Summary
Vi presenterer en metode for å vurdere romlige omfanget av skaden/celledød på articular overflaten av intakt murine ledd etter kontrollert mekaniske belastninger eller konsekvenser. Denne metoden kan brukes til å undersøke hvordan slitasjegikt, genetiske faktorer og/eller annen lasting regimer påvirker sikkerhetsproblemet av i situ chondrocytes.
Abstract
Homeostase av articular brusk avhenger levedyktigheten til bosatt celler (chondrocytes). Dessverre, mekanisk traume kan indusere utbredt chondrocyte død, kan føre til permanent skade av skjøten og utbruddet av slitasjegikt. I tillegg, er vedlikehold av chondrocyte levedyktighet viktig i osteochondral pode prosedyrer for optimal kirurgisk resultater. Vi presenterer en metode for å vurdere romlige omfanget av skaden/celledød på articular overflaten av intakt murine synovial ledd etter kontrollert mekaniske belastninger eller konsekvenser. Denne metoden kan brukes i komparative studier undersøke effekten av ulike mekaniske belastninger regimer, ulike miljøforhold eller genetisk manipulasjon og ulike stadier av brusken degenerasjon på kort - og/eller langsiktig sikkerhetsproblemet av i situ articular chondrocytes. Målet med protokollen i manuskriptet er å vurdere romlige omfanget av skaden/celledød på articular overflaten av murine synovial ledd. Viktigere, kan denne metoden testing på fullt intakt brusk uten at innfødt betingelser. Videre gir det sanntids visualisering av svært farget articular chondrocytes og enkelt bildebasert analyse for celle skade indusert ved kontrollert statisk og innvirkning lasting regimer. Vår representant resultater viser at sunn brusk explants, romlige omfanget av celle skade avhenger følsomt Last omfanget og effekten intensitet. Vår metode kan enkelt tilpasses til å undersøke effekten av ulike mekaniske belastninger regimer, ulike miljøforhold eller annet genetisk manipulasjon sikkerhetsproblemet i mekanisk av i situ articular chondrocytes.
Introduction
Articular brusk (AC) er en bærende vev som dekker og beskytter bein i synovial ledd, gir jevn felles artikulasjon. Vev homeostase er avhengig av levedyktigheten til chondrocytes, den eneste celle typen bosatt i AC. Men kan eksponering for brusk ekstreme styrker på grunn av traumer (f.eks, faller, kjøretøy ulykke eller sport skader) eller posttraumatisk felles ustabilitet indusere chondrocyte død, fører til irreversibel skade av skjøten (slitasjegikt) 1. videre osteochondral innpoding prosedyrer som mål å reparere lokale feil i skadet brusk, pode innsetting-assosiert mekanisk traume reduserer chondrocyte levedyktighet og har skadevirkninger kirurgisk resultater2.
Brusk explant modeller brukes vanligvis til å studere mottakelighet av articular chondrocytes til mekanisk-indusert celledød. Disse modellene bruker vanligvis explants fra store dyr til å studere virkningene av lasting forhold, miljømessige forhold og andre faktorer på cellen sikkerhetsproblemet3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Men på grunn av den store størrelsen på lokale leddene krever disse modellene generelt fjerning av en plugg fra articular overflaten av en intakt felles, dermed misbruke innfødt betingelser. Videre krever de vanligvis bruk av store mekaniske belastninger å indusere celle skade. Alternativt gir murine brusk explant modeller flere fordeler over større dyr modeller i studerer mekanisk sikkerhetsproblemet av i situ chondrocytes. Spesielt på grunn av sine mindre dimensjoner forenkle disse modellene testing av fullt intakt articular brusk uten å forandre innfødt vev integritet. I tillegg lasting av murine brusk skjer over små kontakt områder slik at chondrocyte død/skade kan bli indusert med små laster (< 1 N). Til slutt, musen genomet enkelt endres, slik at testing av hvordan bestemte gener innvirkning mottakelighet av i situ chondrocytes til mekanisk skade.
Det overordnede målet med metoden i dette manuskriptet å kvantifisere og visualisere i Real-Time-tid-romlige vi for i situ celle død/personskader anvendt mekaniske belastninger på fullt intakt musen brusk-på-ben explants i vitro. Denne metoden krever forsiktig Disseksjon av musen synovial ledd uten at chondrocyte levedyktighet, etterfulgt av mekanisk testing av svært farget explants bruker et mikroskop-montert enhet som ligner en testing plattform som vi nylig utviklet å kvantifisere murine brusk mekaniske egenskaper16. Under mekanisk testing, vises en stor del av (intakt) articular overflaten av dissekert benet på et enkelt fluorescens mikroskop-bilde, slik at rask analyse av cellen levedyktighet etter en belastning påføres. En tilsvarende analyse av overflaten celle levedyktighet i murine brusk explants er utført tidligere, men uten samtidig anvendelse av Last17. Potensielle anvendelser av vår metode inkluderer komparative studier undersøke sikkerhetsproblemet av articular chondrocytes ulike kontrollert miljø og mekanisk forhold og screening av behandlinger å redusere følsomheten av chondrocytes til mekanisk lasting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr arbeid ble godkjent av University of Rochester dyr ressurser.
1. løsninger
- Forberede Hanks balansert saltløsning (1 X HBSS) som inneholder kalsium, magnesium og ingen fenol rød. Justere pH 7,4 ved å legge små mengder HCl eller NaOH.
- Justere osmolaritet til 303 mOsm legge til NaCl eller deionisert vann. Bruke buffer under disseksjoner, prøven forberedelse og mekanisk testing.
2. dissections distale Femur og proksimale Humerus med fullt intakt Articular brusk
- Euthanize musen i henhold til institusjonelle retningslinjene benytter en CO2 innånding kammer etterfulgt av cervical forvridning. Følg steril teknikk hele.
Merk: Mus mellom 8 og 81 uker gammel av belastning og sex kan brukes. - Bruk følgende kirurgiske verktøy for disseksjoner: mikro-saks (brukt til å lage snitt), standard dissecting saks (brukes for kutte beinet), skalpell med #11 skalpell blade (brukes til skjæring bløtvev), gullsmed tang (brukes til fjerning av myke vev) og standard tang (brukes for peeling bløtvev og huden).
- Følg instruksjonene nedenfor for disseksjoner av distale femur .
- Plasser musen i supine posisjon.
- Gjør en liten (~ 5 mm) snitt i huden på den fremre delen av kneet.
- Utvide innsnitt hele veien rundt kneet og trekke tilbake huden til å utsette kneet felles og benet musklene.
- Starter fra den proksimale enden av femur, bruk en skalpell blad (#11) for å klippe distale retning. Plasser bladet mellom quadriceps muskel-sene enheten og den fremre siden av femur akselen. Utvide kuttet mot og tidligere patella og avslutte ved å kutte gjennom midten av patellarsenen, og dermed fjerne quadriceps muskel-sene enheten.
- Starter fra den proksimale enden av femur, bruk en skalpell blad (#11) for å klippe distale retning. Plasser bladet mellom hamstring muskel-sene enheten og den bakre siden av femur akselen. Når kuttet tilnærminger kneleddet, begynne å skjære gjennom bløtvev, unngå kontakt mellom skalpell og articular overflaten på de distale Kondyler av femur. Fullføre kuttet forbi kneleddet.
- Skyv quadriceps og hamstring muskler å avsløre femur. Klippe bort noen overflødig muskler på laterale og medial side av femur.
- Skjær kalv muskler på bakre side av proksimale tibia og vende benet for å visualisere den bakre siden av femur.
- Utsette de distale Kondyler av femur og bakre overflate proksimale tibia ved å fjerne overflødig vev rundt kneleddet.
- Kuttet fremre og bakre cruciate leddbånd ved hjelp av en skalpell, kutte fra femur Kondyler. Trekke tibia fra femur og kuttet alle båndene for å skille leggen fra femur.
- Bruker standard dissecting saks, skjære gjennom femur ved den proksimale enden av bein (8 mm over tibio-femoral felles) fra den laterale siden. Etter klipping benet, tørke bort alle synlige marg på utsiden av benet å unngå mulig smitte fra bein margtransplantasjon celler.
Merk: Klippe fra lateralt reduserer risikoen for sprekk forplantning langs benet. - Fjerne omkringliggende bløtvev (dvs., leddbånd og overflødig muskel) fra femur med gullsmed tang og utsette brusken på begge Kondyler på distale femur. Unngå kontakt mellom brusk og tang.
- Følg instruksjonene nedenfor for disseksjoner av humerus .
- Plasser musen i supine posisjon.
- Gjøre et snitt (~ 5 mm) i huden på bakre side av albuen med mikro-saks, utvide snitt rundt albuen og trekke tilbake huden til å utsette musklene i armen og skulder.
- Starter fra den proksimale enden av humerus, bruk en skalpell blad (#11) for å klippe distale retning. Plasser bladet mellom triceps muskel-sene enheten og den bakre siden av humerus. Utvide kuttet mot distale humerus og avslutt med å skjære gjennom triceps senen.
- Deretter trekke tilbake triceps mot den proksimale enden av humerus til humeral hodet er utsatt.
- Skjær connective vev rundt humeral hodet med en skalpell blad (#11) uten å berøre articular overflaten og fjern lem (arm og skulder) fra kroppen. Regelmessig hydrat articular overflaten av humeral hodet med HBSS.
- Koble humerus fra armen av første bryte av den proksimale enden av ulna på bakre side av armen ved hjelp av pinsett og deretter kutte connective vev rundt distale humerus. Fjerne alle overflødig vev på humerus.
- Avskåret deltoid tuberosity på bakre side av humerus med standard dissecting saks.
- Plass den dissekert specimen(s) i en 1,5 mL microcentrifuge rør som inneholder HBSS buffer.
3. live (Calcein AM) / Dead (Propidium Iodide) flekker protokollen
- Flekk ved hjelp calcein er som følger.
- Gjøre en lagerløsning av calcein AM ved å legge til 12,5 µL av dimethyl sulfoxide (DMSO) til ampuller med 50 µg av calcein AM, noe som resulterer i en lager konsentrasjon av 4 mg/mL (4.02 mM).
- Fortynne lager calcein løsning 1:400 i HBSS å nå en konsentrasjon av 10 µg/mL (10.05 µM) av kalsium AM (for eksempel legge 1,25 µL av lagerløsning til 500 µL av HBSS).
- Sentrifuge utvannet flekker løsningen for 5 s 2000 x g å sikre at alle fargestoff, som kan noen ganger stick til veggene av røret, blander med bufferen. Ikke Fjern nedbryting. Vortex løsningen å sikre riktig blanding.
- Dissekert prøven inn en 1,5 mL microcentrifuge rør som inneholder 500 µL av utvannet flekker løsningen. Inkuber prøven ved 37 ° C i 30 minutter i en thermomixer mens agiterte 800 RPM. Kontroller at rørene er dekket i aluminiumsfolie å beskytte mot eksponering for lys.
- Overføre prøven i calcein AM-fri HBSS buffer. På dette punktet, er prøven klar for mekanisk testing.
- Forberede propidium iodide (PI) flekker løsning som følger.
- Forberede PI flekker løsning fortynne kjøpt lagerløsning (1 mg/mL, 1,5 mM) 1:25 i HBSS å nå 40 µg/mL (60 µM) av PI. For eksempel legge til 40 µL av lagerløsning 1000 µL av HBSS.
- Holde PI flekker løsning dekket i aluminiumsfolie som beskyttelse mot eksponering for lys. Bruk flekker løsningen for umiddelbar etter mekanisk testen for å oppdage skadede celler (se Seksjon 4).
Merk: En kan utføre den PI flekker før lasting i tillegg til mer strengt vurdere kvaliteten på disseksjoner.
4. mekanisk Testing protokollen
- Plass prøven (femur eller humerus) på objektglass av egendefinerte mikroskop-montert testing slik at articular overflaten på bakre femur Kondyler eller humeral hode sitter på glasset (figur 1).
Merk: Fest en 10 mm lange tre applikator (diameter = 2 mm) til den distale siden av humerus med cyanoacrylate lim før du plasserer det på enheten for å stabilisere prøven på flatt underlag. For en detaljert beskrivelse av mekanisk testing plattform se utfyllende fil 1: del 1. - Hydrat prøven med HBSS og plasser apparatet med prøven på fluorescens mikroskop.
- Bilde av articular chondrocytes farget med calcein AM (eksitasjon/utslipp bølgelengder = 495/515 nm) før (grunnlinje) program av lasten under fluorescens mikroskop med en 4 X tørr linse (NA = 0,13). Justere oppkjøpet for å optimalisere bildekvaliteten.
- Bruke mekanisk lasting på prøven slik at articular brusk er komprimert mot dekselet glasset.
- For statisk lasting, gjelde en foreskrevet statisk belastning (f.eks0,5 N) på prøven (femur eller humerus). Hold belastningen i 5 minutter og deretter fjerne den.
- For effekten, bruk en foreskrevet innvirkning energi (f.eks, 1 mJ) på prøven ved å slippe en sylindrisk nedslaget kjent vekt (f.eks0,1 N) fra foreskrevet høyde (f.eks, 1 cm). Slipp laste 5 s etterkant.
Merk: Vekten av nedslaget (mg) og foreskrevet høyden (h) kan konverteres til innvirkning energi (E) ved hjelp av følgende ligning: E = mgh.
- Inkuber prøven i PI flekker løsning for 5 min ved romtemperatur.
- Bilde av articular chondrocytes farget med calcein AM og PI (eksitasjon/utslipp bølgelengder = 535/617 nm) under fluorescens mikroskop (figur 2).
5. analyse
- Kvantifisere området av skadet/døde celler på grunn av den brukte mekaniske belastninger diett.
- Åpne micrographs av articular overflaten før og etter påføring av mekanisk belastning ImageJ18.
- Kombinere bilder i en stabel.
- Angi omfanget av bildene basert på bildeoppløsningen.
- Bruk polygonverktøyet til å definere området der cellene ble calcein-negativ (tap av grønne fluorescens) og PI-positive (økning av røde fluorescens). Disse cellene er ansett å være skadet eller døde.
- Bestemme området av skadet/døde celler ved hjelp av måleverktøyet .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seks forskjellige brukt lasting protokoller (statisk lasting: 0,1 N, 0,5 N og 1 N for 5 min, og virkningen lasting: 1 mJ, 2 mJ og 4 mJ) reproduserbar indusert kvantifiserbar celle skade i femur og humeral brusk fra 8-10-uke-gamle BALB/c mus (områder Figur 2). Viktigere, ble romlig omfanget av chondrocyte skade på articular overflaten målt raskt og enkelt i ImageJ. Representant resultatene viser at mekanisk sikkerhetsproblemet av articular chondrocytes var påvirket av Last omfanget og effekten intensitet. Spesielt laste høyere størrelser og høyere påvirkning intensiteter betydelig forverret romlige omfanget av celle skade både femurs og humeri (Figur 3).
Figur 1 : Skjematisk fremstilling av egendefinerte mekanisk testing enheten. (en) samlet enhet med sylindriske nedslaget brukes gjelder foreskrevet mekaniske belastninger og/eller virkningen energier til en prøve. Enheten vises uten en prøve. (b) skjematisk fremstilling av eksperimentet. Kontrollert statisk (f.eks0,1 N) og/eller effekt (f.eks, 1 mJ) lasting kan brukes på dissekert prøven slik at articular brusk er komprimert mot dekselet glasset. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant mikroskop-bilde av articular overflaten etter skadelig mekanisk lasting. Representant mikroskop-bilde av articular overflaten på (en) den distale femur Kondyler og (b) humeral hodet etter skadelig mekanisk lasting (virkningen [1 mJ] og statisk lasting [1 N], henholdsvis). Grønne celler er svært farget chondrocytes med intakt cellemembraner mens røde kjerner angi skadet celler med permeabilized cellemembraner. (c) bratt stigning i visningen av skadet/døde celler (gul konturer) på articular overflaten av humeral hodet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Skadet/dead celleområde. Området av skadet/døde celler på articular overflaten av de distale femur Kondyler (en, b) og humeral leder (c, d) etter (en, c) statisk (0,1 N, 0,5 N og 1 N; n = 6 per gruppe) og (b, d) innvirkning (1 mJ, 2 mJ og 4 mJ; n = 6 per gruppe) lasting. Alle brusk på bone prøver ble innhentet fra kvinnelige BALB/c 8-10 uker gammel mus. Dataene er betyr + standardavvik; parentes betegne statistisk signifikans på α = 0,05 bestemmes av variansanalyse (ANOVA) test med Tukey legge hoc sammenligninger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende filen 1. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metodene som er beskrevet ovenfor var vellykket ansatt å visualisere levedyktig og skadet/døde i situ articular chondrocytes fra musen ledd etter foreskrevet mekaniske belastninger eller konsekvenser. Spesielt vi kunne analysere mekanisk sikkerhetsproblemet av chondrocytes i fullt intakt articular brusk fra to forskjellige synovial ledd: kneleddet (distale femurs) og skulder (humeri). Våre representant resultater viser at romlig omfanget av celle skade på articular overflaten avhenger følsomt Last omfanget og effekten intensitet (Figur 3). Viktigere, muliggjør bruk av denne metoden undersøkelser av cellulær respons til mekanisk lasting fysiologisk relevante vilkår. At det gjør testing av articular brusk på en intakt felles under fysiologiske og supraphysiological laster (se utfyllende fil 1: del 2).
Gitt den bratt læringskurven utføre disseksjoner murine synovial ledd og utfordringer i å bevare levedyktig i situ chondrocytes ved baseline, noen protokoll endring og feilsøking kan være nødvendig. Den største risikoen for skadelige articular chondrocytes under disseksjon oppstår under trinn 2.3.5 gjennom 2.3.10 og 2.4.5 gjennom 2.4.7. For å minimere celledød skade under disseksjoner, bør forskeren unngå kontakt mellom kirurgiske verktøy (f.eks, skalpell når kutte vev eller gullsmeden og tang når du fjerner bløtvev) og articular overflaten av prøven . Men induserer berøre den articular med hanske liten celle skade/død. For å forbedre planlagte celle levedyktighet, kan det også være nødvendig å redusere mengden av mykt vev som er fjernet fra leddet. I tillegg reduserer bruker finere verktøy generelt disseksjon-indusert celledød. Til slutt, for å strengt kontrollere fravær av disseksjon-assosiert skade av articular chondrocytes ved baseline, er det tilrådelig å flekken prøver med både permeabilitet fargestoffer (calcein AM og PI, før lasting) spesielt mens forskeren er bli kjent med disseksjon prosedyren (se ekstra fil 1: avsnitt 3).
Gitt den lille størrelsen av musen og den genetiske manipulability i musen genomet, gir murine modeller flere fordeler over store dyr modeller å studere sikkerhetsproblemet av articular chondrocytes til mekanisk lasting. Imidlertid til forfatternes kunnskap, har ingen studier tidligere blitt gjennomført for å kvantifisere skade/død i situ articular chondrocytes på grunn av mekaniske belastninger av intakt murine brusk. Etterforskerne bruker vanligvis explants fjernet fra leddene i store dyr modeller for å undersøke omfanget av celledød på grunn av mekanisk skade3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12. derimot musen modeller lette 1) visualisering av nesten hele articular overflaten på en gitt Ben; og 2) analyser av etter lasting eller etter effekt chondrocyte levedyktighet i intakt ledd uten at innfødt betingelser. Videre mens komprimert, generere mus prøver betydelig mindre kontakt områder i forhold til store dyr modeller; Derfor er stress dramatisk høyere enn i store dyr modeller for en gitt Last størrelsesorden. Derfor kan celle skade bli indusert av mindre laster. I tillegg murine modeller fasilitere forskning på brusken degenerasjon og, spesielt, slitasjegikt, som denne sykdommen kan lett indusert i mus gjennom genetisk19,20,21, 22, kosttilskudd23,24 eller kirurgisk manipulasjoner25,26,27,28. Videre oppstår spontan slitasjegikt i flere musen stammer inkludert BALB/c og C57BL/629,30.
I vår representant data brukte vi levedyktighet (live/død) flekker for å kvantifisere celle skade/død 5 min etter fjerning av mekaniske belastninger. Vi erkjenner at disse eksperimentene ikke kan diskriminere skadet celler (celler med midlertidig sprukket membraner) fra døde celler (celler med permanent brudd membraner). Som er calcein negativ celler og PI positiv-indikerer at membranen var tidligere permeabilized mai reparasjon deres membraner over tid skalerer spenner fra sekunder til flere minutter31. Faktisk, i et separat sett av eksperimenter, vi har fastslått at brøkdel av "skadde" celler som mekanisk traume er liten (~ 5%) men signifikant (se utfyllende fil 1: seksjon 4). Derfor er live/døde flekker et direkte mål membran integritet som ikke er alltid om cellen levedyktighet. Spesielt er PI-positive og calcein-negativ celler mest hensiktsmessig definert som "skadet", der skade er definert som (potensielt midlertidig) tap av plasma membranen integritet på grunn av mekanisk traume. Vi erkjenner også at vår representant data sannsynligvis gjenspeiler bare umiddelbar (nekrotisk) celledød. Imaging prøver på senere tidspunkt (f.eks48 timer etter fjerning av Last) bør aktivere kvantifisering av begge necrotic og apoptotisk celledød.
Flere begrensninger må vurderes når du bruker disse metodene. I vår prøve eksperimenter for dette manuskriptet brukte vi 8-10 uker gammel kvinnelig BALB/c mus for å vise mulighetene til testing plattform (Figur 3). Men på grunn av merkbare endringer i celle tetthet i femurs av eldre mus, vurdering av belastningen-indusert celle skade blir mer utfordrende (om mulig) i eldre femurs (suksessrate = 40%). Derimot ingen merkbare endringer i celle tetthet på humeri ble observert i 61-81-uke-gamle C57BL/6 mus (se utfyllende fil 1: 5-delen), og dermed gjør testing plattform nyttig for alderen 8-81 uker. En annen begrensning er at metoden ble brukt til å analysere romlige omfanget av celle skade på articular overflaten av femur Kondyler og humeral hodet. Men kan metoden videre bli utvidet for å analysere dybde-avhengige romlige omfanget av celle skade gjennom bruk av laserskanning AC confocal mikroskopi. Merk at sistnevnte ville kreve bruk av dyrere utstyr, lengre bilde oppkjøpet tid og mer involvert og tidkrevende analyse. Til slutt, selv om hvor kontakt mellom articular brusk og dekket glasset var fysiologisk relevante for mus32,33, beliggenheten var ikke variert. Våre testing plattform gir imidlertid variant av kontakt plasseringen hvis femur eller humerus er grepet av en roterende anker.
I konklusjonen, har vi utviklet en i vitro murine skade modell som gjør bruk av kontrollerte mekaniske belastninger og/eller virkninger på articular overflaten av intakt articular brusk. Denne modellen muliggjør visualisering av fluorescently merket articular chondrocytes i sanntid og rask enkelt bilde-basert analyse av celledød skade. Viktigere, kan effekten av ulike mekaniske belastninger regimer, ulike miljøforhold eller annet genetisk manipulasjon på kort - og/eller langsiktig chondrocyte levedyktighet testes med denne metoden. Dermed gir vår plattform et verktøy for å avhøre grunnleggende vitenskap spørsmål og skjermen terapeutiske mål relatert til mekanisk sikkerhetsproblemet av chondrocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Dr. Richard Waugh og Luis Delgadillo for generøse bruk av pH-meter og osmometer. I tillegg gjerne forfatterne takke Andrea Lee for å bidra til utviklingen av mekanisk testsystem. Denne studien ble finansiert av NIH P30 AR069655.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
References
- Lotz, M. K., Kraus, V. B. New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211 (2010).
- Pallante, A. L., et al. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).
- Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).
- Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading. Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).
- Goodwin, W., et al. Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death. Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).
- Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).
- Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer. Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).
- Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).
- Lee, W., et al. Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
- Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).
- Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).
- Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).
- Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).
- Martin, J. A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage. Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).
- Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence. Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).
- Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).
- Zhang, M., et al. Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Habouri, L., et al. Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).
- Higuchi, Y., et al. Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model. Scientific Reports. 7 (1), 7028 (2017).
- Zhu, M., et al. Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).
- Hu, K., et al. Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen. Arthritis & Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).
- Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), R198 (2011).
- Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise. Arthritis & Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus. Scientific Reports. 7, 42294 (2017).
- Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).
- Wilhelmi, G., Faust, R. Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside. Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).
- Stoop, R., et al. Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice. Arthritis & Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).
- Adebayo, O. O., et al. Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).
- Vahedipour, A., et al. Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound. Journal of Biomechanics. , (2018).
