Summary
Här beskriver vi en metod för att bedöma lung uttryck av MicroRNA som förutspås för att reglera inflammatoriska gener med möss utsätts för ozon eller filtrerad luft i olika skeden av östruscykel.
Abstract
MikroRNA (miRNA) profilering har blivit intressant för forskare som arbetar inom olika forskningsområden av biologi och medicin. Aktuella studier visar en lovande framtid använda MicroRNA för diagnos och vård av lungsjukdomar. Här definierar vi ett protokoll för miRNA profilering för att mäta det relativa överflödet av en grupp av MicroRNA förutspådde för att reglera inflammatoriska gener i lungvävnad från av en ozon-inducerad luftvägarna inflammation musmodell. Eftersom det har visats att cirkulerande könshormon nivåer kan påverka regleringen av lung medfödd immunitet hos honor, är syftet med denna metod att beskriva en inflammatorisk miRNA profilering protokollet hos honmöss, med hänsyn till östruscykel skede av varje djur vid tidpunkten för ozonexponering. Vi också ta tillämplig bioinformatik förhållningssätt till miRNA upptäckten och målet identifieringsmetoder använder limma, en R/Bioconductor programvara, och funktionell analysprogramvara att förstå biologiska sammanhang och vägar i samband med differentiell miRNA uttryck.
Introduction
mikroRNA (Mirna) är kort (19 till 25 nukleotider), naturligt förekommande, icke-kodande RNA-molekyler. Sekvenser av MicroRNA är evolutionärt bevarade mellan arter, tyder på vikten av MicroRNA reglera fysiologiska funktioner1. mikroRNA uttryck profilering har visat sig vara till hjälp för att identifiera MicroRNA som är viktiga i regleringen av olika processer, inklusive immunförsvaret, celldifferentiering, utvecklingsprocesser och apoptos2. Mer nyligen, MicroRNA erkänts för deras potentiella användning i sjukdom diagnostik och therapeutics. För forskare som studerar mekanismer för genreglering, kan mäta miRNA uttryck upplysa system-nivå modeller av tillsynsprocesser, särskilt när miRNA information kopplas till mRNA profilering och andra genomet-skala data3. Däremot, MicroRNA har också visat sig vara stabilare än mRNA i en rad olika provtyper och är också mätbara med större känslighet än proteiner4. Detta har lett till betydande intresse i utvecklingen av MicroRNA som biomarkörer för olika molekylär diagnostik program, inklusive lungsjukdomar.
I lungan spelar MicroRNA viktiga roller i utvecklingsprocesser och underhåll av homeostas. Dessutom har deras avvikande uttryck associerats med utveckling och progression av olika lungsjukdomar5. Inflammatorisk lungsjukdom som orsakas av luftföroreningar har visat större stränghet och sämre prognos hos kvinnor, vilket indikerar att hormoner och östruscykel kan reglera lung medfödd immunitet och miRNA uttryck i reaktioner på olika miljöutmaningar 6. i detta protokoll, vi använder ozonexponering, som är en viktig del av luftföroreningar, för att framkalla en form av lunginflammation hos honmöss som uppstår i avsaknad av adaptiv immunitet. Med hjälp av ozon, vi förmå utvecklingen av hyperreaktivitet i luftvägarna som är associerad med luftvägarna epitelial cellskador och en ökning av neutrofiler och inflammatoriska mediatorer i proximala airways7. För närvarande finns det inte väl beskrivna protokoll att karakterisera och analysera MicroRNA över östruscykel i ozon-exponerade möss.
Nedan beskriver vi en enkel metod för att identifiera östruscykel stadier och miRNA uttryck i lungvävnad av kvinnliga möss som utsätts för ozon. Vi också ta effektiv bioinformatik metoder miRNA upptäckten och target identifiering, med betoning på beräkningsbiologi. Vi analyserar microarray data med hjälp av limma, en R/Bioconductor-programvara som erbjuder en integrerad lösning för att analysera data från gen uttryck experiment8. Analys av PCR-array data från limma har en fördel när det gäller makt över t-test baserat tillvägagångssätt när du använder litet antal matriser/prover för att jämföra uttryck. För att förstå biologiska samband med miRNA uttryck resultat, använde vi sedan programvaran funktionell analys. För att förstå de mekanismer som reglerar transkriptionell förändringar och att förutsäga sannolika utfall, kombinerar programvaran miRNA-uttryck datamängder och kunskap från litteraturen9. Detta är en fördel jämfört med programvara som titta bara för statistiska berikning i överlappande uppsättningar av microRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Penn State University.
1. bedömning av östruscykel scenen
- Korrekt hindra en kvinna C57BL/6 mus (8 – 9 veckor gamla) använder en hand mus återhållsamhet tekniken som beskrivs i Machholz et al.10.
- Fyll sterila plast pipetten med 10 μL av ultrarent vatten.
- Införa spetsen av plast pipett i slidan.
- Försiktigt spola vätskan 4 – 5 gånger att samla in provet.
- Placera den slutliga flush som innehåller vaginalsekret på en glasskiva.
- Observera den ofärgade vaginal spola under ett ljusmikroskop med ett 20 x mål.
Obs: Djur som inte visar regelbundna cykler på grund av pseudograviditet eller andra orsaker måste uteslutas från experimentet. Det rekommenderas att utföra dagliga slidsekret för minst tre på varandra följande cykler att bekräfta cyclicity.
2. exponering för ozon
- Placera upp till 4 möss i två 1,2 L glasbehållare med wire mesh lock, och vatten ad lib.
- Sätta en glasbehållare i ozon kammaren och den andra i den filtrerade luften exponeringskammare.
- Justera ozonkoncentrationen till 2 ppm och övervaka ozonnivåerna regelbundet.
Obs: Ozon apparaten levererar en reglerad luftflöde (> 30 luft förändringar/h) med kontrollerad temperatur (25 ° C) och relativ luftfuktighet (50%). Systemet genererar ozon av en elektrisk urladdning ozongeneratorn, som övervakas och styrs av en ultraviolett ozon analyzer och massflödet styrenheter, som tidigare beskrivits11. - Ta bort glasbehållare efter 3 h ozon/filtrerad luft exponering. Returnera djur till bur med sängkläder, mat och vatten ad lib.
3. lung samling
- 4 h efter exponering, söva djur med en intraperitoneal injektion av en ketamin/xylazin cocktail (90 mg/kg ketamin, 10 mg/kg xylazin).
Obs: För att bekräfta en korrekt nivå av anestesi, kontrollera musen för en pedal reflex (fast tå nypa) och justera bedövningsmedlet som behövs. - Fukta mus huden med 70% etanol.
- Gör en 2 cm mittlinjen snitt med en fungerande sax och kirurgisk pincett för att exponera vena cava.
- Offra möss av transection av vena cava och aorta. Om det behövs, infoga en 21 G gauge nål i vena cava ovan nedsatt venerna att samla in blod före exsanguination. Alternativt, samla blod via hjärtat punktering efter standardprotokoll.
- Använd en kirurgisk sax att skära öppna bukhålan och tar bort hud övre muskel, rör sig uppåt mot revbenen.
- Använd en kirurgisk sax punktera membranet.
Obs: Lungorna kommer kollapsa från membranet. - Skär bort bröstkorgen med en kirurgisk sax för att exponera hjärta och lungor.
- Använda pincett, ta en 1,5 mL RNase-fri mikrocentrifug rör och dränka det i flytande kväve att fylla röret.
Obs: Använd skyddsglasögon och skyddshandskar för att hantera flytande kväve. - Ta bort lungorna, placera dem i de RNase-fri 1,5 mL mikrocentrifugrör fylld med flytande kväve till snapin-frysa vävnaden och vänta några sekunder tills vätskan avdunstar.
- Stäng tube locket och förvara vävnaden vid-80 ° C fram till användning.
4. RNA förberedelse
- Pulverisera hela lungorna med hjälp av ett rostfritt stål vävnad pulverizer.
Obs: Den vävnad pulverizer måste placeras i flytande kväve före användning. Ren pulverizer efter varje användning med RNAse lösning. - Dela pulvriserat lungorna och placera i två 1,5 mL rör (halv lung varje).
- Tillsätt 500 µL av guanidinium kaliumtiocyanat per prov rör och blanda. Homogenisera varje prov med 18 G, 21 G och 23 G nålar, respektive.
Obs: Prover kan vara spetsad med 5,6 x 108 exemplar av en liten RNA spike-i kontroll (från en annan art) innan du fortsätter med utvinning. - Tillsätt 500 µL etanol i varje prov och virvel för 15 s.
- Ladda blandningen i en spin kolumn i en samling tub och centrifugera vid 12 000 x g i 1 min. Kassera genomflöde.
-
För DNAS jag behandling (i-kolumn).
- Tillsätt 400 µL av RNA Wash Buffer och centrifugera vid 12 000 x g i 1 min.
- I ett RNase-Gratis tube, tillsätt 5 µL av DNAS jag och 75 µL av 1 x DNA matsmältningen buffert och blanda. Lägga till mixen direkt i kolumnen matrisen.
- Odla i rumstemperatur i 15 min.
- Tillsätt 400 µL av RNA förtvätt lösning till kolumn och centrifugera vid 12 000 x g i 1 min. Kassera genomströmmande och upprepa detta.
- Lägga till 700 µL av RNA tvättlösning i kolumnen och centrifugera vid 12 000 x g i 1 min. Kassera genomflöde.
- Centrifugera vid 12 000 x g i 2 min att ta bort kvarvarande buffert. Över kolumnen till ett RNase-Gratis tube.
- För att eluera RNA, tillsätt 35 µL av DNAS/RNase-gratis vatten direkt till Kolonnmatris och centrifugera vid 12 000 x g under 1,5 minuter.
- Mäta total RNA-koncentrationen (260 nm) och renhet med en spektrofotometer. Följ instruktionerna för att utföra RNA kvantifiering i ett 1,5 µL prov alikvotens. Tomma instrumentet med DNAS/RNase-fritt vatten som används för eluering.
Obs: 260/280 förhållandet ~2.0 är allmänt accepterat som ”rena” för RNA. Typiska RNA-koncentrationen varierar vanligtvis mellan 750 och 2 500 ng/µL. - Förvaras vid-80 ° C.
5. miRNA profilering
-
Att retro-transkribera små RNAs, Använd 200 ng av total-RNA.
- Förbereda den omvända-transkription reaktionsblandning på is (total volym per reaktion är 20 µL). För varje reaktion, tillsätt 4 µL av 5 x buffert, 2 µL 10 x nukleotider blanda, 2 µL av omvänt transkriptas och 2 µL RNase-gratis vatten. Blanda alla komponenter och delprov i 600 µL RNAse-fri plaströr (10 µL av mix per reaktion).
Obs: Omvänd-Transkription huvudmixen innehåller alla komponenter som krävs för första-strand cDNA syntes utom mall RNA.
Obs: Beräkna överskottet (10%) när du förbereder huvudmixen. - Lägga till mallen RNA (200 ng i 10 µL) till varje tub som innehåller omvänd-Transkription huvudmixen. Mix, centrifug för 15 s vid 1 000 x g, och lagra dem på is tills att placera i termocyklern eller torra block.
- Inkubera under 60 minuter vid 37 ° C.
- Inkubera i 5 min vid 95 ° C och placera rören på is.
- Späd cDNA genom att tillsätta 200 µL RNase-fritt vatten till varje 20 µL omvänd-Transkription reaktion.
- Förbereda den omvända-transkription reaktionsblandning på is (total volym per reaktion är 20 µL). För varje reaktion, tillsätt 4 µL av 5 x buffert, 2 µL 10 x nukleotider blanda, 2 µL av omvänt transkriptas och 2 µL RNase-gratis vatten. Blanda alla komponenter och delprov i 600 µL RNAse-fri plaströr (10 µL av mix per reaktion).
-
Utföra realtids-PCR med mus inflammatorisk reaktion och autoimmunitet miRNA PCR-Array.
- Förbereda en reaktionsblandning (total volym 1100 µL): för varje reaktion, lägga till 550 µL av 2 x PCR master mix, 110 µL 10 x universal primer mix, 340 µL RNase-gratis vatten och 340 µL av mallen cDNA (utspädda reaktion från steg 5.1.5).
- Tillsätt 10 µL av reaktionsblandning till varje brunn den förinstallerade miRNA PCR matris med hjälp av en multikanalpipett.
- Försegla miRNA PCR Array tallrik med optisk självhäftande film.
- Centrifugera plattan för 1 min vid 1 000 x g vid rumstemperatur för att ta bort bubblor.
- Programmera den realtid apparat, PCR första aktiveringen steg för 15 min vid 95 ° C, 3-steg cykling innehållande denaturering för 15 s vid 94 ° C, glödgning för 30 s vid 55 ° C, och förlängning för 30 s vid 70 ° C för 40 cykler nummer.
Obs: Följ tillverkarens cykling villkorar instruktioner för att ställa in den i realtid apparat. Utför dissociation kurva steg inbyggd i realtid apparat programvaran. - Utföra dataanalyser.
6. dataanalys
- Extrahera Ct-värden från realtid PCR programvaran för varje prov till ett analysprogram.
Obs: En Ct-värde 34 anses cutoff. Om prover som innehåller spike-i kontroll (t.ex., cel-mir-39), normalisera Ct-värden till markanta kontroll för varje prov. Tröskelvärden kan behöva ställas in manuellt. Utgångsvärden ställs in automatiskt. - Normalisera Ct-värden till genomsnittliga Ct av sex miRNA städning kontroller: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, med hjälp av följande ekvation:
ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping) - För vik ändra beräkningar, beräkna ΔΔCt värden använder ett specifikt prov som kontroll, använda relativa uttryck ekvation12:
miRNA relativa uttryck:
2-∆∆Ct, där - ∆∆Ct =-[∆Ct test - ∆Ct kontroll]
Obs: En faldig förändring av 200 anses cutoff. - Exportera vik ändra uttryckets värden ska utföra statistisk analys på R med limma paketet i Bioconductor8.
- Korrigera för multipla jämförelser med de Benjamini-Hochberg metod13.
Obs: En kopia av skriptet R finns på: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Datamängder och analyserade data finns också på den Gene Expression Omnibus under nummer GSE111667, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.
7. dataanalys: Funktionell analys programvara
- Ordna datamängden. Omfatta MicroRNA med deras respektive uttryck log nyckeltal och p-värden. Se tabell 1 för specifika datamängd formatering.
- Öppna funktionell analys programvara (version 01-10).
- Ladda upp datamängden i följande format: filformat: ”flexibla Format”, innehåller kolumnrubrik: ”Ja”, Välj identifierare typ: ”miRBase (mogna)”, Array-plattform som används för experiment: välja array plattform.
Obs: Accepterade format är .txt (tabbavgränsad textfiler), .xls (excel-filer), och .diff (cuffdiff filer). - Välj ”härleda observationer” och kontrollera att den experimentella gruppen märkning är korrekt.
- Gå till ”datamängd Sammanfattning” att revidera den totala mängden mappade och omappade microRNA.
-
Klicka på knappen ”Ny” längst upp till vänster i programmet. Välj ”nytt mikroRNA målet Filter” och ladda upp en mikroRNA datamängd.
- Ange källa till: TarBase, påhittighet experter fynd, miRecords.
- Inställt förtroende: experimentellt observerade eller hög (förutspått).
- Välj ”Lägg till kolumner” att inkludera en mängd biologisk information om mål såsom arter, sjukdomar, vävnader, vägar och mer.
- För att fokusera på mål som har ändrat uttryck i experimentet, Välj ”Lägg till / Ersätt mRNA datamängd”. Använd ”uttryck Pairing” för att hitta mikroRNA med samma eller olika uttryck nivåer.
Obs: Filtrera analysen ger mikroRNA namn och symboler, mRNA mål, den källa som beskriver målet förhållandet och konfidensnivån för förutspådde förhållandet (figur 2).
- Klicka på ”Lägg till min väg” för att skicka filtrerad datamängden till en väg canvas och utforska fler biologiska relationer.
- Använd sökvägen Designer för att skapa en publikation-kvalitet modell av mikroRNA effekter.
-
En alternativ möjlighet är att skapa en grundläggande analys.
- För core analystyp, Välj ”uttryck analys”.
- Välj ”Expr Log Ratio” mätning.
- Analys Filter Sammanfattning: överväga endast molekyler eller relationer där: (arter = mus) och (förtroende = experimentellt observerade) och (datakällor = ”påhittighet Expert bedömning”, ”påhittighet ExpertAssist resultat”, ”miRecords”, ”TarBase”, eller ” TargetScan Human ”).
- Välj en cutoff av p-värde = 0,05.
- Köra analysen.
Obs: Rapporten kommer att innehålla: kanoniska stigar, uppströms regulatorer analys, sjukdomar och funktioner, regulator effekter, nätverk, molekyler och mer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De olika celltyper som observerats i utstryk används för att identifiera musen östruscykel scenen (figur 1). Dessa identifieras av cellmorfologi. Under Proöstrus är cellerna nästan uteslutande kluster av runda, välformade kärnförsedda epitelceller (figur 1A). När musen är i brunst scenen, är cellerna cornified skivepitelcancer epitelceller, närvarande i tätt packade kluster (figur 1B). Under metestrus, cornified epitelceller och polymorfonukleära leukocyter ses (figur 1 c). I diöstrus är leukocyter (små celler) generellt vanligare (figur 1 d).
Extraherades RNA från fyra mus lungorna efter det protokoll som tidigare beskrivits. Nukleinsyra koncentrationerna (ng / µL) varierade mellan 1197.9 och 2178.1 med ett genomsnitt på 1583.1 ± 215 (tabell 1). Genomsnittligt A260/A280 baserat varierat från 2,010 till 2.020 med ett genomsnitt på 2.016 ± 0,002. Däremot, de observerade A260/A230 nyckeltal pendlade mellan 2.139 och 2.223 med ett genomsnitt på 2.179 ± 0,018.
Tabell 2 visar differentiell uttryck resultat som erhållits med limma på R. Vi beräknade övre Differentiellt uttryckta MicroRNA mellan möss utsätts för ozon eller filtreras luften i Proöstrus (med hjälp av kommandot toptable)14. Den första kolumnen innehåller värdet av log2-fold fold förändringen i miRNA uttryck mellan ozon och filtrerad luft exponerade djur. Den kolumn t representerar måttlig t-statistiken beräknas för varje miRNA i jämförelsen. De kolumnerna p.value och adj.p.value representerar associerade p-värden för varje jämförelse före och efter flera tester justering, respektive. Justering för multipla jämförelser gjordes med den Benjamini och Hochbergs metod att styra de falska upptäckt hastighet15. Kolumn B representerar log-oddsen att miRNA är differentially uttryckt8.
Vi genomförde miRNA målet filter och core analysen som innehåller anrikning väg analys. Efter uppladdning en förteckning över 14 miRNAswith betydande uttryck log förhållandet och p-värde, karterades alla av dem av miRNA mål filtret (tabell 3). Resultaten var filtreras och sorteras för att komma till vissa vägar, i detta fall ”cellulära immunsvaret”. Den grundläggande analysen lämnat information om kanoniska vägar, sjukdomar och funktion, tillsynsmyndigheter och nätverk (tabell 4). Funktionell analys programvaran producerade en nätverksanalys som visar förhållandet mellan MicroRNA sevärdheter och andra molekyler (figur 3).
Figur 1: identifiering av östruscykel stadier. (A) Proöstrus (huvudsakligen kärnförsedda epitelceller); (B) brunst (huvudsakligen kärnfria cornified celler); (C) metestrus (alla tre typer av celler); och (D) diöstrus 2 (majoritet av leukocyter). Skalstapeln = 100 µm. förstoring = 20 x. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: funktionell analys programvara representativa resultat: miRNA målet filter. Omfattande profil av MicroRNA i olika skeden av östruscykel. Efter utför miRNA filter, levererar programvaran detaljerade listor över gener och föreningar inblandad i sjukdomar och andra fenotyper, som kan filtrera och sortera att komma till vissa vägar, i detta fall ”cellulära immunsvaret”. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: funktionell analys programvara representativa resultat: nätverk. Jämförelse av nätverk påverkas av filtrerad luft eller ozon exponering hos kvinnor i olika skeden av östruscykel. Diagram över biologiska nätverk är associerad med MicroRNA i lungorna av kvinnliga möss som utsätts för filtrerad luft vs ozon i Proöstrus (A) eller icke-Proöstrus stadier (B). Denna siffra har ändrats från Fuentes et al.6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| ID | Nukleinsyra (ng/µL) | A260/A280 | A260/A230 |
| Prov 1 | 1197.930 | 2,015 | 2.192 |
| Prov 2 | 1355.703 | 2.018 | 2.223 |
| Prov 3 | 2178.104 | 2.020 | 2.163 |
| Prov 4 | 1600.837 | 2,010 | 2.139 |
| Genomsnitt | 1583.144 ± 215 | 2.016 ± 0,002 | 2.179 ± 0,018 |
Tabell 1: exempel på RNA koncentrationer och absorbansen nyckeltal på 260, 230 och 280 nm från renat lung vävnadsprover från fyra möss. Koncentrationer mättes med en spektrofotometer.
| logFC | t | P.Value | adj. P.Val | B | |
| MMU-miR-694 | 1.492 | 4.071 | 0.000153 | 0.009514 | 0.759 |
| MMU-miR-9-5 p | 0,836 | 3.916 | 0.000254 | 0.009514 | 0.289 |
| MMU-miR-221-3 p | 0.385 | 3.106 | 0.003014 | 0.075361 | -1.982 |
| MMU-miR - 181d - 5p | 0.597 | 2.891 | 0.005516 | 0.103424 | -2.526 |
| MMU-miR-98-5 p | 0.558 | 2.699 | 0.009243 | 0.138649 | -2.987 |
| MMU-miR-712-5 p | 0.667 | 2.563 | 0.013169 | 0.164609 | -3.299 |
| MMU-miR-106a - 5p | -0.528 | -2.412 | 0.019278 | 0.206547 | -3.632 |
Tabell 2: Limma analys resultat för differentiellt uttryckta MicroRNA hos kvinnor som utsätts för ozon vs . filtrerad luft i Proöstrus scenen.
| MicroRNA ID | Observation 1 | Observation 1 | Observation 2 | Observation 2 |
| Baserat på expr Log | P-värde | Baserat på expr Log | P-värde | |
| MMU-miR-694 | 1.492 | 0.000153 | 0.543319208 | 0.0021385 |
| MMU-miR-9-5 p | 0,836 | 0.000254 | 0.677595421 | 0.004997439 |
| MMU-miR-221-3 p | 0.385 | 0.003014 | ||
| MMU-miR - 181d - 5p | 0.597 | 0.005516 | 0.342276659 | 0.106467657 |
| MMU-miR-98-5 p | 0.558 | 0.009243 | 0.455392799 | 0.034724699 |
| MMU-miR-712-5 p | 0.667 | 0.013169 | ||
| MMU-miR-106a - 5p | -0.528 | 0.019278 |
Tabell 3: Exempelformat för flera observation uppladdning av datamängder till funktionell analysprogramvara. Flera experimentella differentiell uttryck kan grupperas i ett kalkylark och överföras, och lika många observationer som behövs kan läggas. Kolumner: 1) MicroRNA ID; (2) observation 1: Expr Log förhållande; (3) observation 1: P värde; 4) observation 2: Baserat Expr Log; (5) observation 2: P-värde.
| Icke-Proöstrus | Proöstrus | ||||
| A. gener riktade av differentially uttryckt MicroRNA | |||||
| CAMK2N1 | PAFAH1B2 | SEC23A | ABCB9 | FGD4 | SLC25A27 |
| BILAR | PDE4B | SNX5 | APOO | FRMD4B | SLC38A1 |
| CYP24A1 | PDE7A | SYT4 | ARHGEF38 | GPR137B | TMCC1 |
| DBF4 | PGM3 | THAP12 | AVEN | HMBS | TRIM71 |
| HMGN2 | PNP | TMED7 | CASP3 | METAP1 | XKR8 |
| KMT5A | REV1 | TNFAIP2 | CCNJ | MITF | ZCCHC11 |
| LRRC17 | RPS19BP1 | TNFRSF10C | CMTR2 | MYC | ZIM3 |
| MDH2 | RRAD | TP53 | CNMD | RGMB | ZNF181 |
| MIS18A | SEC62 | UBE2V2 | DSCR8 | SLC14A1 | |
| ZNF420 | |||||
| B. skillnader i top sjukdomar och biofunctions | |||||
| Sjukdomar och störningar | P -värde | Sjukdomar och störningar | P -värde | ||
| Inflammatorisk sjukdom | 3.84E-02 - 3.84E-05 | Organismers skador och avvikelser | 4.96E-02 - 2.77E-14 | ||
| Inflammatorisk respons | 3.84E-02 - 3.84E-05 | Reproduktiva systemet sjukdom | 2.15E-02 - 2.77E-14 | ||
| Organismers skador och avvikelser | 4.17E-02 - 4.17E-05 | Cancer | 4.96E-02 - 1.27E-10 | ||
| C. topp molekylära och cellulära funktioner | |||||
| Molekylära och cellulära funktioner | P Värde | Molekylära och cellulära funktioner | P Värde | ||
| Cellulära utveckling | 2.05E-02 - 5.26E-07 | Cellulära rörelse | 3.77E-02 - 4.47E-07 | ||
| Cellulära kompromiss | 3.75E-04 - 3.75E-04 | Cellulära död och överlevnad | 4.91E-02 - 5.61E-06 | ||
| Cellcykeln | 2.62E-03 - 2.62E-03 | Cellulära utveckling | 4.97E-02 - 1.38E-06 | ||
| D. topp fysiologiska systemutveckling och funktion | |||||
| Utveckling och funktion | P Värde | Utveckling och funktion | P Värde | ||
| Organismers utveckling | 4.17E-02 - 1.31E-03 | Embryonal utveckling | 3.30E-02 - 2.12E-05 | ||
| Embryonal utveckling | 1.29E-02 - 1.29E-02 | Bindväv utveckling och funktion | 1.79E-02 - 6.10E-05 | ||
| Bindväv utveckling och funktion | 1.93E-02 - 1.93E-02 | Vävnaden morfologi | 7.88E-05 - 7.88E-05 | ||
| E. Top associerade nätverksfunktioner | |||||
| Associerade nätverksfunktioner | Poäng | Associerade nätverksfunktioner | Poäng | ||
| Cellulära utveckling, inflammatorisk sjukdom, inflammatorisk reaktion | Organismers skador och avvikelser, reproduktiva systemet sjukdom, cancer | ||||
| 6 | 19 | ||||
Tabell 4: funktionell analysprogramvara Sammanfattning av kvinnor som utsätts för ozon i den icke-Proöstrus vs. Proöstrus stadier. Funktionell analys programvaran tillåter analys av topp kanoniska stigar, uppströms regulatorer, sjukdomar & funktioner, top funktioner, regulator effekt nätverk och mer. Den här tabellen har ändrats från Fuentes et al.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MikroRNA profilering är en fördelaktig teknik för både sjukdomsdiagnos och mekanistiska forskning. I detta manuskript definierat vi ett protokoll för att utvärdera uttrycket av MicroRNA som förutspås reglerar inflammatoriska gener i lungorna av kvinnliga möss som utsätts för ozon i olika östruscykel stadier. Metoder för bestämning av östruscykel, såsom visuell identifieringsmetoden, har varit beskrivs16. Dock dessa förlitar sig på enstaka mätningar och därför är opålitliga. För att korrekt identifiera alla östruscykel stadier hos honor som cykla regelbundet, rekommenderas den metod som beskrivs här. Dessutom kan detta enkla protokoll även användas för indirekt uppskattning dagliga hormonella fluktuationer i möss. För att undvika aktivering av oönskade inflammatoriskt svar på grund av vaginal irritation, provtagning behöver utföras en gång dagligen. På grund av variationer i cykellängden och bostäder influenser, är det viktigt att utföra protokollet för två till tre kompletta cykler innan du använder djur i ett experiment med tanke på cykel scenen.
För framgångsrika utvinning av RNA från lungvävnad är ett korrekt förfarande kritisk. Det här protokollet beskriver en endags-metod för att isolera RNA från lungvävnaden som ger hög kvalitet RNA. Ändringar av tillverkarens protokollet var tvungna att effektivt extrahera RNA från lungorna. Vi lagt till en ytterligare centrifugeringssteget efter tillsats av tvättbuffert ta bort så mycket buffert som möjligt. Vi elueras också RNA med 35 µL av DNAS/RNase-gratis vatten, centrifugering kolumnen för 1,5 min att säkerställa höga koncentrationsnivåer. Spectrofluorometer resultat bekräftade effektiviteten i vårt RNA extraktion protokoll. Förhållandet mellan absorbansen vid 260 och 280 nm (A260/280 ratio) används ofta för att bedöma renheten av RNA preparat. Maximal absorbans för nucleic syror är 260 och 280 nm, respektive. Det accepteras som ”rena” för RNA om förhållandet är ca 2,017. Likaså för A260/A230 kontaminering absorbansen förhållandet är värdena för renhet i intervallet 2,0 – 2,218. I denna studie, de genomsnittliga A260/A280 och A260/A230 nyckeltal som observerades var 2.016 ± 0,002 och 2.179 ± 0,018, respektive (tabell 1). Därför lyckades vårt RNA extraktion protokoll. En annan fördel med det protokoll som används är tillägget av DNAS behandling. Detta är viktigt att undvika genomiskt DNA kontaminering19. En begränsning av detta RNA isolering protokoll är användningen av rening kolumner att kassera avfall genom nederbörd med alkohol eftersom vissa lung skräp kan hindra membranet helt eller delvis, vilket resulterar i låg avkastning. Också, om det homogenisering steget inte utförs noggrant, stora mängder lung RNA kan enkelt förlorade eller förstörd. Om låg RNA avkastning erhålls, kan RNA åter renas och eluerat i en mindre volym. RNA kan alternativt vara utfällda natten följande publicerade protokoll20.
Microarray technologies tillämpas på miRNA profilering är lovande verktyg inom många forskningsområden. I vår studie använde vi PCR matriser, som ger fördelen av högre upptäckt tröskel och normalisering strategier för detektion av Differentiellt uttryckta MicroRNA vs. andra tekniker såsom sond-baserade miRNA kedjor21. En begränsning av detta protokoll är att den kräver ett minimum av utgångsmaterial RNA, och tillgänglighet av specifika uppsättningar av primers för MicroRNA av intresse, i motsats till andra tillgängliga tekniker såsom RNAseq. En annan fördel med PCR-baserade matriser är alternativet att använda icke-miRNA referens gener för qPCR normalisering (såsom små nukleolära RNAs eller SNORDs) för att beräkna differentiell uttryck för microRNA. Slutligen, med hjälp av PCR-matriser erbjuder flera alternativ för dataanalys, alltifrån online verktyg som tillhandahålls av tillverkarna, att konventionella metoder att upptäcka differentiell uttryck dock Real-Time PCR. Statistisk analys med limma är bekvämt för både microarrays och PCR-baserade matriser och använder den empiriska Bayes modereras f- statisitcs22. Här visar vi att både p- och q-värdena (justerat för flera tester) kan erhållas med det kommandot toptable justera tröskeln falsk upptäckten hastighet och identifiera differentially uttryckt microRNA.
Funktionell analysprogramvara är en webbaserad applikation för dataanalys i signalvägen sammanhang. Programvaran ger forskare kraftfulla Sök förmågor som kan hjälpa till att ram datauppsättningar eller specifika mål i sammanhang, inom en större bild av biologisk betydelse. Även om programmiljö är flexibel till olika typer av analyser (dvs metabolomik, proteomik, toxikologi, mikroRNA, SNP, etc.), vårt mål här är att lyfta fram aspekter av miRNA analys. Efter uppladdning en lista över 14 MicroRNA med betydande uttryck log-nyckeltal och p-värden, karterades alla av programvaran. Vi genomförde miRNA målet filter och core analysen, vilket inkluderar anrikning väg analys. Men överväga sådana analyser gener som förutsägs de 14 MicroRNA till målet och inte MicroRNA själva. I resultatavsnittet om utgångar såsom: kanoniska vägar, sjukdomar och funktion, gener riktade av Differentiellt uttryckta MicroRNA, fysiologiska systemutveckling, tillsynsmyndigheter och nätverk (tabell 4). Väg visualiseringen visas under Nätverksfliken där MicroRNA och molekyler visas som klickbara noder som är länkade med information som är kopplad till genen av intresse (figur 3). En fördel av programvaran funktionell analys är högkvalitativa miRNA-relaterade resultaten, inklusive både experimentellt validerade och förutsedda interaktioner. Funktionell analys programvara databaserna inkluderar: experimentellt validerade mikroRNA-mRNA interaktioner databaser23,24, förutspådde mikroRNA-mRNA interaktion databas med osäkra interaktioner uteslutas (t.ex. Målet Scan)25, experimentellt validerade mänskliga, råtta, och mus mikroRNA-mRNA interaktioner databaser (t.ex. miRecords)26och litteratur fynd (t.ex., mikroRNA-relaterade fynd manuellt curerad från publicerad litteratur av vetenskapliga experter). Andra studier som jämförde effektivitet och användbarhet av bioinformatiska verktyg att analysera vägar som är associerad med miRNA uttryck bekräftar effektiviteten av denna programvara27. Övergripande, beräkningsvetenskapliga metoder är kostnadseffektiva, mindre tidskrävande och lätt kan verifieras av molekylära metoder. Med ständig tillväxt och ansamling av biomedicinska data blir bioinformatik metoder allt mäktigare i upptäckten av miRNA-medierade mekanismer av biologiska och sjukdom processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av bidrag från NIH K01HL133520 (PS) och K12HD055882 (PS). Författarna vill tacka Dr Joanna Floros för hjälpen med ozon exponering experiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7 mL |
| Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10x and 20x objective |
| Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10 mg/kg. Controlled Drug. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
| 21 G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1 mL |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
| Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
| Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50 mg |
| RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μL reactions |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
| Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
| Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
| Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
| RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
References
- Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
- Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression? Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
- Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
- Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
- Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).
- Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
- Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide. Bioconductor. , (2002).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).
- Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Walker, S. E., Lorsch, J.
- Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
- Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
- Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
- Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
- Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).
