Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

فحص الأنماط الجينية القطنية لمقاومة النيماتود الرينيفورم

Published: May 2, 2019 doi: 10.3791/58577
Automatic Translation
1, 1
1Crop Genetics Research Unit, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

هنا، يتم تقديم بروتوكول للفحص السريع غير المدمر للأنماط الجينية القطنية لمقاومة الديدان الخيطية الرنيومفورمية. ويشمل البروتوكول الفحص البصري لجذور شتلات القطن المصابة بالديدان الخيطية لتحديد استجابة العدوى. ثم يتم نشر تبادل لاطلاق النار النباتية من كل مصنع لاسترداد النباتات لإنتاج البذور.

Abstract

وهناك حاجة إلى النيماتود reniform سريعة(Rotylenchulus reniformis)بروتوكول الفرز لتطوير القطن المقاوم(Gossypium hirsutum)أصناف لتحسين إدارة الديدان الخيطية. وتشمل معظم البروتوكولات استخراج الديدان الخيطية أو البيض من نظام جذر القطن أو التربة القدور لتحديد الكثافة السكانية أو معدل التكاثر. وتستغرق هذه النهج عموما ً وقتاً طويلاً مع تقييم عدد صغير من الأنماط الجينية. ويرد هنا وصف لنهج بديل يتم فيه فحص نظام الجذر بصريا ً للكشف عن عدوى الديدان الخيطية. ويشمل البروتوكول تلقيح شتلات القطن بعد 7 أيام من الزراعة مع الديدان الخيطية فيرميفورم وتحديد عدد الإناث المرتبطة بنظام الجذر بعد 28 يوما من التلقيح. يتم التعبير عن البيانات كعدد الإناث لكل غرام من الوزن الجذر الطازج لضبط للتغير في نمو الجذر. ويوفر البروتوكول طريقة ممتازة لتقييم مقاومة النبات المضيف المرتبطة بقدرة الديدان الخيطية على إنشاء موقع للعدوى؛ ومع ذلك، لا يتم تقييم المقاومة التي تعوق استنساخ الديدان الخيطية. وكما هو الحال مع بروتوكولات الفحص الأخرى، يلاحظ الاختلاف عادة في عدوى الديدان الخيطية بين الأنماط الجينية الفردية داخل التجارب وفيما بينها. وتُعرض البيانات لتوضيح نطاق التباين اتُهم باستخدام البروتوكول. لضبط هذا الاختلاف، يتم تضمين الأنماط الجينية للتحكم في التجارب. ومع ذلك، يوفر البروتوكول طريقة بسيطة وسريعة لتقييم مقاومة النبات المضيف. وقد استخدم البروتوكول بنجاح لتحديد حالات الانضمام المقاومة من G. جمع الجراثيم مشتل وتقييم فصل السكان من أكثر من 300 فرد لتحديد علم الوراثة من المقاومة. كما تم تطوير طريقة انتشار نباتية لاستعادة النباتات من أجل التكاثر المقاوم. بعد إزالة نظام الجذر لتقييم الديدان الخيطية، يتم إعادة زرع تبادل لاطلاق النار الخضري للسماح بتطوير نظام جذر جديد. أكثر من 95٪ من يطلق النار عادة تطوير نظام جذر جديد مع النباتات تصل إلى مرحلة النضج.

Introduction

روتيلنشولوس رينيفورميس (لينفورد وأوليفيرا)، ويشار إليها عادة باسم الديدان الخيطية reniform، هي واحدة من الأنواع الرئيسية الديدان الخيطية الطفيلية الموجودة في التربة في جنوب شرق الولايات المتحدة1،2،3. وnematode هو ملزمة، المستقرة شبه endoparasite تتطلب النبات المضيف لإكمال دورة حياتها2،4. فيرميفورم الديدان الخيطية الإناث قبل البالغين تخترق نظام الجذر المضيف لإنشاء موقع تغذية في stele2,3. كما يغذي الديدان الخيطية وينضج، فإن الجزء الخلفي المتبقية خارج الجذر المضيف تنتفخ عندإنتاج البيض، وتشكيل شكل الكلى مميزة (الشكل 1). Rotylenchulus reniformis قادر ة على التغذية على نظام الجذر لأكثر من300 نوع من النباتات، بما في ذلك القطن 4. ويزرع القطن في المرتفعات(Gossypium hirsutum L.) على نطاق واسع في جنوب شرق الولايات المتحدة، ولكن عدم وجود R. أصناف مقاومة النيوروميس تعيق إدارةالديدان الخيطية 2،3. وقد استخدمت استراتيجيات الإدارة مثل معالجة النيماتيكيد والتناوب مع أنواع المحاصيل غير المضيفة للحد من التربة R. الكثافات السكانية reniformis 5،6، ولكن البذور خسائر غلة القطن يمكن أن تتراوح عادة من 1 إلى 5 ٪2. أعراض R. يمكن أن تشمل عدوى النيورومبيس التقزم النباتي، ونمو الجذور المكبوتة، ونقص التغذية، وإجهاض الفاكهة، وتأخر النضج2. ومع ذلك، قد لا تكون الأعراض واضحة بسبب توحيد الأعراض في جميع أنحاء الميدان; لذلك، نُهج تقييم R. هناك حاجة إلى عدوى الرينيفورميس لتحديد وتطوير أصناف القطن المرتفعات المقاومة. تقييم R. ويعتبر مقاومة النيوروميس في القطن صعبة7، لأن نظام الجذر المصاب قد يبدو طبيعيا على الرغم من أن النبات قد تظهر أعراض العدوى8.

يلزم وضع بروتوكول فعال لفحص الديدان الخيطية لتحديد R. [رنفورمس] انضمامات مقاومة من القطن [جرمبلازم] تجميع, وللتعيين من المقاومة علم وراثة ل هذا انضمامات. ومن شأن هذا البروتوكول أن يساعد في نقل جينات المقاومة إلى القطن في المرتفعات. وقد استخدمت أساليب مختلفة للاختبار البيولوجي لتقييم R. reniformis العدوى في القطن8،9،10،11،12،13،14،15. وبوجه عام، استخدم نهجان رئيسيان لتحديد R. الرنيوموجينية القطنية المقاومة. النهج الأكثر استخداما ينطوي على استخراج البيض و / أو الديدان الخيطية من النباتات المصابة أو التربة8،11،12،14،15. وتشمل المنهجية العامة لهذا النهج زراعة البذور للأنماط الجينية القطنية الفردية في الأواني المنفصلة، مما يسمح للشتلات بالتطور لمدة 7 إلى 14 يوماً، وتلقيح الشتلات عن طريق إضافة خليط من المراحل الفيرميفورمية من R. الرنبيفورمإلى التربة، والسماح للنيماتودس لتصيب نظام الجذر لمدة 30 إلى 60 يوما. بعد ذلك، يتم استخراج الديدان الخيطية و/أو البيض من نظام الجذر المصاب لكل نبات أو من التربة القدور. ثم يتم تحديد عدد الديدان الخيطية المستخرجة أو البيض لتقدير الكثافة السكانية ومعدل التكاثر، والتي تتم مقارنتها بالتحكم في الأنماط الجينية من أجل تحديد الأنماط الجينية المقاومة.

وهناك نهج بديل، كما هو موضح هنا، ينطوي على فحص مجهري لنظام جذر القطن الذي أصيب بالديدان الخيطية لتحديد عدد الديدان الخيطية الأنثوية الطفيلية الجذور10،16. وعلى غرار النهج الأخرى، تزرع الأنماط الجينية القطنية في أواني منفصلة وتطعيمها بالديدان الخيطية الفيرميفورمية بعد حوالي 7 أيام من الزراعة. في غضون 30 يوما بعد التلقيح ، تتم إزالة نظام الجذر من النباتات الفردية ويتم شطف التربة من الجذور. بعد ذلك، يتم تلوين الديدان الخيطية المرتبطة بنظام الجذر مع تلوين الطعام الأحمر17،ويتم فحص الجذور مجهريًا لتحديد عدد مواقع العدوى مع الأنماط الجينية القطنية المقاومة (التي تم تحديدها على أساس عدد الديدان الخيطية لكل غرام من الجذر) مقارنة مع السيطرة عرضة16. وينطوي هذا النهج الثاني على ميزة زيادة الإنتاجية عن طريق تقليل عدد الأيام اللازمة للتقييم وزيادة عدد الأنماط الجينية الفردية التي تم تقييمها في تجربة واحدة. وغالبا ما تستغرق منهجيات الفرز التي تقيّم الكثافة السكانية أو معدل الإنجاب وقتا أطول من تلك التي تستند إلى الملاحظات البصرية لعلامات العدوى7. ومع ذلك، فإن أحد القيود على هذا النهج هو أن مقاومة النبات المضيف الذي يعوق استنساخ الديدان الخيطية كما يحددها إنتاج البيض لا يتم تقييم13.

بروتوكولات الفرز لR. مقاومة reniformis غالبا ما تدمر نظام الجذر أثناء التقييم7 وتنطوي على تبادل لاطلاق النار الخضري يجري التخلص منها. وللتغلب على هذا القيد، تم تطوير طريقة للانتشار الخضري للسماح باستعادة النباتات لإنتاج البذور18. بعد إزالة نظام الجذر لتقييم الديدان الخيطية ، يتم زرع تبادل لاطلاق النار الخضري في التربة potting للسماح للنظام الجذر لإعادة النمو. يحتوي هذا الأسلوب على تطبيقات واسعة لمعظم R. بروتوكولات فحص النىفورميس. طريقة بسيطة وسريعة للانتشار الخضري ذات أهمية حاسمة لتربية R. أصناف القطن المرتفعات المقاومة للرينيفورميس، حيث يلزم استعادة الذرية للتقدم بالأنماط الجينية المقاومة للجيل القادم.

يتم تقديم بروتوكول للفحص على نطاق واسع من الأنماط الجينية القطنية لمقاومة الديدان الخيطية الرنبيفورم. والهدف من ذلك هو تطوير طريقة فحص بسيطة وسريعة غير مدمرة لتقييم تجمعات تربية القطن لمقاومة الديدان الخيطية من أجل المساعدة في تربية أصناف القطن المرتفعات المقاومة. باستخدام هذا البروتوكول، يتم عادة الحصول على البيانات في غضون 35 يوما، مع تقييم أكثر من 300 الأنماط الجينية في تجربة واحدة. وتُعرض البيانات للأنماط الجينية المقاومة والقابلة للتأثر لتوضيح التباين الذي يُلاحظ عادة باستخدام هذه الأساليب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الحفاظ على مصدر R. محمد محمد إنوكولوم

  1. ملء الأواني الفخارية تيرا كوتا (15 سم في القطر، 13.5 سم في الارتفاع) مع مزيج البخار المبستر من 1-جزء الطفال الرملي والرمال 2 أجزاء. زرع الطماطم عرضة(Solanum lycopersicon)متنوعة في كل وعاء ووضع الأواني في منزل زجاجي.
    ملاحظة: يمكن استخدام أصناف نباتية أخرى قابلة للتأثر مثل القطن بدلاً من الطماطم.
  2. تلقيح نباتات الطماطم مع الديدان الخيطية الرنبيفورم (انظر الخطوة 3.3). الحفاظ على النباتات في glasshouse في درجة حرارة 28 درجة مئوية تقريبا.

2. زراعة الأنماط الجينية القطن لR. محمد محمد تقييم المقاومة

  1. إعداد التربة من خلال الجمع بين 2-أجزاء الرمال الجميلة مع 1-جزء الطفال الرملي التي تم جمعها من الميدان.
  2. البخار بسترة خليط التربة لضمان أن التربة خالية من الديدان الخيطية ومسببات الأمراض النباتية المنقولة بالتربة.
  3. إضافة خليط التربة إلى الأواني البلاستيكية المخروطية (4 سم في القطر، 21 سم في الارتفاع). قبل ملء الأواني، وضع كرة من القطن في الجزء السفلي من وعاء لمنع فقدان التربة. ملء جزئيا الأواني مع التربة ما يقرب من 2 سم من أعلى.
  4. إعداد حصة من البلاستيك لكل وعاء لتعيين النمط الجيني ليتم زرعها.
  5. بذور نباتية من الأنماط الجينية القطنية المختارة للتقييم.
    1. زرع بذرة واحدة في كل وعاء لتقييم السكان الفصل، والتي تمثل كل بذرة النمط الجيني فريدة من نوعها.
    2. بالنسبة لأصناف القطن أو الإنباتات الجرثومية، قم بزراعة بذور من 2 إلى 3 بذور في وعاء واحد لضمان إنبات نبات واحد على الأقل مع إزالة الشتلات الأخرى من الأواني قبل تلقيح الديدان الخيطية.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أن تنبت البذور لمدة 24 إلى 72 ساعة قبل الزراعة لتقليل عدد الأواني مع البذور غير قابلة للحياة.
  6. بذور النبات من أنماط جينية مختارة مقاومة وعرضة للتحكم.
    ملاحظة: يتم تكرار الأنماط الجينية للتحكم من 5 إلى 10 مرات لتقييم الاختلافات الطبيعية المتأصلة في منهجية الفرز.
  7. ملء الأواني مع التربة إضافية لتغطية البذور في كل وعاء.
  8. وضع الأواني في غرفة النمو. الحفاظ على درجة حرارة ثابتة من 28 درجة مئوية، ودرجة حرارة الهواء المحيط، لغرفة النمو. توفير الإضاءة الاصطناعية مع مزيج من المصابيح الفلورية والمتوهجة مع 16 ساعة photoperiod.
  9. وضع باعثات المياه في كل وعاء، والمياه الأواني مرتين في اليوم باستخدام نظام سقي التلقائي. ضبط نظام سقي لتوفير مياه إضافية مع نمو النبات.

3. تطعيم الديدان الخيطية من نباتات القطن وإعداد عينات الجذر

  1. استخراج الديدان الخيطية الرنبيفورم vermiform الحفاظ على نباتات الطماطم عرضة (انظر الخطوة 1) باستخدام التفريق19 وتعويم الطرد المركزي20 منهجيات في اليوم السابق للتلقيح. تخزين الديدان الخيطية المستخرجة في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: استخراج قمع Baermann21 هو طريقة بديلة لاستخراج الديدان الخيطية.
  2. تحديد عدد الديدان الخيطية المستخرجة عن طريق عد عدد الديدان الخيطية في عينة فرعية 100 ميكرولتر وإعداد تعليق 1000 الديدان الخيطية / مل في مياه الصنبور للتلقيح.
  3. تلقيح شتلات القطن 7 د بعد زرع مع تعليق الديدان الخيطية. خلق الاكتئاب الصغيرة في التربة بجوار النبات، وماصة 1 مل من تعليق الديدان الخيطية reniform في الاكتئاب.
  4. إزالة النباتات من الأواني 28 د بعد التلقيح لتقييم الديدان الخيطية.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، النباتات هي ما يقرب من 15 سم طويل القامة مع 4 إلى 6 أوراق الموسعة بالكامل.
    1. إزالة معظم الأوراق الموسعة بالكامل من النباتات باستخدام مقص قبل إزالة النباتات من الأواني.
    2. لإزالة النباتات من الأواني، اضغط على وعاء وحرك التربة إلى اليد.
    3. إزالة بلطف التربة من الجذور عن طريق تحريك نظام الجذر في مياه الصنبور في حاوية 10 لتر. شطف لفترة وجيزة نظام الجذر في وعاء من مياه الصنبور نظيفة.
    4. إزالة نظام الجذر من النبات حوالي 1 سم تحت خط التربة باستخدام مقص.
  5. وضع نظام الجذر في 120 مل من البلاستيك، غير معقمة، حاوية عينة المتاح جنبا إلى جنب مع حصة من البلاستيك من وعاء المستخدمة لتحديد الهوية.
    ملاحظة: تتم معالجة نماذج متعددة قبل المتابعة إلى الخطوة 3.7. انتقل إلى الخطوة 4 للانتشار الخضري لاطلاق النار النبات.
  6. إعداد 12.5٪ (V / V) حل من المواد الغذائية الحمراء تلوين17 في مياه الصنبور لوصمة عار الديدان الخيطية تعلق على نظام الجذر.
  7. إضافة ما يقرب من 30 مل من محلول تلوين الطعام الأحمر إلى عينة الجذر في حاوية عينة لتغطية تماما نظام الجذر.
  8. ضع حاوية العينة في فرن ميكروويف وسخن عينة الجذر حتى يبدأ محلول التلطيخ في الغليان. إزالة العينة من فرن الميكروويف والسماح للعينة لتبرد في درجة حرارة الغرفة.
  9. Decant حل تلوين الطعام الأحمر من عينة الجذر وإضافة ما يقرب من 100 مل من مياه الصنبور إلى حاوية عينة لإزالة وصمة عار الزائدة. ضع الغطاء على حاوية العينة واخزن العينة في ثلاجة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. انتقل إلى الخطوة 5 لتقييم عدوى الجذر.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا قبل المتابعة إلى الخطوة 5.

4- الانتشار النباتي لاستعادة النباتات لإنتاج البذور

  1. وضع كرة من القطن في الجزء السفلي من وعاء من البلاستيك مخروطي (انظر الخطوة 2.3) وملء جزئيا وعاء مع الجفت الطحلب potting وسائل الإعلام. ثم، وضع تبادل لاطلاق النار النباتية في وعاء وإضافة بحزم وسائل الإعلام potting لملء وعاء. وضع حصة بلاستيكية جديدة المسمى في كل وعاء لتعيين النمط الجيني القطن.
  2. ضع صينية الأواني في حاوية بلاستيكية (طول 73.6 سم × عرض 45.7 سم × ارتفاع 15.2 سم) مع الماء وسقي النباتات لفترة وجيزة لترطيب وسائل الإعلام بوتينج. وضع الأواني في غرفة النمو مع درجة حرارة ثابتة من 28 درجة مئوية باستخدام 16 ح photoperiod. إضافة المزيد من المياه إلى الحاوية البلاستيكية حسب الحاجة للحفاظ على رطوبة التربة.
  3. زرع النباتات إلى الأواني أكبر لإنتاج البذور بعد ما يقرب من 30 د. جزئيا ملء وعاء من البلاستيك 6 L مع وسائل الإعلام potting (انظر الخطوة 4.1)، وإزالة النبات من وعاء صغير، ووضع النبات في وعاء 6 L، وإضافة بحزم وسائل الإعلام potting لملء وعاء.
  4. وضع النباتات في منزل زجاجي وإضافة الماء لترطيب وسائل الإعلام potting. الحفاظ على درجة الحرارة في glasshouse في حوالي 28 درجة مئوية (الإضاءة الاصطناعية غير مطلوبة).
    1. محطات المياه باليد حسب الحاجة لمدة 30 د تقريبا.
    2. عندما ما يقرب من 75٪ من النباتات تتطلب سقي يوميا، ومحطات المياه يوميا باستخدام نظام سقي التلقائي. ضبط نظام سقي التلقائي للمياه أكثر تواترا حسب الحاجة لنمو النبات.
    3. أضف حوالي 10 غ من الأسمدة البطيئة الإطلاق إلى كل وعاء قبل بدء بدء الأزهار.
  5. حصاد النباتات عند النضج ومعالجة عينات بذور القطن للحصول على البذور لمزيد من التقييم.
    1. لحصاد بذور القطن، قم بإزالة القطن من البولات المفتوحة على النبات باليد ووضعها في كيس ورقي مسمى. يتم إرفاق البذور إلى ألياف القطن، والتي تتم إزالتها في الخطوات التالية.
    2. إزالة ألياف الوبر من عينات البذور باستخدام الجن مختبر 10 المنشار.
    3. إزالة ألياف زغب من عينات البذور باستخدام حمض الكبريتيك المركزة. تحييد عينات البذور في 15٪ (V / v) حل كربونات الصوديوم، شطف العينات مع مياه الصنبور، وتجفيف العينات في الهواء القسري جفافا.
    4. ضع عينات البذور في مغلفات مسماة للتخزين.

5- تقييم R. محمد محمد عدوى الجذر

  1. إزالة عينة الجذر من حاوية عينة وحساب عدد الديدان الخيطية الإناث تعلق على نظام الجذر باستخدام مجهر مجسم (20X التكبير).
    ملاحظة: فقط الديدان الخيطية الرنبيفورم الإناث قادرة على إصابة جذور النبات.
  2. ضع نظام الجذر على المناشف الورقية لمدة 10 دقائق تقريبًا لإزالة الرطوبة الزائدة. وزن نظام الجذر لتحديد الوزن الجذر الطازجة.
  3. أدخل عدد الديدان الخيطية وبيانات الوزن الجذر الطازجة في برنامج جدول بيانات الكمبيوتر وحساب عدد الإناث لكل غرام من الجذر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم عرض عدوى الروهيل reniformis من نظام الجذر لصنفين في الشكل 1. عدد أقل نسبيا من الديدان الخيطية الرننيفورم الإناث قادرة على إنشاء موقع تغذية للنمط الجيني القطن المقاوم بالمقارنة مع النمط الجيني عرضة. والتباين في نمو الجذور شائع بين حالات الانضمام، كما يتضح من الشكل 2. ويمكن أيضا ً ملاحظة هذا التباين مقيساً بوزنجذر جديد بين النباتات ذات النمط الجيني نفسه (الجدول 1). غالباً ما تظهر الأنماط الجينية لشجرة غوسيبيوم معدلات نمو أقل للجذور مقارنة بالأنماط الجينية للقطن المرتفعات. للتعويض عن هذا الاختلاف، يتم جمع البيانات على الأوزان الجذرية الطازجة، والتي تستخدم لحساب عدد الديدان الخيطية الرنبيفورم الإناث لكل أنسجة الجذر غرام لكل النمط الجيني. أعداد الديدان الخيطية الرنبيفورم الإناث لكل غرام من الجذر للأنماط الجينية المقاومة هي عموما أقل من 10، في حين أن الأنماط الجينية عرضة عادة ما يكون أكبر من 30 الديدان الخيطية لكل غرام من الجذر.

أحد التحديات لفحص الأنماط الجينية القطنية لR . المقاومة reniformis هو الاختلاف المحتمل ة التي يمكن أن تحدث داخل وبين التجارب. ولتقييم هذا الاختلاف والتكيف معه، تُدرج الأنماط الجينية القطنية المقاومة والقابلة للتأثر كضوابط وتنسخ في كل تجربة. ويعرض الجدول 1 بيانات عن نوعين جينيين يستخدمان كعناصر تحكم في تجربتين منفصلتين باستخدام البروتوكول الموصوف أعلاه. تم تكرار الأنماط الجينية 10 مرات وتلقيحها بعد 7 أيام من الزراعة مع 1000 الديدان الخيطية، ثم تم حصاد أنظمة الجذر بعد 28 يوما من التلقيح لحساب الديدان الخيطية تعلق على الجذور. ولأن التجارب أجريت في أوقات مختلفة، كان مصدر الديدان الخيطية المستخدمة في التطعيمات مختلفاً؛ خلاف ذلك، كانت جميع المعلمات الأخرى مماثلة. وتوضح هذه البيانات التباين الذي يمكن ملاحظته في تقييمات الديدان الخيطية الرنبيفورمية. وكانت أعداد الديدان الخيطية الأنثوية والأوزان الجذرية أعلى في التجربة 1 بالنسبة للضوابط اثنين مقارنة بالتجربة 2، مما أدى إلى ارتفاع أعداد الإناث لكل غرام من الجذر للتجربة 1. ونظرا لأن أعداد الإناث كانت أعلى بكثير بالنسبة للتجربة 1، فإن الزيادات في الأوزان الجذرية لم تخفض أعداد الإناث لكل غرام من الجذر إلى المستويات التي لوحظت للتجربة 2. ولوحظ أيضا تباين كبير بين النسخ المتماثل للأنماط الجينية الفردية. ومع ذلك، فإن Gمقاومة . arboreum النمط الجيني PI 615699 أظهرت في كثير من الأحيان انخفاض كبير في عدد الإناث وانخفاض أعداد الإناث لكل غرام من الجذر من Gعرضة . hirsutum النمط الجيني PI 529251. يمكن تصنيف الأنماط الجينية بسهولة على أنها مقاومة أو عرضة عند استخدام هذه الوسائل للمقارنة. وتصنف الأنماط الجينية على أنها مقاومة عندما تكون أعداد الإناث لكل غرام من الجذر حوالي 10٪ من السيطرة القابلة للتأثر.

وترد في الجدول 2مجموعة فرعية من البيانات من مجموعة سكان ية منفصلة من F2 تم تقييمها باستخدام البروتوكول . وشمل السكان 300 مصنع من محطات F 2، وقدمت بيانات عن 50 مصنعاً تمثل النطاق المختلفة. وبالنسبة للسكان البالغ عددهم 300 نبات، تراوح عدد الديدان الخيطية الملاحظة التي تصيب النظم الجذرية بين صفر و50، بمتوسط قدره 9.4. وتراوحت الأوزان الجذرية من 0.01 إلى 1.22 غرام، مع متوسط 0.38 غرام من الديدان الخيطية الأنثوية لكل غرام من الجذر تراوحت بين 0-400، مع متوسط 33.6. وقد تم تكرار الوالدين في التقييم. وأظهرت الأم المقاومة (PI 417895) متوسط 5.8 الإناث لكل غرام من الجذر، مع متوسط الوزن الجذر من 0.8 غرام. وعلى النقيض من ذلك، أظهر الوالد المعرض (PI 529729) متوسط 40.8 أنثى لكل غرام من الجذر، مع متوسط وزن جذر قدره 0.35 غرام. وعادة ما تتم إزالة كل من هذه النباتات والنباتات مع ضعف نمو الجذر من تحليل البيانات. ويلاحظ هذا النطاق في الاختلاف لنمو الجذر والعدوى الديدان الخيطية من النظم الجذرية عادة لتقييمات الديدان الخيطية; وبالتالي، فإن القدرة على فحص عدد كبير من النباتات في تجربة واحدة يمكن أن تقلل من هذا الاختلاف وتسمح لتقييم علم الوراثة بدقة من المقاومة. وأظهر السكان تباينا ً كمياً لعدوى الديدان الخيطية، وصنفت النباتات على أنها مقاومة استناداً إلى البيانات الواردة من الوالد المعرض للإصابة، مما يشير إلى أن المقاومة قد مُنحت من قبل جينين متنافيين لهذه الفئة من السكان. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم بروتوكول الانتشار الخضري الوارد وصفه أعلاه بنجاح لاستعادة النباتات من هذه التجمعات. وكثيراً ما يتوافق تصنيف ذرية F3 المستمدة من النباتات الفردية F2 مع تصنيف مصنع F2.

Figure 1
الشكل 1: عينات الجذر المصابة Rotylenchulus reniformis. تُظهر العينة الجذرية من النمط الجيني القطني المقاوم (أسفل اليسار) نيماتود أنثى واحدة متصلة بالجذر، في حين أن النمط الجيني القابل للتأثر (أعلى اليمين) يظهر إناثات متعددة متصلات بالجذر. يمثل الشريط الأسود مقياس ًا مقاس 0.1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 التغير الذي لوحظ في نمو الجذر لنوعين جينوتايين قطني. يتم عرض النظم الجذرية لاثنين من المنضمين مقاومة الديدان الخيطية reniform G.arboreum لتوضيح التباين الذي يمكن ملاحظته لنمو الجذر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Table 1
الجدول 1: التباين الذي لوحظ في الاستجابة لعدوى الديدان الخيطية الرنيفورمية لنوعين جينيين من القطن مدرجين كضوابط. توضح هذه البيانات التباين الذي يمكن أن يحدث داخل وبين التجارب للنمط الجيني G.hirsutum القابلة للتأثر PI 529251 ومقاومة G. أربوريوم النمط الجيني PI 615699; ومع ذلك، كانت وسائل البيانات مختلفة بشكل كبير، مما يسمح للأنماط الجينية أن تصنف بسهولة على أنها مقاومة أو عرضة.

تسمية النمط الجيني الاناث الجذر الوزن (ز) الإناث / ز الجذر تصنيف
88 صفر 0.67 0.0 مقاومه
156 صفر 0.10 0.0 مقاومه
75 2 1.05 1.9 مقاومه
298 2 0.58 3.4 مقاومه
259 3 0.77 3.9 مقاومه
208 1 0.21 4.8 مقاومه
322 4 0.82 4.9 مقاومه
189 2 0.35 5.7 مقاومه
147 6 0.94 6.4 مقاومه
267 2 0.18 11.1 مقاومة معتدلة
198 5 0.43 11.6 مقاومة معتدلة
251 2 0.17 11.8 مقاومة معتدلة
95 6 0.46 13.0 مقاومة معتدلة
248 3 0.23 13.0 مقاومة معتدلة
79 11 0.84 13.1 مقاومة معتدلة
340 4 0.29 13.8 مقاومة معتدلة
114 9 0.64 14.1 مقاومة معتدلة
168 6 0.40 15.0 مقاومة معتدلة
117 7 0.44 15.9 مقاومة معتدلة
77 10 سنوات 0.57 17.5 مقاومة معتدلة
277 9 0.44 20.5 مقاومة معتدلة
47 8 0.34 23.5 عرضة بشكل معتدل
96 20 0.85 23.5 عرضة بشكل معتدل
139 15 0.60 25.0 عرضة بشكل معتدل
253 2 0.08 25.0 عرضة بشكل معتدل
247 15 0.53 28.3 عرضة بشكل معتدل
308 8 0.28 28.6 عرضة بشكل معتدل
152 9 0.31 29.0 عرضة بشكل معتدل
123 8 0.26 30.8 عرضة بشكل معتدل
296 18 سنة 0.58 31.0 عرضة بشكل معتدل
138 10 سنوات 0.31 32.3 عرضة بشكل معتدل
151 5 0.15 33.3 عرضة بشكل معتدل
102 31 0.77 40.3 عرضة بشكل معتدل
67 5 0.12 41.7 سنة عرضه
51 18 سنة 0.43 41.9 سنة عرضه
311 21 0.48 43.8 عرضه
334 4 0.09 44.4 عرضه
266 33 0.74 44.6 عرضه
260 7 0.14 50.0 عرضه
49 16 سنة 0.32 50.0 عرضه
149 20 0.39 51.3 51 عرضه
104 22 0.34 64.7 عرضه
238 39 0.57 68.4 عرضه
144 24 0.33 72.7 عرضه
225 24 0.30 80.0 عرضه
87 38 0.43 88.4 عرضه
126 50 0.51 98.0 عرضه
272 3 0.03 100.0 عرضه
154 24 0.12 200.0 عرضه
286 3 0.01 300.0 عرضه

الجدول 2: استجابة عدوى الديدان الخيطية الرنيفورمة الملاحظة في مجموعة فرعية من 50 نمطاً جينياً من G. أربوريوم F2 السكان. وتوضح هذه البيانات نطاق التباين الذي يمكن ملاحظته لفصل السكان. يتم عرض الأوزان الجذرية، والتهم الديدان الخيطية، وعدد الإناث لكل غرام من الجذر لكل النمط الجيني، مع النباتات المصنفة على أنها مقاومة، مقاومة معتدلة، عرضة بشكل معتدل، أو عرضة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يلزم وضع بروتوكول فحص فعال من أجل 1) تحديد R. الرنيوموجينية القطنية المقاومة من أجل تقييم علم الوراثة من المقاومة و 2) تربية أصناف مقاومة. معظم البروتوكولات تقييم R. الكثافات السكانية الرنيوموميس أو معدلات التكاثر عن طريق استخراج الديدان الخيطية vermiformأو البيض من نظام جذر القطن أو التربة بوتينج 8،11،12،14،15 . وكثيرا ما تكون هذه النهج أكثر استهلاكا للوقت، وتميل النتائج إلى أن تكون أكثر تنوعا داخل التجارب وفيما بينها. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون الأنماط الجينية القطنية أكثر تكرارًا في تجارب البيوت الزجاجية غير المنسوخة نسخاً متماثلاً باستخدام هذه البروتوكولات11. ومع ذلك، يمكن تحقيق نتائج مماثلة لمختلف البروتوكولات أو المعلمات التي تم تقييمها9و13.

ويُعرض بروتوكول فرز بديل يجري فيه فحص الأنماط الجينية القطنية عن طريق تقييم عدد الديدان الخيطية الأنثوية التي تتطفل على النظام الجذري. قد تظهر الأنماط الجينية القطنية المقاومة والقابلة للتأثر في البداية عدداً مماثلاً من الديدان الخيطية الأنثوية التي تخترق أنظمة الجذر في غضون 16 ساعة بعد التلقيح، ولكن في غضون 36 ساعة، تبدأ الأنماط الجينية المقاومة في إظهار عدد أقل بكثير من الإناث الملتصقات ويعوق تنمية الديدان الخيطية والديدان الخيطية9. وهكذا، يوفر بروتوكول الفرز هذا مقياساً مباشراً أكثر للعدوى بالديدان الخيطية في نظام جذر القطن مقارنة بالبروتوكولات التي تعتمد على استخراج الديدان الخيطية أو البيض من نظام الجذر أو التربة القدورية. طريقة تلقيح شتلات القطن مع الديدان الخيطية vermiform مماثلة بين النهج. وعادة ما يتم إجراء التطعيمات بعد 7 إلى 14 يوما من الزراعة، ولكن توقيت التلقيح أقل أهمية، حيث يمكن أيضا زرع البذور مباشرة في التربة الموبوءة بالديدان الخيطية. يتم إجراء التطعيمات باستخدام 1000 الديدان الخيطية، ولكن يمكن تعديل البروتوكول لزيادة أو تقليل العدد المستخدم للتلقيح، أو يمكن إجراء اثنين من التطعيمات في 7 و 14 يوما بعد زرع لتأمين ما يكفي من الديدان الخيطية الإناث هي الحالية للعدوى الجذرية. في فول الصويا، لم يكن لعدد الديدان الخيطية المستخدمة للتلقيح أي تأثير كبير على تصنيفات كتلة البيض بعد 21 يوما من الزراعة. على الرغم من أن، لوحظت عادة أعلى التقييمات في الكثافة السكانية الديدان الخيطية أعلى22. يمكن تحسين البروتوكول لتحديد الحد الأدنى من كثافة الديدان الخيطية للتلقيح.

يتم تقييم عدوى الديدان الخيطية في الجهاز الجذري بعد 28 يوما من التلقيح لهذا البروتوكول، والذي هو عموما في وقت سابق مما كانت عليه في بروتوكولات أخرى. وهذه خطوة حاسمة في البروتوكول، حيث تجري التقييمات قبل فقس البيض. يمكن أن يؤدي التأخير الكبير في حصاد عينات الجذر إلى جولة ثانية من العدوى. غير أن هذا التقييم السابق يتميز بزيادة الإنتاجية. وبالنسبة للبروتوكول المعروض، تزرع الأنماط الجينية القطنية في خليط من الرمال والتربة، وهو أمر بالغ الأهمية لإزالة بسيطة وسريعة للنظام الجذري من الوعاء. استخدام نظام سقي التلقائي ضروري عند استخدام الأواني الصغيرة مع خليط من التربة والتربة من أجل منع الأواني من الجفاف. يتم استخدام تلوين الطعام الأحمر لوصمة عار الديدان الخيطية تعلق على نظام الجذر، وهو طريقة بسيطة وآمنة17. مرة واحدة يتم تلوين أنظمة الجذر، ويمكن تخزينها في مياه الصنبور في 4 درجة مئوية قبل عد عدد الديدان الخيطية تعلق على نظام الجذر. وبالتالي، يمكن تقييم عدد أكبر من الأنماط الجينية القطنية في تجربة واحدة، لأنه لا يلزم معالجة إضافية للعينات قبل تقييم عدد الديدان الخيطية. أيضا، فمن المفيد لتخزين عينات الجذر في مياه الصنبور لعدة أيام، مما يسمح الجذور لإزالة وصمة عار، مما يجعل العد أسهل.

ويسمح البروتوكول الموصوف بفحص أعداد أكبر من السكان من أجل الحد من التباين البيئي الذي سيحدث بين التجارب. باستخدام غرفة نمو النبات 900 م2 مجهزة نظام سقي التلقائي، يمكن تقييم السكان من 480 النباتات الفردية. وقد استخدم البروتوكول بنجاح لتقييم فصل السكان من 300 أو أكثر من الأفراد لتوصيف علم الوراثة للمقاومة10،18. وأظهرت هذه التجمعات السكانية أن التباين الكمي لعدوى الديدان الخيطية والمقاومة في G. قد يكون الشجرة في كثير من الأحيان المرتبطة الجينات المتنحية متعددة; وبالتالي، هناك حاجة إلى أعداد أكبر من السكان للدراسات الوراثية. وبالإضافة إلى ذلك، يلاحظ اختلاف كمي في الفصل بين السكان، بغض النظر عن البروتوكول المستخدم، لتقييم الاستجابة لعدوى الديدان الخيطية.

مقاومة النبات المضيف في القطن يمكن أن تعوق قدرة الديدان الخيطية على إصابة نظام الجذر وإنشاء موقع للتغذية، ولكنها قد تؤثر أيضا على القدرة الإنجابية للنيماتود. ويقيّم بروتوكول الفرز الموصوف عدد الديدان الخيطية القادرة على إنشاء موقع للتغذية على نظام جذور القطن. لم يتم تقييم استنساخ الديدان الخيطية كما تقاس بإنتاج البيض في هذا البروتوكول، وهو قيد مهم. ومع ذلك، يمكن تعديل البروتوكول لجمع هذا النوع من البيانات. وكبديل لذلك، يمكن استخدام منهجية أخرى لجمع هذه البيانات بعد تحديد الأنماط الجينية المقاومة، مما يقلل من الحاجة إلى فحص عدد كبير من الأفراد.

يمكن أن تكون البيانات المستمدة من تقييمات الديدان الخيطية للأنماط الجينية الفردية متغيرة داخل التجارب وفيما بينها، وهي مشكلة شائعة مع جميع بروتوكولات الفرز المستخدمة لتقييم R. مقاومة الرينيفورميس للأنماط الجينية القطنية. ومن شأن استخدام تصميم تجريبي مع تكرارات متعددة لفحص حالات الانضمام إلى الجراثيم أن يساعد في تقييم هذا الاختلاف لتحديد الأنماط الجينية المقاومة. بالإضافة إلى ذلك، بما في ذلك نفس الأنماط الجينية للتحكم المقاوم والقابل ة للتأثر بين التجارب مفيد في تقييم هذا التباين ومقارنة النتائج من تجارب متعددة. وتستخدم هذه الضوابط أيضا لرصد نجاح تلقيح الديدان الخيطية. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام وسائل البيانات من هذه الضوابط لتصنيف الأنماط الجينية على أنها مقاومة أو عرضة10،16. وتصنف الأنماط الجينية القطنية عادة على أنها مقاومة إذا أظهرت أقل من 10٪ من العدوى التي لوحظت على التحكم القابل للتأثر16،23. نمو الجذر هو عامل آخر يسهم في التباين لوحظ في البيانات باستخدام البروتوكول، لأن النباتات التي لديها جذر الصنبور مع جذور جانبية أقل توفر مواقع أقل للعدوى، مما قد يؤدي إلى عدد أقل من الديدان الخيطية لكل غرام من الجذر.

الصعوبة في تطوير أصناف جديدة من القطن في المرتفعات باستخدام أنواع القطن الأخرى كمصدر للجينات المقاومة تتطلب بروتوكول انتشار نباتي من أجل النهوض بخطوط التكاثر إلى الجيل القادم لمزيد من الاختيار أو إضافية تربيه. وقد تم وضع بروتوكول انتشار نباتي بسيط كما هو موضح لاستعادة النباتات بعد تقييم الديدان الخيطية. وقد استخدم البروتوكول بنجاح لاستعادة النباتات من أعداد كبيرة من السكان18. عادة، يتم استرداد نظام الجذر في غضون 30 يوما بعد زرع تبادل لاطلاق النار الخضري. معدلات البقاء على قيد الحياة في كثير من الأحيان أكبر من 95٪. يمكن أن تضيع النباتات التي تظهر ضعف النشاط عند نشر عدد كبير من النباتات. بشكل عام، فشل أقل من 1٪ من النباتات لإظهار الجذر أو تبادل لاطلاق النار النمو. يمكن تعديل البروتوكول بسهولة واستخدامه مع بروتوكولات فحص الديدان الخيطية الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد مولت هذا البحث وزارة الزراعة في الولايات المتحدة، دائرة البحوث الزراعية. ذكر الأسماء التجارية والمنتجات التجارية في هذه المقالة هي فقط لغرض تقديم معلومات محددة ولا تنطوي على توصيات أو تأييد من قبل وزارة الزراعة الأمريكية. وزارة الزراعة الأمريكية هي مزود تكافؤ الفرص وصاحب العمل. وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح ليعلنوا عنها. وقدمت كريستي جوردان المساعدة التقنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ray Leach Cone-tainer Stuewe and Sons Inc. SC10U
Cone-tainer tray Stuewe and Sons Inc. RL98
Sand various
Cotton balls various
Pylon 4 inch plant labels (4 in L x 5/8 in W) Pylon Platics L-4-W Any brand or vendor is acceptible.
4 oz. specimen containers Fisher Scientific 16-320-731 Any brand or vendor is acceptible.
Red food coloring McCormick & Co., Inc.
1 mL Pipet tips various
10 L container various Inexpensive buckets work well.
6 L pots Nursery Supplies Inc. Poly-Tainer-Can No2A Any brand or vendor is acceptible. Different size pots can be used
Potting media Sun Gro Horticulture Metro-Mix 360 Any brand or vendor is acceptible.
Fertilizer Everris NA Inc. Osmocote Plus Any brand or vendor is acceptible.
Plastic container (73.6 cm L x 45.7 cm W x 15.2 cm D) Rubbermaid 3O29  Any brand or vendor is acceptible.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heald, C. M., Robinson, A. F. Survey of current distribution of Rotylenchulus reniformis. in the United States. Journal of Nematology. 22 (4), 695-699 (1990).
  2. Koenning, S. R., Wrather, J. A., Kirkpatrick, T. L., Walker, N. R., Starr, J. L., Mueller, J. D. Plant-parasitic nematodes attacking cotton in the United States: old and emerging production challenges. Plant Disease. 88 (2), 100-113 (2004).
  3. Robinson, A. F. Reniform in U.S. cotton: when, where, why, and some remedies. Annual Review of Phytopathology. 45, 263-288 (2007).
  4. Robinson, A. F., Inserra, R. N., Caswell-Chen, E. P., Vovlas, N., Troccoli, A. Rotylenchulus species: identification, distribution, host ranges, and crop plant resistance. Nematropica. 27 (2), 127-180 (1997).
  5. Davis, R. F., Koenning, S. R., Kemerait, R. C., Cummings, T. D., Hurley, W. D. Rotylenchulus reniformis management in cotton with crop rotation. Journal of Nematology. 35 (1), 58-64 (2003).
  6. Starr, J. L., Koenning, S. R., Kirkpatrick, T. L., Robinson, A. F., Roberts, P. A., Nichols, R. L. The future of nematode management in cotton. Journal of Nematology. 39 (4), 283-294 (2007).
  7. Weaver, D. B., Lawrence, K. S., van Santen, E. Reniform nematode resistance in upland cotton germplasm. Crop Science. 47 (1), 19-24 (2007).
  8. Robinson, A. F., Cook, C. G., Percival, A. E. Resistance to Rotylenchulus reniformis and Meloidogyne incognita race 3 in the major cotton cultivars planted since 1950. Crop Science. 39 (3), 850-858 (1999).
  9. Carter, W. W. Resistance and resistant reaction of Gossypium arboreum to the reniform nematode, Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 13 (3), 368-374 (1981).
  10. Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetics of reniform nematode resistance in Gossypium arboreum germplasm line PI 529728. World Journal of Agricultural Research. 1 (4), 48-53 (2013).
  11. Robinson, A. F., Bridges, A. C., Percival, A. E. New sources of resistance to the reniform (Rotylenchulus reniformis) and root-knot (Meloidogyne incognita) nematode in upland (Gossypium hirsutum L.) and sea island (G. barbadense L.) cotton. Journal of Cotton Science. 8 (3), 191-197 (2004).
  12. Robinson, A. F., Percival, A. E. Resistance to Meloidogyne incognita race 3 and Rotylenchulus reniformis in wild accessions of Gossypium hirsutum and G. barbadense from Mexico. Journal of Nematology. 29 (4), 746-755 (1997).
  13. Stetina, S. R., Young, L. D. Comparisons of female and egg assays to identify Rotylenchulus reniformis resistance in cotton. Journal of Nematology. 38 (3), 326-332 (2006).
  14. Usery, S. R. Jr, Lawrence, K. S., Lawrence, G. W., Burmester, C. H. Evaluation of cotton cultivars for resistance and tolerance to Rotylenchulus reniformis. Nematropica. 35 (2), 121-133 (2005).
  15. Yik, C. -P., Birchfield, W. Resistant germplasm in Gossypium species and related plants to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 16 (2), 146-153 (1984).
  16. Stetina, S. R., Erpelding, J. E. Gossypium arboreum accessions resistant to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 48 (4), 223-230 (2016).
  17. Thies, J. A., Merrill, S. B., Corley, E. L. Red food coloring stain: new, safer procedures for staining nematodes in roots and egg masses on root surfaces. Journal of Nematology. 34 (2), 179-181 (2002).
  18. Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetic characterization of reniform nematode resistance for Gossypium arboreum accession PI 417895. Plant Breeding. 137 (1), 81-88 (2018).
  19. Byrd, D. W. Jr, et al. Two semi-automatic elutriators for extracting nematodes and certain fungi from soil. Journal of Nematology. 8 (3), 206-212 (1976).
  20. Jenkins, W. R. A rapid centrifugal-flotation technique for separating nematodes from soil. Plant Disease Reporter. 48 (9), 692 (1964).
  21. Robinson, A. F., Heald, C. M. Carbon dioxide and temperature gradients in Baermann funnel extraction of Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 23 (1), 28-38 (1991).
  22. Williams, C., Gilman, D. F., Fontenot, D. S., Birchfield, W. A rapid technique for screening soybeans for reniform nematode resistance. Plant Disease Reporter. 63 (10), 827-829 (1979).
  23. Schmitt, D. P., Shannon, G. Differentiating soybean responses to Heterodera glycines races. Crop Science. 32 (1), 275-277 (1992).

Tags

علم الوراثة العدد 147 القطن الجرثومية شجرة غوسيبيوم,مقاومة النبات المضيف فحص الديدان الخيطية الديدان الخيطية تربية المقاومة Rotylenchulus reniformis الانتشار الخضري
فحص الأنماط الجينية القطنية لمقاومة النيماتود الرينيفورم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Erpelding, J. E., Stetina, S. R.… More

Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance. J. Vis. Exp. (147), e58577, doi:10.3791/58577 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter