שטח הכדאיות של הסחוס מאתר explants בוצעה בעבר, אך ללא יישום סימולטני של עומס17. יישומים אפשריים של השיטה שלנו כוללים מחקרים השוואתיים כדי לחקור את הפגיעות של chondrocytes במפרק כדי תנאים סביבתיים וגורמים מכאניים מבוקרים שונים, כמו גם הקרנת טיפולים שמטרתם להפחית את הרגישות של chondrocytes כדי העמסה מכנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העבודה בעלי חיים אושרה על ידי הוועדה אוניברסיטת רוצ'סטר משאבים בעלי חיים.
1. פתרונות
- להכין תמיסת מלח מאוזנת של האנק (1 X HBSS) המכיל סידן, מגנזיום, אין פנול אדום. להתאים את ה-pH ל 7.4 על-ידי הוספת כמויות קטנות של HCl או NaOH.
- להתאים את osmolarity כדי 303 mOsm על-ידי הוספת NaCl או מים יונים. השתמש המאגר תוך כדי ניתוח, הדגימה הכנה בדיקות מכניות.
2. ניתוח של בעצם הירך, הזרוע צינתור עם הסחוס במפרק במלואה ללא פגע
- המתת חסד את העכבר בהתאם להנחיות מוסדיים באמצעות תא שאיפת2 CO ואחריו נקע בצוואר הרחם. בצע את הטכניקה aseptic ברחבי.
הערה: עכברים בין 8 ל 81 שבועות הישן של כל זן סקס ניתן להשתמש. - השתמש בכלים כירורגיים הבאים עבור ניתוח: מיקרו-מספריים (משמש להכנת חתכים), מספריים ויבתר סטנדרטי (משמש עבור חיתוך העצם), ומהדקים עם #11 האזמל להב (משמש עבור חיתוך רקמה רכה), מלקחיים התכשיטן (משמש להסרת רך רקמות) ומלקחיים סטנדרטי (המשמשים פילינג ברקמה הרכה של העור).
- עבור ניתוח בעצם הירך , עקוב אחר ההוראות.
- מיקום העכבר במצב פרקדן.
- עושים חתך קטן (~ 5 מ מ) של העור בחלק הקדמי של הברך.
- להרחיב את החתך כל הדרך סביב הברך, להפשיל את העור כדי לחשוף את שרירי מפרק והרגל של הברך.
- החל מסוף הפרוקסימלית של עצם הירך, להשתמש באזמל להב (11) לחתוך לאורך הכיוון דיסטלי. מקם את הלהב בין יחידת גיד השריר הארבע ראשי אל הצד הקדמי של הירך פיר. להרחיב את החתך לכיוון, העבר את עצם הפיקה וסיום על ידי חיתוך דרך האמצע של הגיד ברך, ובכך להסיר את יחידת גיד השריר הארבע ראשי.
- החל מסוף הפרוקסימלית של עצם הירך, להשתמש באזמל להב (11) לחתוך לאורך הכיוון דיסטלי. מקם את הלהב בין יחידת גיד שריר שריר הירך אל הצד האחורי של הירך פיר. לאחר החתך מתקרב הברך, להתחיל לחתוך הרקמות הרכות, נמנע מקשר בין את האזמל אל פני condyles דיסטלי של עצם הירך במפרק. לסיים את החתך אחרי הברך.
- משוך לאחור את הארבע ראשי והשרירים שריר הירך כדי לחשוף את עצם הירך. גזור משם כל שריר עודף על הצדדים לרוחב ו המדיאלי של עצם הירך.
- לחתוך את השריר עגל על הצד האחורי של עצם השוקה הפרוקסימלית ו להעיף את הרגל כדי להמחיש את הצד האחורי של עצם הירך.
- לחשוף את condyles דיסטלי של עצם הירך ושל השטח האחורי של עצם השוקה proximal על ידי הסרת עודפי הרקמה סביב הברך.
- חותכים anterior ואת אחורי צולבת הרצועות באמצעות אזמל, גזירה מן condyles הירך. משוך את השוקה הרחק עצם הירך, לחתוך כל הרצועות להפריד את עצם הירך של הרגל התחתונה.
- באמצעות מספריים ויבתר סטנדרטי, לחתוך עצם הירך בקצה הפרוקסימלית של העצם (8 מ מ מעל המפרק tibio-הירך) מן הצד הלטראלי . לאחר חיתוך העצם, נגבי כל מח גלוי על החלק החיצוני של העצם כדי למנוע זיהום אפשרי מתאי מח עצם.
הערה: גזירה מן הצד הלטראלי מפחיתה את הסיכון של התפשטות סדק לאורך העצם. - הסר סביב רקמות רכות (קרי, גידים, שרירים עודף) של עצם הירך באמצעות מלקחיים התכשיטן ולחשוף את הסחוס על שני condyles בקצה הדיסטלי של עצם הירך. יש למנוע מגע בין הסחוס מלקחיים.
- עבור ניתוח של עצם הזרוע , עקוב אחר ההוראות.
- מיקום העכבר במצב פרקדן.
- אעשה חתך (~ 5 מ מ) בעור בצד האחורי של המרפק באמצעות מיקרו-מספריים, להרחיב את החתך סביב המרפק, להפשיל את העור כדי לחשוף את השרירים של הזרוע, הכתף.
- החל מסוף הפרוקסימלית של עצם הזרוע, להשתמש באזמל להב (11) לחתוך לאורך הכיוון דיסטלי. מקם את הלהב בין יחידת גיד שריר התלת ראשי אל הצד האחורי של עצם הזרוע. להרחיב את החתך לקראת הקצה הדיסטלי של עצם הזרוע וסיום דרך הגיד התלת.
- ואז משוך לאחור את התלת לקראת הסוף הפרוקסימלית של עצם הזרוע עד הראש המפרק חשוף.
- לחתוך את רקמת החיבור סביב הראש המפרק באמצעות אזמל להב (#11) מבלי לגעת במשטח מפרקיות ולהסיר את האיבר (הזרוע, הכתף) מן הגוף. מעת לעת מימה השטח במפרק של הראש המפרק עם HBSS.
- נתק את עצם הזרוע הזרוע על ידי שבירת הראשון מסוף proximal הגומד בצד האחורי של הזרוע בעזרת מלקחיים וחיתוך רקמת החיבור מסביב לקצה הדיסטלי של עצם הזרוע. הסר את כל רקמות עודף על עצם הזרוע.
- חתוך את tuberosity הדלתא על הצד האחורי של עצם הזרוע בעזרת מספריים ויבתר סטנדרטי.
- מניחים את specimen(s) גזור לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL המכיל מאגר HBSS.
3. בשידור חי (Calcein AM) / המתים (Propidium יודיד) צביעת פרוטוקול
- הכתם באמצעות calcein AM כדלקמן.
- עושים פתרון מניות של calcein AM על ידי הוספת µL 12.5 של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) לתוך בקבוקון של 50 µg של calcein AM, וכתוצאה מכך ריכוז מניות של 4 מ"ג/מ"ל (4.02 מ מ).
- לדלל את 1:400 פתרון calcein מניות ב- HBSS כדי להגיע ריכוז של 10 µg/mL (10.05 מיקרומטר) של סידן AM (לדוגמה, להוסיף µL 1.25 של פתרון מניות 500 µL של HBSS).
- Centrifuge הפתרון מכתימים מדולל 5 s ב g x 2,000 כדי להבטיח כי כל לצבוע, אשר עשויים לעיתים לדבוק דפנות הצינור, מתערבב עם המאגר. אל תסיר את תגובת שיקוע. מערבולת הפתרון כדי להבטיח לערבב.
- מכניסים את הדגימה ביתור צינור microcentrifuge 1.5 mL המכיל 500 µL של הפתרון מכתימים מדולל. דגירה הדגימה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב- thermomixer תוך כדי לזעזע-800 סל ד. ודא שהצינורות מכוסים בנייר אלומיניום כדי להגן מפני חשיפה לאור.
- להעביר את הדגימה לתוך מאגר HBSS ללא AM calcein. בשלב זה, הדגימה הוא מוכן לבדיקה מכני.
- להכין propidium יודיד (PI) צביעת פתרון כדלקמן.
- להכין את החוקר מכתים פתרון על ידי דילול פתרון מניות שנרכשו (1 מ"ג/מ"ל, 1.5 מ מ) 1:25 ב- HBSS כדי להגיע 40 µg/mL (60 מיקרומטר) של פאי. לדוגמה, להוסיף 40 µL של פתרון מניות 1000 µL של HBSS.
- שמור את PI מכתים פתרון יתעופף כדי להגן עליה מפני חשיפה לאור. להשתמש הפתרון מכתימים מיידית לאחר הבדיקה מכני כדי לאתר תאים פצוע (ראו סעיף 4).
הערה: אחד יכול לבצע ההכתמה PI לפני טעינה גם להעריך יותר בקפדנות איכות ניתוח.
4. פרוטוקול הבדיקה מכני
- להניח הדגימה (עצם הירך או עצם הזרוע) על גבי השקופית זכוכית של התקן מותאם אישית רכוב מיקרוסקופ מכני בדיקות כגון פני השטח במפרק condyles הירך האחורי או הראש המפרק יושב על הזכוכית (איור 1).
הערה: להדק של 10 מ מ באורך המוליך עץ (קוטר = 2 מ מ) לצד דיסטלי של עצם הזרוע באמצעות דבק cyanoacrylate לפני הנחת לתוך ההתקן על מנת לייצב את הדגימה על משטח שטוח. לקבלת תיאור מפורט של פלטפורמת בדיקה מכאנית ראה 1 הקבצים המשלימים: סעיף 1. - מימה הדגימה עם HBSS ומניחים את ההתקן עם הדגימה על גבי מיקרוסקופ זריחה.
- תמונה chondrocytes במפרק מוכתם calcein AM (עירור/פליטה אורכי גל = 495/515 ננומטר) לפני יישום (בסיסית) במטען תחת מיקרוסקופ זריחה עם 4 X יבש עדשה (נה = 0.13). התאם את הגדרות רכישה כדי למטב את איכות התמונה.
- החל טעינת מכני על גבי הדגימה כך הסחוס במפרק דחוס נגד הזכוכית המכסה.
- עבור טעינה סטטית, להחיל שנקבעו סטטי עומס (למשל, 0.5 N) על גבי הדגימה (עצם הירך או עצם הזרוע). להחזיק את העומס למשך 5 דקות ולאחר מכן הסר אותו.
- ההשפעה, החל של אנרגיה השפעה מרשם (למשל, 1 mJ) על הדגימה על ידי הטלת של impactor גלילי ממשקל ידוע (למשל, 0.1 N) מגובה מרשם (למשל, 1 ס מ). שחרור ה-s עומס 5 לאחר הפגיעה.
הערה: המשקל של impactor (מ ג), ואת הגובה מרשם (h) ניתן להמיר אנרגיה ההשפעה (E) באמצעות המשוואה הבאה: E = mgh.
- דגירה הדגימה ב- PI מכתים פתרון עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- תמונה chondrocytes במפרק מוכתם calcein AM ו- PI (אורכי גל עירור/פליטה = 535/617 ננומטר) תחת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (איור 2).
5. ניתוח נתונים
- לכמת האזור של תאים נפגע/מת בשל משטר העמסה מכנית יישומית.
- פתח את micrographs של פני השטח מפרקיות רכשה לפני ואחרי יישום של עומס מכני ImageJ18.
- לשלב את התמונות לתוך ערימה.
- קבע את קנה המידה של תמונות בהתבסס על רזולוציית התמונה.
- השתמש בכלי מצולע כדי להגדיר את האזור שבו התאים הפך calcein-שלילי (אובדן פלורסצנטיות ירוק) ו- PI-חיוביות (רווח של פלואורסצנטי אדום). תאים אלה נחשבים נפגע או מת.
- לקבוע את האזור של תאים נפגע/המלח בעזרת הכלי מדידה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שש שונה חלה פרוטוקולים טעינה (טעינה סטטית: 0.1 N, 0.5 N ו- 1 N 5 דקות; וטעינה ההשפעה: 1 mJ, 2 מ"ג ו 4 mJ) reproducibly המושרה לכימות תחומי תא פגיעת סחוס המפרק ואת הירך המתקבל 8-10-בת שבוע BALB/c עכברים (לשפות אחרות איור 2). חשוב, מידת פגיעה chondrocyte על פני השטח מפרקיות המרחבי נמדד במהירות ובקלות ImageJ. התוצאות נציג מדגימים כי פגיעות מכאניות במפרק chondrocytes הושפע עוצמת הגודל וההשפעה עומס. בפרט, גבוה יותר לטעון מגניטודות וההשפעה גבוה בעוצמות להרעה משמעותית היקף המרחבי תא פציעת ירך והן humeri (איור 3).
איור 1 : ייצוג סכמטי של המכשיר מותאם אישית בדיקה מכאנית. () מכשיר התכנסו עם impactor גלילי המשמש להחלת שנקבעו המון מכנית ו/או השפעה אנרגיות הדגימה. ההתקן מוצג ללא דגימה. (b) ייצוג סכמטי של הניסוי. (לדוגמה, 0.1 N) מבוקרת סטטי ו/או טעינת ההשפעה (למשל, 1 mJ) יכול להיות מיושם על גבי הדגימה ביתור כך הסחוס במפרק דחוס נגד הזכוכית המכסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : Micrograph הנציגה של המשטח במפרק לאחר העמסה מכנית וההדברה. Micrograph נציג של condyles במפרק הירך משטח על () דיסטלי ו- (b) הראש המפרק לאחר השתחררות מכונות העמסה (השפעה [1 mJ] וסטטי טעינת [1 N], בהתאמה). תאים ירוק חיוני מוכתמים chondrocytes עם קרום התא ללא פגע בעוד הגרעינים אדום לציין תאים פצוע עם קרום התא permeabilized. (ג) Zoomed בתצוגה של האזור של תאים נפגע/מת (קווי המתאר צהוב) על פני הראש המפרק במפרק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : אזור של תאים נפגע/מת. אזור של תאים נפגע/המלח על פני במפרק condyles הירך הדיסטלי (a, b), המפרק לראש (c, d) אחרי (, c) סטטי (0.1 N, 0.5 N ו- 1 N; n = 6 לכל קבוצה) ו- (b, d) השפעה (1 מ"ג, 2 mJ ו 4 mJ; n = 6 לכל קבוצה) טעינה. כל דגימות סחוס-על-עצם, התקבלו עכברים הנשי של 8-10 שבועות BALB/c. הנתונים הם ממוצע + סטיית תקן; סוגריים מרובעים מציינות מובהקות סטטיסטית-α = 0.05 נקבעים על-ידי בחינה של ניתוח שונות (ANOVA) Tukey פוסט הוק השוואות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
קובץ משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטות המתוארות לעיל הועסקו בהצלחה להמחיש ובר קיימא נפגע/מת ב באתרו chondrocytes במפרק של המפרקים העכבר לאחר שנקבעו עומסים מכאניים או השפעות. בפרט, הצלחנו לנתח את הפגיעות מכני של chondrocytes בתוך הסחוס במפרק שלם מלא של שני המפרקים synovial שונים: מפרק הברך (דיסטלי עצמות הירך) ואת הכתף (humeri). התוצאות נציג שלנו מראים כי היקף המרחבי תא פציעה על-פני מפרקיות תלויה ברגישות עוצמת הגודל וההשפעה עומס (איור 3). חשוב מכך, השימוש בשיטה זו מקלה על חקירות של התגובה התאית העמסה מכנית בתנאים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. כלומר, היא מאפשרת בדיקה של הסחוס במפרק על שלם משותפת תחת פיזיולוגיים וטוען supraphysiological (ראו 1 הקבצים המשלימים: בסעיף 2).
בהתחשב עקומת למידה תלולה בביצוע ניתוח של המפרקים synovial מאתר ואתגרים תוך שמירה על מעשי בחיי עיר chondrocytes בנקודת ההתחלה, כמה שינויים בפרוטוקול ופתרון עשוי להידרש. הסכנה הגדולה ביותר של נזק במפרק chondrocytes במהלך ניתוח מתרחשת במהלך השלבים 2.3.5 דרך 2.3.10 2.4.5 דרך 2.4.7. כדי למזער פגיעה/מוות של תאים במהלך ניתוח, החוקר צריך להימנע כל קשר בין כלי כירורגי (למשל, את האזמל בעת חיתוך לרקמת או מלקחיים התכשיטן בעת הסרת הרקמות הרכות) השטח במפרק של הדגימה . עם זאת, לגעת במשטח במפרק עם כפפה גורם פגיעה תא קטן/מוות.... על מנת לשפר את יכולת הקיום הבסיסית תא, גם ייתכן צורך להפחית את כמות רקמה רכה שהוסר המפרק. בנוסף, באמצעות כלים עדינה יותר יהיה בדרך כלל להפחית מוות תאי הנוצרות על-ידי ניתוח. בסופו של דבר, לאשר בקפדנות בהעדר נזק הקשורים דיסקציה של chondrocytes במפרק בנקודת ההתחלה, זה רצוי כתם דגימות עם שני צבעי חדירות (calcein AM ו- PI, לפני טעינת). במיוחד כשהוא חוקר זה היכרות עם ההליך לנתיחה (ראו 1 קובץ משלים: סעיף 3).
לאור גודלו הקטן של המפרק העכבר, את manipulability הגנטי של הגנום העכבר, מודלים מאתר מספקים יתרונות מרובים על מודלים בעלי חיים גדולים ללמוד פגיעות של chondrocytes במפרק העמסה מכנית. עם זאת, לידע של המחברים, אין מחקרים בעבר נערכו לכמת פגיעה/מות בחיי עיר chondrocytes במפרק עקב טעינת מכני של הסחוס מאתר ללא פגע. החוקרים משתמשים בדרך כלל explants מן המפרקים של מודלים בעלי חיים גדולים ומדדים של מוות תאי עקב פציעה מכני3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12. לעומת זאת, מודלים העכבר להקל 1) הדמיה של פני מפרקיות כולו כמעט על עצם נתון; ו- 2) ניתוחים של הכדאיות chondrocyte פוסט-טעינת או שלאחר הפגיעה במפרקים שלם מבלי להתפשר על תנאי גבול מקורית. יתר על כן, בעוד דחוס, דגימות העכבר ליצור אזורים קשר קטנים יותר באופן משמעותי לעומת מודלים בעלי חיים גדולים; לכן, לחצים גבוהים באופן דרמטי במודלים של בעלי חיים גדולים עבור סדר הגודל עומס נתון. לפיכך, פציעה תא יכולה להיגרם על ידי מטענים קטנים. בנוסף, הדגמים מאתר להקל על מחקר על ניוון סחוס ו, בפרט, דלקת מפרקים ניוונית, כמו מחלה זו יכולה בקלות להיגרם בעכברים באמצעות גנטי19,20,21, 22, תזונתיים23,24 או מניפולציות כירורגי25,26,27,28. יתר על כן, דלקת מפרקים ניוונית ספונטנית מתרחשת כולל BALB/c ו- C57BL/629,30זנים שונים של העכבר.
בנתוני הנציגה שלנו, השתמשנו כתמי הכדאיות (חי/מת) לכמת פגיעה/מות תאים 5 דקות לאחר הסרת העמסה מכנית. אנו להכיר כי ניסויים אלה אולי לא להפלות נפגעים תאים (תאים עם ממברנות קרע באופן זמני) של תאים מתים (תאים עם לצמיתות יתבקע ממברנות). זה הוא, תאים calcein שלילי, PI חיובי-המציין כי הקרום היה בעבר permeabilized-מאי תיקון הקרומים שלהם לאורך זמן מאזני ועד כמה דקות31שניות. למעשה, סט נפרד של ניסויים, יש לנו נחוש כי השבר של תאים "נפגע" לשרוד טראומה מכנית היא קטנה (~ 5%) אך משמעותית (ראו 1 הקבצים המשלימים: סעיף 4). לכן, צביעת חי/מת הוא מדד ישיר של הקרומיות, כי הוא לא תמיד מעידה על יכולת הקיום התא. בפרט, התאים PI-חיוביים ושליליים -calcein מוגדרים כראוי ביותר כמו "נפגע", שבו פגיעה מוגדר אובדן שלמות קרום פלזמה עקב טראומה מכנית (שעשויות להיות זמני). אנו גם להכיר כי הנתונים הנציגה שלנו סביר משקף מוות תאי (נמק) מיידית בלבד. הדמיה דגימות בשלבים מאוחרים יותר זמן (למשל, 48 שעות לאחר הסרת העומס) צריך לאפשר כימות של שניהם עם נמק ומוות תא אפופטוטיים להיפגע.
יש לקחת בחשבון מספר מגבלות בעת שימוש בשיטות אלה. בניסויים הניסיון שלנו עבור כתב יד זה, השתמשנו עכברים BALB/c הנשי 10 שבועות-בן 8 כדי להדגים את היכולות של פלטפורמת בדיקה (איור 3). עם זאת, עקב שינויים מורגש תא צפיפות עצמות הירך של עכברים בוגרים, ההערכה של תא המטען-induced פגיעה הופך מאתגרת יותר (אם כי אפשרית) בעצמות הירך בוגרים (שיעור ההצלחה = 40%). לעומת זאת, אין שינויים מורגש בצפיפות תא על humeri נצפו בעכברים C57BL/6 61-81-בת שבוע (ראו 1 הקבצים המשלימים: סעיף 5), ובכך גורם שימושי עבור פלטפורמת בדיקה גילאי 8-81 שבועות. מגבלה נוספת היא כי השיטה שימשה כדי לנתח את היקף התא פגיעה רק על פני במפרק הירך condyles וראש המפרק המרחבי. עם זאת, השיטה יכול להיות להרחיב לנתח במידה המרחבי תלויי-עומק הפגיעה תא על-ידי שימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית סריקת לייזר. שימו לב כי השיטה השנייה ידרוש שימוש של ציוד יקר יותר, זמן רב יותר של רכישת התמונה יותר מעורב וניתוח גוזלת זמן. בסופו של דבר, למרות המיקום קשר בין הסחוס במפרק הזכוכית המכסה היה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית עכברים32,33, מיקום זה היו מגוונים לא. עם זאת, פלטפורמת בדיקה שלנו מאפשר וריאציה של המיקום קשר אם עצם הירך או עצם הזרוע שוצפת אבזור מסתובב.
לסיכום, פיתחנו במבחנה פציעה מאתר מודל המאפשר יישום טוען מכני מבוקר ו/או השפעות על גבי המשטח במפרק של הסחוס במפרק ללא פגע. מודל זה מאפשר הדמיה של chondrocytes במפרק fluorescently שכותרתו בניתוח בזמן אמת ומהירה יחיד המבוססת על תמונה של פציעה/מוות של תאים. חשוב מכך, ההשפעות של משטרי שונים העמסה מכנית, תנאים סביבתיים שונים או שינויים גנטיים שונים על הכדאיות chondrocyte קצר - ו/או לטווח ארוך יכול להיבדק באמצעות מתודולוגיה זו. לפיכך, הפלטפורמה שלנו מספק כלי לחקור שאלות בסיסיות ומטרות טיפוליות מסך הקשורים בפגיעות מכניות של chondrocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות ד ר ריצ'רד וו ו לואיס Delgadillo לשימוש נדיב של שלהם ph ו- osmometer. בנוסף, המחברים רוצה להודות לי. אנדריאה לתרום לפיתוח הראשוני של מערכת בדיקות מכניות. מחקר זה מומן על ידי NIH P30 AR069655.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
References
- Lotz, M. K., Kraus, V. B. New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211 (2010).
- Pallante, A. L., et al. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).
- Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).
- Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading. Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).
- Goodwin, W., et al. Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death. Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).
- Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).
- Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer. Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).
- Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).
- Lee, W., et al. Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
- Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).
- Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).
- Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).
- Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).
- Martin, J. A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage. Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).
- Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence. Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).
- Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).
- Zhang, M., et al. Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Habouri, L., et al. Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).
- Higuchi, Y., et al. Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model. Scientific Reports. 7 (1), 7028 (2017).
- Zhu, M., et al. Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).
- Hu, K., et al. Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen. Arthritis & Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).
- Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), R198 (2011).
- Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise. Arthritis & Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus. Scientific Reports. 7, 42294 (2017).
- Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).
- Wilhelmi, G., Faust, R. Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside. Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).
- Stoop, R., et al. Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice. Arthritis & Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).
- Adebayo, O. O., et al. Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).
- Vahedipour, A., et al. Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound. Journal of Biomechanics. , (2018).
