Summary
Her, beskrevet vi en høj-indhold billedbehandling metode for at kvantificere transport af rhodopsin mutanter tilknyttet retinitis pigmentosa. En multiple-bølgelængde scoring analyse blev brugt til at kvantificere rhodopsin protein på cellens overflade eller i hele cellen.
Abstract
Rhodopsin proteinmisfoldning mutationer fører til stang fotoreceptor død, der manifesterer sig som autosomal dominerende retinitis pigmentosa (RP), progressiv blændende sygdom, der mangler effektive behandling. Vi hypotesen, at cytotoksicitet fejlfoldede rhodopsin mutant kan afhjælpes ved at farmakologisk stabilisere mutant rhodopsin protein. P23H mutationen blandt de andre klasse II rhodopsin mutationer, koder et strukturelt ustabile rhodopsin mutant protein, der er akkumuleret i det endoplasmatiske reticulum (ER), hvorimod vildtype rhodopsin er transporteret til plasmamembran i pattedyr celler. Vi tidligere udført en luminescence-baserede høj overførselshastighed skærm (HTS) og identificeret en gruppe af farmakologiske chaperoner, der reddede transport af P23H rhodopsin fra ER at plasmamembran. Her, kvantificeret ved hjælp af en immunfarvning metode efterfulgt af en høj-indhold imaging analyse, vi mutant rhodopsin protein beløb i hele cellen og på plasmamembran. Denne metode er informativ og effektiv til at identificere sande hits fra falske positiver efter HTS. Derudover gjort high-indhold billedanalyse det muligt at kvantificere flere parametre fra en enkelt eksperiment at evaluere de farmakologiske egenskaber af hver sammensatte. Ved hjælp af denne analyse, analyseret vi virkningen af 11 forskellige forbindelser mod seks RP forbundet rhodopsin mutanter, at opnå en 2D-farmakologisk profil for en kvantitativ og kvalitativ forståelse om den strukturelle stabilitet af disse rhodopsin mutanter og effekten af forskellige forbindelser mod disse mutanter.
Introduction
Protein misfoldning er involveret i Muskelsvindfonden, neurale degenerations og blændende sygdomme, herunder retinitis pigmentosa (RP)1. RP er en arvelig og progressiv retinal degeneration forbundet med mutationer i over 60 gener påvirker funktion og homøostase stang fotoreceptorer eller retinale pigmenteret epitheliums (RPEs)2,3. Ingen effektiv behandling er i øjeblikket tilgængelig for RP. Rhodopsin mutationer tegner sig for omkring 25-30% af autosomal dominerende (ad) RP tilfælde. Blandt de mere end 150 rhodopsin mutationer4 (Human Gene Mutation Database, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), klasse II mutationer forårsager den strukturelle ustabilitet af rhodopsin protein, der bidrager til stang fotoreceptor død og vision tab5,6,7,8. P23H er den hyppigste rhodopsin mutation i Nordamerika, som også er et typisk eksempel på klasse II rhodopsin mutationer9,10. På grund af dens iboende strukturelle ustabilitet, er den fejlfoldede rhodopsin akkumuleret i det endoplasmatiske reticulum (ER) i pattedyrceller, hvorimod vildtype rhodopsin ligger på plasma membran5. Den fejlfoldede rhodopsin P23H mutant udstiller dominerende negativ cytotoksicitet, der er ikke på grund af haploinsufficiency, men er relateret til aktivering af ER forbundet protein Nedbrydningsvejen og afbrudte stang ydre segment organisation. For at afhjælpe stang fotoreceptor cell stress, er én strategi at stabilisere de indfødte foldning af mutant rhodopsin ved hjælp af en farmakologisk anstandsdame.
For at nå dette mål, udførte vi en celle-baserede høj overførselshastighed skærm (HTSs)11,12,13 ved hjælp af en β-galactosidase fragment komplementering assay for at kvantificere P23H rhodopsin mutant transporteres på plasma membran. Robust og enkel protokol af denne HTS assay aktiveret os til at udforske aktiviteterne i cirka 79.000 små molekyler til hver skærm. Men fordi denne HTS assay læser luminescence signaler, falske positiver herunder β-gal-hæmmere, farvet eller cytotoksiske stoffer indgår i hitlisten venter på at være identificeret ved en sekundær analyse.
Traditionelle immunfarvning og fluorescens Billeddannende metoder har været brugt i årevis til at studere rhodopsin transport i pattedyrceller5,14,15,16. Men disse konventionelle metoder ikke kan bruges til at kvantificere farmakologiske virkninger af mere end 10 forbindelser mod rhodopsin transport, fordi en pålidelig imaging analyse kræver et stort antal af billeder taget under en meget konsekvent betingelse, som er ikke ændres ved de konventionelle Billeddannende metoder. Her, udviklede vi en immunfarvning baseret high-indhold imaging protokol som en sekundær analyse at kvantificere celle overfladetransport fejlfoldede rhodopsin mutanter11,13,17. Hvis du vil navngive rhodopsin på plasma membran, sprunget vi trin i cellemembranen permeabilization og immunostained rhodopsin mutanter af et monoklonalt (B6-30) anti-rhodopsin anerkende den N-terminale epitop af rhodopsin på den ekstracellulære side af cellen membran18. For at visualisere den mutante rhodopsin i hele cellen, smeltet vi rhodopsin med Venus fluorescens protein. Ved kvantificeringen af fluorescens intensiteter i forskellige fluorescens kanaler er vi i stand til at opnå flere parametre fra én enkelt eksperiment herunder samlede rhodopsin intensitet i hele cellen på celleoverfladen, og forholdet mellem rhodopsin fluorescens på cellens overflade, i hele cellen. Anvender denne metode til stabil celler, der udtrykker en i alt seks fejlfoldede rhodopsin mutanter, kan vi generere en farmakologisk profil af flere små molekyle chaperoner mod disse mutanter. I denne protokol, alle celler er immunostained i en 384-godt plade og afbildet ved hjælp af en automatiseret billedbehandling system under en meget konsekvent tænkelig tilstand. En billedanalyse er udført til hver brønd, der indeholder billeder af mere end 600 celler til at reducere variation på grund af heterogenitet af celler med varierende celle form og protein udtryk niveau. Arbejdsprocessen i denne protokol er sammenfattet i figur 1. Fordelen ved denne metode er, at vi får billeder med høj opløsning samt multi-parameter kvantificeringer fra image-baserede analyse. Generelt kan denne protokol ændres og anvendes til at kvantificere transport af enhver fejlfoldede membran protein af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Rhodopsin transport assay.
1. forberedelse og kultur af celler
- Genoplive cryo-konserveret U2OS stabil celler udtrykker vildtype (WT) eller mutant musen rhodopsin-Venus fusion proteiner. Tø celler ved 37 ° C, indtil kun små iskrystaller er tilbage i hætteglasset.
Bemærk: U2OS cellerne er anvendt i denne protokol, fordi der findes ingen fotoreceptor cellelinie til in vitro- undersøgelser og pre ciliaere biosyntesen af rhodopsin er reguleret af lignende molekylære mekanismer i pattedyrsceller. Derudover U2OS celler lægger tæt på bunden af pladen og har store celle organer, så de er ideelle til rhodopsin transport assay. Syv U2OS stabil celler udtrykker WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N og P267L rhodopsin mutanter bruges her som eksempel til at vise den kvalitet og pålidelighed af analysen. Stabil celler udtrykker andre rhodopsin mutanter eller andre Membranproteiner kan bruges, afhængigt af formålet med analysen. Stabil celler udtrykker menneskelige rhodopsin kan bruges i denne analyse, hvis tilgængelig. Musen rhodopsin blev brugt her, fordi musen og menneskelige rhodopsin proteiner del 95% homologi, og de forbindelser, der identificeres af denne analyse vil blive testet i vivo ved hjælp af en mus adRP model transporterer rhodopsin P23H mutation8. De stabile celler blev genereret som beskrevet tidligere19. WT og mutant rhodopsin afskrifter blev kvantificeres ved q-PCR, og kloner af stabil celler udtrykker lignende niveauer af WT og mutant rhodopsin afskrifter blev udvalgt til dette assay. Udtryk for rhodopsin proteiner blev bekræftet af immunblot og immunfarvning. Passage af celler, der bruges i denne analyse bør være lavere end 20. - Overføre hver linje af celler ind i en 15 mL konisk rør indeholdende 10 mL af vækstmediet (høje glukose Dulbecco ændret Eagle's medium (DMEM) med 10% føtal bovint serum (FBS) og 5 µg/mL Plasmocin).
- Der centrifugeres tube på 200 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspenderes celle med 5 mL af celle vækstmedium for hver cellelinje. Overføre hver linje af cellesuspension til en 60 mm vævskultur parabol og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2.
- Subkultur celler når vævskultur fadet når 90% sammenløbet som beskrevet i henvisning12.
2. såning celler på 5.000 celler pr. brønd
Bemærk: Udføre følgende procedurer i en vævskultur hætte.
- Behandl pladen med poly-lysin.
- Én dag før såning celler, behandle en sort-væg og rydde 384-godt bundplade med 20 µL/brønd af poly-lysin løsning i 30 min.
- Opsug flydende og tillade alle brøndene tørre for 1 h. sat tilbage plade låget og gemme plade ved 4 ° C natten over i celle såning.
- Forberede cellesuspension.
- Kultur hver cellelinje i vækstmediet i en 100 mm vævskultur parabol indtil 90% sammenløb.
- Vask hver tallerken med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og frigør celler med 1 mL 0,05% Trypsin ved 37 ° C.
- Resuspend hver linje af celler i 10 mL af assay medium (high-glucose DMEM med 10% FBS, 100 enheder/mL penicillin og streptomycin 100 μg/mL).
- Tælle cellerne og fortyndes hver linje af celler til 1.25 x 105 celler/mL med assay medium.
- Frø af celler.
- Bruge et elektronisk multikanalpipette eller en automatiseret reagens dispenser til at dispensere 40 µL/brønd af cellesuspension til tre kolonner pr. cellelinje og udfylde kolonnerne 1-21 af 384-godt plade (figur 2).
- Tilføje 40 µL/brønd af U2OS (P23H-Rhodopsin-Venus) kolonner 22-23 og 40 µL/brønd af U2OS (Rhodopsin-Venus) til kolonne 24, som kontrol.
- Centrifugeres plade på 300 x g for 30 s til at bringe ned alle celler til bunden af 384-godt plade.
Bemærk: Undgå fysiske stød på pladen efter celle såning. Ellers celler vil blive knust til et hjørne af hver brønd, og pladen bliver ikke egnet til høj-indhold billeddannelse. - Inkuber 384-godt pladen ved 37 ° C med 5% CO2 til 3 h for cellerne til at vedhæfte til bunden af pladen.
3. behandling af celler med forbindelser
- Generere en plade kort med behandling betingelser som vist i figur 2.
- Forberede 300 µL af 5 x arbejder løsninger af op til 15 forbindelser i en 96-brønd plade.
- Fortynd cps 1-15 med assay medium til fem gange i deres endelige koncentrationen af 96-brønden i brønde A1 til G2 plade (figur 2A). Tilsæt 300 µL af assay medium i godt H2.
NOTE: Den endelige koncentration af hvert stof er brugt på den mest effektive koncentration for at redde transport af P23H rhodopsin af HTS12,13. - Tilsæt 100 µL pr. brønd af 2% dimethylsulfoxid (DMSO) og 25 µM 9 -cis-retinal, der er fortyndet i assay mellemlang kolonne 11 og 12, henholdsvis. Tilføje 9 -cis-retinal i svagt lys.
- Fortynd cps 1-15 med assay medium til fem gange i deres endelige koncentrationen af 96-brønden i brønde A1 til G2 plade (figur 2A). Tilsæt 300 µL af assay medium i godt H2.
- Tilføje 10 µL pr. brønd af 5 x arbejder løsninger til 384-godt pladen kulturperler med celler (figur 2B).
- Bruge et elektronisk multikanal-pipette til at tilføje forbindelser 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 og 15 rækker A, C, E, G, I, K, M og O fra kolonner 1 til 21 (figur 2). Tilføje forbindelser 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 og M til rækker B, D, F, H, J, L, N og P fra kolonnerne 1-21.
- Tilføje 10 µL pr. brønd af 2% DMSO til kolonner 22 og 24. Tilsæt 10 µL pr. brønd af 25 µM 9 -cis-retinal til kolonne 23.
Bemærk: DMSO er brugt som et køretøj kontrol, fordi alle forbindelser er i første omgang opløst i DMSO som bestande. Kolonne 22 DMSO behandlede celler udtrykker P23H rhodopsin er brugt som kontrolelementet 0%. 9 -Cis-retinal behandlede celler, der udtrykker P23H rhodopsin bruges som 100% kontrol.
- Dække 384-godt plade med alufolie og inkuberes plade ved 37 ° C i 24 timer.
4. immunfarvning uden membran Permeabilization at plette Rhodopsin proteiner på celleoverfladen.
Bemærk: Undgå enhver vaskemiddel i hele immunfarvning proces at holde celle membranen intakt.
- Forbered 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) ved fortynding 16% PFA med PBS i forholdet 1:4 volumen i en kemisk stinkskab. Overføre 4% PFA i en reagens reservoir.
- Tegne 384-godt pladen i et mørkt rum med dæmpet rødt lys. Bruge en 8-kanal indsugningsventil tilsluttet en vacuum indsamling flaske til forsigtigt suges medium. Bruge et elektronisk multikanalpipette til at tilføje 20 µL pr. brønd af frisklavede 4% PFA til hele 384-godt pladen og Ruger i 20 min. ved stuetemperatur. For at undgå celle detachement, altid pege tips af betjent sug på samme side af hver brønd under forhåbninger. Berør ikke det midterste nederste område af hver brønd. Når du tager billeder, vælg felter for at undgå regionen rørt af betjent sug. For inkubationer længere end 10 min, dække 384-godt plade med låg til at undgå fordampning.
Bemærk: Celler er fast i et mørkt rum til at undgå photobleaching af regenereret isorhodopsin, der vil påvirke resultatet af 100% kontrol. Efter fiksering tages 384-godt pladen ud i normalt lys. - Bruge en 8-kanal indsugningsventil Aspirér PFA i hver brønd og bruge en elektronisk multikanal-pipette til at tilføje 50 μl pr. brønd af PBS. Gentag to gange for at udføre tre vasker med PBS.
Forsigtig: Affaldet flydende indeholdende PFA er indsamlet i en udjævnede flaske og skal bortskaffes som et farligt kemisk affald efter forsøget. - Blokere cellerne ved at tilføje 20 µL pr. brønd af 5% ged serum til hele 384-godt pladen og inkuberes ved stuetemperatur i 30 min.
- Opsug 5% ged serum og tilføje 15 µL pr. brønd af 20 µg mL-1 B6-30 anti-rhodopsin antistof i 1% ged serum til rækker A til O. tilføje 15 µL pr. brønd af 1% ged serum til row P for sekundær antistof-only kontrolgruppen.
- Inkuber 384-godt pladen ved stuetemperatur i 90 min. eller ved 4 ° C natten over. Dække 384-godt plade med alufolie at undgå photobleaching af fluorophores.
- Vask plade 3 gange med 50 µL pr. brønd af PBS.
- Opsug PBS og tilføje 15 µL pr. brønd 5 µg mL-1 Cy3-konjugeret gede anti-mus IgG antistof. Dække 384-godt plade med alufolie og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time eller ved 4 ° C natten over.
- Vask plade 3 gange med 50 µL pr. brønd af PBS. Tilsæt 50 µL pr. brønd PBS, som indeholder 1 µg mL-1 Hoechst 33342 at plette kerner ved stuetemperatur i 15 min.
- Forsegle 384-godt pladen med en gennemsigtig film før billeddannelse. Dække 384-godt plade med alufolie og opbevares ved 4 ° C i op til en uge hvis straks tages der billeder.
5. imaging.
Bemærk: Denne high-indhold imaging procedure er tilpasset billedbehandlingssystem listet i Tabel af materiale. Procedurer kan være anderledes, hvis ved hjælp af andre billeddiagnostiske systemer, high-indhold.
- Fjern låget og ibrugtages high-indhold imager 384-godt plade med A1 placeret i øverste venstre hjørne af pladen.
- Åbn billede erhvervelse software til at konfigurere parametre for image erhvervelse.
- Åbn vinduet plade erhvervelse Setup og oprette nye indstilling eller indlæse en eksisterende setup fil.
- Vælg målsætningen, 20 x og oprette pixel binning som 2 så kalibreret pixelstørrelse er 0,80 x 0,80 µm. Indstil skanne linier som 2.000 og billedets størrelse (W x H) som 1000 x 1000 pixels (800,00 x 800,00 µm) pr. websted.
- Vælg den plade til afbildning. Brug oplysningerne fra producenten af 384-godt plade til at fylde i dimensionerne plade.
- Vælg brønde til afbildning til 384-godt plade.
- Vælg fire lokaliteter til afbildning pr. brønd. Undgå siden af den godt rørt ved aspiration tips.
- Vælg excitation lasere som 405, 488 og 561 nm. Vælg emission filtre for DAPI, FITC og Texas rød kanaler. Optimere laser power og gevinster for hver kanal at sikre lysstyrken på billeder taget fra positive kontrolhullerne er mindre end tærskelværdien, mætning.
- Vælg godt at nå fokus for autofokus. Vælg den første godt erhvervet som oprindelige godt for at finde prøver. Angiv websted autofokus til alle websteder.
- Vælg fire gennemsnit pr. linje for hver kanal. Optimere værdien Z-forskydning for hver kanal.
- Test 2-3 brønde på diagonal hjørner af 384 godt pladen for at sikre billederne er på fokus for alle testede wells, billeder fra alle websteder pr. brønd har celler med mere end 40% sammenløbet og fluorescens intensiteter af alle kanaler er omkring halvdelen mættet i 100% kontrolhullerne.
- Gemme image erhvervelse metode.
- Køre hele pladen. Se imager, indtil den er færdig indfange billeder fra den første kolonne af pladen at dobbelttjekke billedkvaliteten inden de forlader imager. Tag den 384-godt plade og opbevares ved 4 ° C til fremtidig brug.
Bemærk: Afhængigt af antallet af lokaliteter udvalgt pr. brønd og kanaler taget, det tager 40 min til 3 h til slut imaging ene 384-godt plade.
6. billedanalyse.
- Trække ud billeddata ved hjælp af en high-indhold billede analyse software. Vælg en af 100% kontrolhullerne (kolonne 23) til at konfigurere parametre.
- Vælg Multi bølgelængde celle Scoring som analysemetoden og start konfiguration af indstillinger.
- Definere kerner ved hjælp af billeder fra DAPI kanal. Se et eksempel for at sikre de definerede kerner figurer i den valgte godt passer godt med kerner billeder.
- Definere form af celler i FITC kanal hvor rhodopsin-Venus er afbildet.
- Definere rhodopsin celle overfladen pletten områder i Texas røde kanal.
- Teste den aktuelle algoritme i 5 brønde til at bestemme, hvis indstillingerne er optimeret. Gemme indstillingerne og lukke vinduet konfiguration .
- Køre alle brønde med den optimerede analysemetode.
- Eksportere Objektnummeret som intakt celle nummer. Eksportere den Gennemsnitlige intensitet af FITC-kanal som Rhodopsin-Venus intensitet (Rhodopsin-Venus INT). Eksportere Gennemsnitlige intensitet af Texas rød kanal som rhodopsin intensitet på cellens overflade (Rhodopsin INT på celleoverfladen).
- Åbn den eksporterede data i et regneark software. Opdele rhodopsin intensitet på cellens overflade af rhodopsin-Venus INT som MEM-til-sum ratio. Beregne Z'-faktorer for hver parameter for at evaluere assay kvalitet. Z′ = 1−3X (STD100% styre+STD0% kontrol) / | Betyder100% kontrol−Mean0% kontrol|.
Bemærk: En Z'-faktor højere end 0 angiver en moderat assay tilstrækkelig for en høj-indhold skærm og en Z' faktor mellem 0,5 og 1 antyder en fremragende analyse kræves for en høj overførselshastighed skærm20,21. - Bruge regneark software til at generere en tofarvet zonekort for hver parameter. Arrangere navn cellelinjer på x-aksen og forbindelser på y-aksen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi kendetegnet rhodopsin transport med tre parametre: rhodopsin-Venus intensiteten i hele cellen (Rhodopsin-Venus INT), immunfarvning intensiteten af rhodopsin på plasma membran (Rhodopsin INT på celleoverfladen) og forholdet mellem rhodopsin plet på cellens overflade til rhodopsin-Venus intensitet i hele cellen (MEM-Total Ratio). Et repræsentativt resultat af rhodopsin transport assay er vist i figur 3 og figur 4. Ved hjælp af DMSO og 9 -cis-retinal behandlede celler, der udtrykker P23H-rhodopsin-Venus som 0 og 100% kontrol, henholdsvis Z'-faktorer for disse tre parametre er i intervallet mellem 0 til 0,5, tyder på, at analysen har moderat kvalitet, tilstrækkelig for high-indhold imaging21. Selvom optimeret Z'-faktorer er lavere end 0,5 på grund af sin relativt komplekse procedurer i forhold til en HTS assay, denne analyse er stadig robust og pålidelig en image-baseret analyse. Et aktivt stof, der redder en fejlfoldede rhodopsin bør vise højere værdier af Rhodopsin INT på celleoverfladen og MEM-Total Ratio end DMSO, med en P -værdi mindre end 0,05. Tre 2-D varme kort blev genereret fra disse tre parametre til at sammenligne den gennemsnitlige rhodopsin beløb og lokalisering pr. celle (figur 4). Gentages i tre, WT og seks rhodopsin mutanter er opstillet vandret, og virkningerne af sammensatte behandlinger sammenlignes lodret. Med tidligere undersøgelser, rhodopsin INT på celleoverfladen og MEM-alt forholdet er lavere for seks mutanter i forhold til WT rhodopsin behandlet med DMSO (figur 4 c)5,22,23. Rhodopsin INT på cellens overflade og dens MEM-til-sum ratio er steget med 9 -cis-retinal behandling for T4R, P23H, D190N og P267L, men ikke de P53R eller C110Y mutanter, tyder på, at 9 -cis-retinal redder transport af T4R, P23H, D190N og P267L rhodopsin mutanter. Alle cps viste varierende niveauer af stigning i Rhodopsin INT på cellens overflade til T4R, P23H og D190N. CPS 3, 4, 5, 7, 8 og 11 øget rhodopsin-Venus INT men ikke MEM-til-sum forholdet mellem disse rhodopsin mutanter, tyder på, at disse forbindelser kun øget rhodopsin beløb. CPS 1, 2 6 og 9 steget betydeligt MEM-til-sum forholdet mellem T4R, P23H, D190N og P267L rhodopsin mutanter, tyder på, at disse forbindelser redde transport af disse rhodopsin mutanter til plasmamembran. 2-D profiler giver et samlet overblik over rhodopsin transport berøres af disse adRP forbundet mutationer, der er dæmpet af forskellige farmakologiske behandling.
Figur 1: workflow af rhodopsin transport assay. Procedurer for celle overflade farvning af rhodopsin uden membran permeabilization for rhodopsin transport assay. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: illustrationer til forberedelse af 5 x arbejder løsninger og flydende overførsel fra 96-brønd plade til 384-godt plade. (A) den 96-brønd plade layout af 5 x arbejder løsninger. Brønde A1 til G2 har 300 µL pr. brønd af op til 15 5 x arbejder løsninger og assay mellemlang (M), som illustreret i kolonne 1 og 2. Forbindelser, 14 og 15 er 2% DMSO og 25 µM 9 -cis-retinal, henholdsvis for behandling til de syv cellelinjer udtrykker WT og mutant rhodopsin. Derudover kolonne 11 og 12 har 100 µL pr. brønd af 2% DMSO og 25 µM 9 -cis-retinal styrer henholdsvis behandlet til de celler, der udtrykker P23H rhodopsin til beregning af Z'-faktorer. (B) 384-godt plade layout for celle type- og behandlingsbetingelser. De U2OS celler udtrykker WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, er D190N og P267L rhodopsin-Venus seedet som illustreret. Behandling betingelser er mærket med blåt. Pink og blå tips vise godt at nå flydende overførsel fra 96-brønd plade til 384 pladen ved hjælp af en multikanalpipette. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant billeder og kvantificeringer for kontrollen af rhodopsin transport assay. (A) Venus fluorescens (grøn) og celle overflade immunfarvning (rød) af U2OS celler, der udtrykker WT eller P23H rhodopsin-Venus behandlet med DMSO eller 5 µM 9 -cis-retinal. Skalalinjen = 200 µm. (B) A kolonne plot af betyder Venus intensitet pr. celle repræsenterer rhodopsin beløb i hele cellen (Rhodopsin-Venus INT). p< 0,0001. Z'-faktor er vist under den sorte linie. Kolonne værdi og fejl bar er gennemsnit og standardafvigelse (S.D.) 16 replikater, henholdsvis. (C) en kolonne plot af betyde Cy3 intensitet pr. celle repræsenterer rhodopsin farves på cellens overflade (Rhodopsin INT på celleoverfladen). (D) en kolonne plot af forholdet mellem gennemsnitlig cy3 intensitet pr. celle betyde Venus intensitet pr. celle der repræsenterer forholdet mellem rhodopsin niveau på cellens overflade til dens hele-celle niveau (MEM-til-sum ratio). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: en repræsentativ high-indholdsanalyse af rhodopsin transport analysen vist som 2-farve varme kort. (A) den varmekort over betyder Venus intensitet pr. celle repræsenterer hele-celle rhodopsin niveau (Rhodopsin-Venus INT). Hver blok repræsenterer et datamærke og hver tilstand blev testet i tre eksemplarer. Den farve legende er vist til venstre. CP, sammensatte. (B) den varmekort over betyde Cy3 intensitet pr. celle repræsenterer rhodopsin farves på cellens overflade (Rhodopsin INT på celleoverfladen). (C) den varmekort over betyder Cy3 intensitet pr. celle til gennemsnitlig Venus intensitet pr. celle der repræsenterer forholdet mellem rhodopsin niveau på cellens overflade til dens hele-celle niveau (MEM-til-sum ratio). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her, viste vi en høj-indhold imaging assay bruges til kendetegner hits identificeret fra en HTS. Den eneste automation involveret i disse protokoller er høj-indhold imager. Immunfarvning og fluorescens billeddannelse af rhodopsin har været anvendt almindeligvis at karakterisere lokalisering af rhodopsin5,14,15,16. Kvantificering af billeder taget af de traditionelle Billeddannende metoder er dog begrænset af manglen på tilstrækkelige celle billeder pr. betingelse, lav kapacitet billeder pr. eksperiment, og manglen på en kvalitetskontrol parameter. Vi tilpasset den traditionelle immunfarvning protokol til 384-godt format og erstattet den traditionelle imaging med high-indhold billeddannelse. Bruger denne high-indhold imaging protokol, vi med held valgt og karakteriseret aktiviteter af hits identificeret ved en HTS11,13,17. Sammenlignet med traditionelle immunfarvning og Billeddannende metoder, øget denne protokol betydeligt konsistens imaging betingelser, imaging kapacitet og billede analyse magt, som gjorde det muligt for os kvantitativt sammenligne de farmakologiske virkninger forbundet rhodopsin mutanter af 11 forbindelser til transport af seks adRP.
De store ændringer af denne protokol, i forhold til de tidligere anvendte protokoller for rhodopsin immunfarvning og billedbehandling er: (1) vokser og immunfarvning celler i en klar-384-godt bundplade; (2) imaging celler ved hjælp af en high-indhold imager; og (3) analysere data med en høj-indhold, image analyse software. På grund af disse ændringer er en indledende optimering forpligtet til at finde de bedste celle seeding antallet, antistof koncentrationer, imaging betingelser og billede analyse algoritmer.
Kritiske trin i protokollen omfatter: (1) såning celler, der tillader 50-70% sammenløbet før fiksering; (2) omhyggelig forhåbninger om at undgå celle udstationering; (2) imaging flere brønde på tværs af hele pladen til at sørge for billeder er på fokus og fluorescerer i alle kanaler overstiger ikke halvdelen af tærsklen af imager for positive kontrolhullerne før imaging hele pladen; og (3) at holde Z'-faktor højere end 0 for at sikre pålideligheden af analysen.
De mest almindelige problemer, der kan opstå for denne protokol er celle detachment og lav Z "-faktorer. For at undgå det første spørgsmål, forbehandle 384-godt plade med poly-L-lysin til lette celle vedhæftet fil og undgå at bruge cellelinjer, der frigør nemt som Hek293 cellerne. Derudover begrænse aspiration tip at røre kun én side af hver brønd under aspiration og vælge anden siden af hver brønd for billeddannelse. At forbedre Z'-faktor og assay kvalitet, optimere cellen såning nummer og billede analyseparametre for at sikre den celle figuren eller kerner defineret af softwaren passer godt sammen med hvert objekt i hver kanal, fluorescens.
Sammenlignet med andre metoder til at kvantificere rhodopsin transport, som en celle overflade ELISA eller en β-galactosidase fragment komplementering assay, der beregner protein målniveauet på cellens overflade i alle celler, kvantificerer denne high-indhold billedmetoden gennemsnitlige protein niveau pr. celle; og denne unikke funktion undgår en kritisk variation faktor, celle tal, der påvirker de endelige udlæsninger i andre metoder. Desuden, på grund af det store antal celler afbildet og kvantificeres ved høj-indhold billedmetoden, parametrene gennemsnit fra alle celler pr godt viste lave variation mellem replikater, således tilføjelse til pålideligheden af analysen.
En begrænsning af denne protokol er, at de ikke er de bedste assays til HTS, på grund af sin relativt kompliceret procedure og 2 h pr. plade imaging tid. Dermed, vi anbefaler alternative reporter assays til screening store små-molekyle biblioteker med mere end 5.000 forbindelser, og bruge denne high-indhold imaging protokol for fokuseret karakterisering assays begrænset til mindre end 100 forbindelser. Den anden begrænsning af denne protokol er dens mangel på standarder for at vise, om Venus fluorescens eller immunfarvning fluorescens intensiteter er i en lineær korrelation med mængden af rhodopsin protein beløb pr. celle. For at undgå mætning af immunfarvning, anbefaler vi test og plotte immunfarvning intensiteter af cellerne inkuberes med forskellige koncentrationer af primære og sekundære antistoffer. Vælg antistof koncentrationer inden for det lineære område af fluorescens ændring.
Udvide fra det aktuelle program, vil vi kvantificere rhodopsin transport fra billeder af celler forbigående transfekteret med 28 forskellige rhodopsin mutanter under behandling med op til 10 forbindelser til at generere en farmakologisk database af disse forbindelser' aktivitet for vejledning af potentielle behandlinger til adRP patienter bærer disse rhodopsin mutationer. Denne protokol kan også tilpasses nemt til omplantning assays af enhver membran protein af interesse, som vil være nyttige for lægemiddel opdagelser af andre protein misfoldning sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Mark E. Schurdak og University of Pittsburgh Drug Discovery Institut for at levere høj-indhold imager og indledende kurser. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) delt generøst 1 d 4 og B630 anti-rhodopsin antistoffer. Plasmid indeholder cDNA af musen rhodopsin-Venus konstruere deltes af Dr. Nevin Lambert (Augusta Universitet). Dette arbejde blev støttet af det nationale Institut for sundhed grant EY024992 til YC og P30EY008098 fra University of Pittsburgh Vision forskning Core grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H.
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
