Summary
Qui, abbiamo descritto un metodo di imaging ad alto contenuto per quantificare il trasporto dei mutanti di rodopsina associata alla retinite pigmentosa. Un'analisi dei punteggi multiplo-lunghezza d'onda è stata utilizzata per quantificare proteina rhodopsin sulla superficie delle cellule o in tutta la cella.
Abstract
Rodopsina misfolding di proteine mutazioni portano a morte dei fotorecettori asta che si manifesta come pigmentosa dominante autosomal di retinite (RP), una progressiva accecante malattia che manca di un trattamento efficace. Supponiamo che la citotossicità del mutante misfolded rodopsina possa essere alleviata stabilizzando farmacologicamente la proteina mutante rodopsina. La mutazione di P23H, tra le altre mutazioni di rodopsina di classe II, codifica per una proteina mutante di rodopsina strutturalmente instabile che viene accumulata nel reticolo endoplasmatico (ER), considerando che la rodopsina wild-type viene trasportata alla membrana plasmatica in mammiferi cellule. Precedentemente abbiamo effettuato una schermata di alto-rendimento basata su luminescenza (HTS) ed abbiamo identificato un gruppo di chaperoni farmacologici che hanno salvato il trasporto della rodopsina P23H da ER alla membrana plasmatica. Qui, utilizzando un metodo di immunostaining seguito da un'analisi di imaging ad alto contenuto, abbiamo quantificato la quantità di proteina mutante rodopsina in tutta la cella e sulla membrana plasmatica. Questo metodo è informativo ed efficace per identificare i veri successi da falsi positivi dopo HTS Inoltre, l'analisi di immagine ad alto contenuto permesso di quantificare i parametri multipli da un singolo esperimento per valutare le proprietà farmacologiche di ogni composto. Usando questa analisi, abbiamo analizzato l'effetto di 11 diversi composti verso sei mutanti di rodopsina RP associati, ottenendo un profilo farmacologico 2-D per una comprensione quantitativa e qualitativa circa la stabilità strutturale di questi mutanti di rodopsina e l'efficacia di diversi composti verso questi mutanti.
Introduction
Misfolding proteico è coinvolto nella distrofia muscolare, degenerazioni neurale, come pure malattie accecante, compresa la retinite pigmentosa (RP)1. RP è una degenerazione retinica ereditaria e progressiva associata a mutazioni in oltre 60 geni che influenzano la funzione e omeostasi dei fotoricettori dell'asta o l'epitelio pigmentato retinico (RPEs)2,3. Nessun trattamento efficace è attualmente disponibile per RP. Le mutazioni di rhodopsin rappresentano circa il 25-30% di autosomica dominante (ad) casi RP. Tra le mutazioni più di 150 del rhodopsin 4 i (Human Gene mutazione Database, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), le mutazioni di classe II causano l'instabilità strutturale della proteina rhodopsin che contribuisce alla morte dei fotorecettori rod e visione perdita5,6,7,8. Il P23H è la mutazione più frequente di rodopsina in Nord America, che è anche un tipico esempio della classe II rodopsina mutazioni9,10. A causa della sua intrinseca instabilità strutturale, la rodopsina misfolded viene accumulata nel reticolo endoplasmatico (ER) in cellule di mammifero, considerando che la rodopsina wild-type si trova sulla membrana plasmatica5. La rodopsina misfolded P23H Mostre mutante dominante citotossicità negativa che non è dovuto l'aploinsufficienza, ma è relativo all'attivazione di ER associati via di degradazione proteica e l'organizzazione del segmento esterno asta interrotta. Per alleviare stress cellulare di asta del fotoricettore, una strategia è quello di stabilizzare la piegatura nativo della rodopsina mutante usando un chaperone farmacologico.
Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo effettuato un basati su cellule di schermo di alto-rendimento (intasamento)11,12,13 usando un'analisi di complementazione frammento di β-galattosidasi per quantificare il mutante di rodopsina P23H trasportato sul plasma membrana. Il protocollo semplice e robusto di questo test HTS permesso di esplorare le attività di circa 79.000 piccole molecole per ogni schermo. Tuttavia, poiché questo test HTS legge segnali di luminescenza, falsi positivi, tra cui gli inibitori β-gallone, composti colorati o citotossici sono inclusi nella lista di colpo in attesa di essere identificato da un'analisi secondaria.
Il tradizionale immunostaining e metodi di formazione immagine di fluorescenza sono stati utilizzati per anni per studiare il trasporto di rodopsina in cellule di mammiferi5,14,15,16. Tuttavia, questi metodi convenzionali non possono essere utilizzati per quantificare gli effetti farmacologici di più di 10 composti verso trasporto rodopsina, perché un'analisi di imaging affidabile richiede un gran numero di immagini scattate in una condizione altamente coerenza, che è non modificabile dai metodi convenzionali di formazione immagine. Qui, abbiamo sviluppato un protocollo di imaging ad alto contenuto di immunostaining basato come un'analisi secondaria per quantificare il trasporto su superficie delle cellule di rodopsina misfolded mutanti11,13,17. Per assegnare un'etichetta rodopsina sulla membrana plasmatica, abbiamo saltato il passo di permeabilizzazione della membrana cellulare e immunostained i mutanti di rodopsina da un monoclonale anti-rodopsina (B6-30), riconoscendo l'epitopo del N-terminale della rodopsina sul lato extracellulare della cella membrana18. Per visualizzare la rodopsina mutante in tutta la cella, abbiamo fuso rodopsina con la proteina di fluorescenza di Venus. La quantificazione delle intensità di fluorescenza in canali diversi di fluorescenza, siamo in grado di ottenere parametri multipli da un singolo esperimento tra cui l'intensità totale rodopsina in tutta la cella, sulla superficie delle cellule e il rapporto di fluorescenza di rodopsina sulla superficie delle cellule che in tutta la cella. Applicare questo metodo per stabile di cellule che esprimono un totale di sei mutanti misfolded rodopsina, possiamo generare un profilo farmacologico della più piccola molecola chaperoni verso questi mutanti. In questo protocollo, tutte le celle sono immunostained in una piastra 384 pozzetti e imaging utilizzando un sistema di imaging automatizzato in una condizione di imaging altamente coerenza. Un'analisi delle immagini viene eseguita in ciascun pozzetto, contenente immagini di più di 600 cellule per ridurre la variazione a causa dell'eterogeneità delle cellule con diversi livelli di espressione della proteina e della forma delle cellule. Il flusso di lavoro del presente protocollo è riassunto nella Figura 1. Il vantaggio di questo metodo è che otteniamo immagini ad alta risoluzione, nonché multi-parametro quantificazioni dall'analisi basata su immagini. In generale, questo protocollo può essere modificato e per quantificare il trasporto di qualsiasi proteina di membrana misfolded di interesse.
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Protocol
Nota: Il rodopsina trasporto dosaggio.
1. preparazione e coltura di cellule
- Rilanciare la crioconservazione U2OS stabile cellule che esprimono la wild-type (WT) o proteine di fusione di rodopsina-Venus topo mutante. Scongelare le cellule a 37 ° C fino a quando solo i cristalli di ghiaccio piccolo sono partiti nel flaconcino.
Nota: Le celle di U2OS vengono utilizzate in questo protocollo, perché c'è nessuna linea di cellule fotorecettrici disponibile per gli studi in vitro e la biosintesi pre-ciliare della rodopsina è regolata dai simili meccanismi molecolari in cellule di mammifero. Inoltre, le cellule di U2OS fissare saldamente alla parte inferiore della piastra e hanno grandi corpi cellulari, quindi sono ideali per il dosaggio di trasporto rodopsina. Sette U2OS stabile le cellule che esprimono il WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N e P267L rodopsina mutanti sono utilizzati qui come esempio per mostrare la qualità e l'affidabilità del test. Cellule stabili che esprimono altri mutanti di rhodopsin o altre proteine di membrana possono essere usate, secondo l'obiettivo del test. Stabile cellule esprimenti rodopsina umana possono essere usate per questo test, se disponibile. La rodopsina del mouse è stata usata qui perché mouse e proteine rodopsina umana condividano omologia di 95%, e i composti identificati da questo test sarà testata in vivo utilizzando un modello di topo adRP portando la rodopsina P23H mutazione8. Le cellule stabili sono state generate come descritto in precedenza19. Il WT e trascrizioni di rodopsina mutante sono state quantificate da q-PCR e i cloni di cellule stabili che esprimono livelli simili di WT e trascrizioni di rodopsina mutante sono stati selezionati per questo test. L'espressione di proteine rodopsina è stata confermata da immunoblot e immunostaining. Il passaggio di cellule usato per questo test dovrebbe essere inferiore a 20. - Trasferire ogni riga delle cellule in una provetta conica da 15 mL contenente 10 mL di terreno di coltura (alto glucosio Dulbecco modificato dell'Aquila medium (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) e 5 µ g/mL Plasmocin).
- Centrifugare la provetta a 200 x g per 5 min, scartare il supernatante e risospendere il pellet cellulare con 5 mL di medium di crescita cellulare per ogni linea cellulare. Trasferire ogni linea di sospensione cellulare in un piatto di coltura del tessuto di 60 mm e incubare a 37 ° C con 5% CO2.
- Sottocultura le cellule quando il piatto di coltura del tessuto raggiunge 90% confluenza come descritto nel riferimento12.
2. cellule alle 5.000 cellule per pozzetto di semina
Nota: Eseguire le procedure seguenti in un cappuccio di coltura del tessuto.
- Trattare la lamina con poli-lisina.
- Un giorno prima della semina delle cellule, trattare un muro nero e deselezionare piastra 384 pozzetti inferiore con 20 µ l/pozzetto di soluzione di poli-lisina per 30 min.
- Aspirare il liquido e lasciare asciugare per 1 h. rimettere il coperchio piatto tutti i pozzetti e memorizzare la piastra a 4 ° C durante la notte per la semina delle cellule.
- Preparare la sospensione cellulare.
- Fino al 90% confluenza della coltura in ogni linea cellulare in crescita medio in un piatto di coltura del tessuto di 100 mm.
- Lavare ogni piatto con tamponato fosfato salino (PBS) e staccare le cellule con 1 mL di 0.05% tripsina a 37 ° C.
- Risospendere ogni linea di cellule in 10 mL di medium di analisi (alto-glucosio DMEM con 10% FBS, 100 unità/mL di penicillina e streptomicina 100 μg/mL).
- Contare le celle e diluire ogni riga di celle per 1,25 x 105 cellule/mL con il medium di analisi.
- Le cellule del seme.
- Utilizzare una pipetta elettronica multicanale o un dispenser automatizzati reagente per dispensare 40 µ l/pozzetto della sospensione delle cellule a tre colonne per ogni linea cellulare e colonne 1-21 di riempimento della piastra 384 pozzetti (Figura 2).
- Aggiungere 40 µ l/pozzetto di U2OS (P23H-Rhodopsin-Venus) alle colonne 22-23 e 40 µ l/pozzetto di U2OS (Rhodopsin-Venus) alla colonna 24, come controlli.
- Centrifugare la piastra a 300 x g per 30 s per far cadere tutte le batterie sul fondo della piastra 384 pozzetti.
Nota: Evitare urti alla piastra dopo la semina delle cellule. In caso contrario, le cellule saranno schiacciate in un angolo di ciascun pozzetto e la piastra non sarà adatta per l'imaging ad alto contenuto. - Incubare la piastra 384 pozzetti a 37 ° C con 5% CO2 per 3 h per le cellule da fissare alla parte inferiore della piastra.
3. il trattamento delle cellule con composti
- Generare una mappa di piastra con condizioni di trattamento come mostrato nella Figura 2.
- Preparare 300 µ l di 5 x allestimenti da fino a 15 composti in una piastra a 96 pozzetti.
- Diluire 1 a 15 di cps con il medium di analisi per cinque volte di loro concentrazioni finali nei pozzetti A1 a G2 del 96-pozzo piastra (Figura 2A). Aggiungere 300 µ l di medium di analisi ben H2.
Nota: La concentrazione finale di ciascun composto è utilizzata alla concentrazione più efficace per il salvataggio il trasporto della rodopsina P23H da HTS12,13. - Aggiungere 100 µ l per pozzetto di 2% di dimetilsolfossido (DMSO) e 25 µM 9 -cis-retinale che vengono diluiti in medium di analisi alle colonne 11 e 12, rispettivamente. Aggiungere 9 -cis-retinico in penombra.
- Diluire 1 a 15 di cps con il medium di analisi per cinque volte di loro concentrazioni finali nei pozzetti A1 a G2 del 96-pozzo piastra (Figura 2A). Aggiungere 300 µ l di medium di analisi ben H2.
- Aggiungere 10 µ l di 5 x funzionamento soluzioni alla piastra 384 pozzetti coltivati con le cellule (Figura 2B).
- Utilizzare una pipetta elettronica multi-canale per aggiungere composti 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 15 a riga A, C, E, G, I, K, M e O da colonne 1 a 21 (Figura 2). Aggiungere composti 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e M a righe B, D, F, H, J, L, N e P da 1 a 21 di colonne.
- Aggiungere 10 µ l di 2% DMSO alle colonne 22 e 24. Aggiungere 10 µ l per pozzetto di 25 µM 9 -cis-retinico a colonna 23.
Nota: DMSO è usato come un controllo del veicolo perché tutti i composti sono inizialmente dissolto in DMSO come scorte. Colonna 22 contenente DMSO trattato cellule esprimendo il P23H rodopsina viene utilizzato come il controllo di 0%. 9 -Cis-retiniche cellule trattate esprimendo la rodopsina P23H viene utilizzato come il controllo al 100%.
- Coprire la piastra 384 pozzetti con carta stagnola e incubare la piastra a 37 ° C per 24 h.
4. Immunostaining senza permeabilizzazione della membrana a macchiare Rhodopsin proteine sulla superficie delle cellule.
Nota: Evitare qualsiasi detergente nel processo intero immunostaining per mantenere intatta la membrana cellulare.
- Preparare 4% paraformaldeide (PFA) diluendo il 16% PFA con PBS in un rapporto di 1:4 volume in una cappa chimica. Trasferire il 4% PFA in un serbatoio di reagente.
- Prendere la piastra 384 pozzetti in una stanza buia con luce fioca rosso. Usare un aspiratore 8 canali collegato ad un recipiente di raccolta vuoto per aspirare delicatamente il mezzo. Utilizzare una pipetta elettronica multicanale per aggiungere 20 µ l di preparate 4% PFA per l'intera piastra 384 pozzetti e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Per evitare il distacco delle cellule, sempre scegliere le punte dell'aspiratore stesso lato di ciascun pozzetto durante le aspirazioni. Non toccare l'area inferiore centrale di ciascun pozzetto. Quando si scattano immagini, selezionare i campi da evitare la regione toccata dall'aspiratore. Più di 10 min di incubazioni prolungate, coprire la piastra 384 pozzetti con il suo coperchio per evitare l'evaporazione.
Nota: Le cellule sono fissate in una stanza buia per evitare photobleaching della isorhodopsin rigenerato che influenzerà il risultato del controllo 100%. Dopo la fissazione, la piastra 384 pozzetti può essere stipulata sotto luce normale. - Utilizzare un aspiratore 8 canali per aspirare il PFA in ciascun pozzetto e utilizzare una pipetta elettronica multi-canale per aggiungere 50 μL per pozzetto di PBS. Ripetere altre due volte per eseguire tre lavaggi con PBS.
Attenzione: I rifiuti liquido contenente PFA sono raccolto in una bottiglia con un massimo di ed è essere smaltiti come rifiuti chimici pericolosi dopo l'esperimento. - Bloccare le cellule con l'aggiunta di 20 µ l di siero di capra del 5% per l'intera piastra 384 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
- Aspirare il siero di 5% capra e aggiungere 15 µ l di 20 µ g mL-1 B6-30 anti-rodopsina anticorpo nel siero di capra 1% a riga A per O. aggiungere 15 µ l di siero di capra 1% alla riga P per il gruppo di controllo solo anticorpo secondario.
- Incubare la piastra 384 pozzetti a temperatura ambiente per 90 min o a 4 ° C durante la notte. Coprire la piastra 384 pozzetti con carta stagnola per evitare photobleaching di fluorophores.
- Lavare la piastra 3 volte con 50 µ l per pozzetto di PBS.
- Aspirare la PBS e aggiungere 15 µ l di anticorpo IgG anti-topo di 5 µ g mL-1 Cy3-coniugati. Coprire la piastra 384 pozzetti con carta stagnola e incubare a temperatura ambiente per 1 h o a 4 ° C durante la notte.
- Lavare la piastra 3 volte con 50 µ l per pozzetto di PBS. Aggiungere 50 µ l di PBS contenente 1 µ g mL-1 Hoechst 33342 a macchiare i nuclei a temperatura ambiente per 15 min.
- Sigillare la piastra 384 pozzetti con una pellicola trasparente prima di formazione immagine. Coprire la piastra 384 pozzetti con foglio di alluminio e conservare a 4 ° C per fino ad una settimana, se le immagini sono prese immediatamente.
5.. di imaging
Nota: Questa procedura di imaging ad alto contenuto è adattata per il sistema di imaging elencato nella Tabella di materiale. Le procedure possono essere diverse se utilizza altri sistemi di imaging ad alto contenuto.
- Rimuovere il coperchio e inserire la piastra 384 pozzetti il riproduttore d'immagini ad alto contenuto con A1 posizionato nell'angolo sinistro superiore della piastra.
- Aprire il software di acquisizione immagini per impostare i parametri di acquisizione immagine.
- Aprire la finestra di Setup di acquisizione di piastra e creare nuova impostazione o caricare un file di installazione esistente.
- Selezionare l'obiettivo 20x e impostare Pixelbinning come 2, quindi la dimensione in pixel calibrato è 0,80 x 0,80 µm. impostare le linee di scansione come 2.000 e la dimensione dell'immagine (W x H) come 1.000 x 1.000 pixel (800,00 x 800.00 µm) per ogni sito.
- Selezionare il tipo di piastra da essere imaged. Utilizzare le informazioni fornite dal fabbricante della piastra 384 pozzetti per riempire le dimensioni del piatto.
- Selezionare i pozzetti siano imaged per la piastra 384 pozzetti.
- Selezionare quattro siti essere imaged per pozzetto. Evitare il lato del bene toccato dalle punte di aspirazione.
- Selezionare laser di eccitazione come 405, 488 e 561 nm. Selezionare i filtri di emissione per canali DAPI, FITC e Texas Red. Ottimizzare la potenza del laser e guadagni di ogni canale per assicurare la luminosità delle immagini scattate dai pozzetti di controllo positivo sono inferiore alla soglia di saturazione.
- Selezionare il pozzetto a altro attivo per l'autofocus. Selezionare il primo pozzo acquisito come l'iniziale bene per trovare i campioni. Impostare sito autofocus su tutti i siti.
- Selezionare quattro medie per riga per ogni canale. Ottimizzare il valore di Z-offset per ogni canale.
- Test 2-3 pozzi diagonale agli angoli della piastra ben 384 per assicurarsi che le immagini sono sul fuoco per tutti i pozzetti testati, immagini da tutti i siti per pozzetto hanno cellule con più di 40% confluenza e intensità di fluorescenza di tutti i canali sono circa la metà saturi nel 100% pozzetti di controllo.
- Salvare il metodo di acquisizione immagine.
- Eseguire l'intera piastra. Guarda l'imager fino al termine della cattura delle immagini dalla prima colonna della piastra per controllare la qualità dell'immagine prima di lasciare il dispositivo di imaging. Estrarre la piastra 384 pozzetti e conservare a 4 ° C per un uso futuro.
Nota: A seconda del numero di siti selezionati per bene e i canali di presa, ci vogliono 40 min a 3 h alla fine una piastra 384 pozzetti di imaging.
6. image Analysis.
- Estrarre i dati di immagine utilizzando un software di analisi di immagine ad alto contenuto. Selezionare uno dei pozzetti di controllo al 100% (colonna 23) per impostare i parametri.
- Selezionare la Lunghezza multi-d'onda cella segnando come metodo di analisi e iniziare a configurare le impostazioni.
- Definire i nuclei utilizzando immagini dal canale DAPI. Anteprima per assicurarsi che le forme di nuclei definiti nel selezionato bene si adatta bene con le immagini di nuclei.
- Definire la forma della cella nel canale FITC dove rodopsina-Venus è imaged.
- Definire le aree di macchia superficie cellulare rodopsina nel canale Texas Red.
- Prova l'algoritmo corrente in 5 pozzi per determinare se le impostazioni sono ottimizzate. Salvare le impostazioni e chiudere la finestra di configurazione .
- Eseguire tutti i pozzi con il metodo di analisi ottimizzata.
- Numero oggetto di esportazione come numero di cellule intatte. Esportare l' Intensità media del canale FITC come intensità di Rhodopsin-Venus (Venus Rhodopsin INT). Esportare l' Intensità media del canale Texas Red come intensità di rodopsina sulla superficie delle cellule (Rhodopsin INT sulla superficie delle cellule).
- Aprire i dati esportati in un software di foglio di calcolo. Dividere l'intensità di rodopsina sulla superficie delle cellule per il rodopsina-Venus INT come rapporto MEM totale. Calcolare la Z'-fattori per ogni parametro valutare la qualità di analisi. Z′ = 1−3X (STDcontrollo 100%+STD0% controllo) / | Intende ilcontrollo al 100%−Mean0% controllo|.
Nota: Un Z'-fattore superiore a 0 indica un dosaggio moderato sufficiente per uno schermo ad alto contenuto e un Z' fattore compreso tra 0,5 e 1 suggerisce un eccezionale test richiesto per un alto-rendimento schermo20,21. - Utilizzare il software di foglio di calcolo per generare una mappa di calore di due colori per ogni parametro. Organizzare il nome di linee cellulari sull'asse x e i composti sull'asse y.
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Representative Results
Abbiamo caratterizzato il trasporto di rodopsina con tre parametri: l'intensità della rodopsina-Venus in tutta la cella (Rhodopsin-Venus INT.), l'intensità di immunostaining del rhodopsin sulla membrana plasmatica (Rhodopsin INT sulla superficie delle cellule) ed il rapporto di rodopsina macchia sulla superficie delle cellule per intensità di rodopsina-Venus in tutta la cella (rapporto tra MEM-totale). Un risultato rappresentativo del dosaggio trasporto rodopsina è mostrato in Figura 3 e Figura 4. Usando DMSO e 9 -cis-retinico trattati cellule che esprimono il P23H-rodopsina-Venus come 0 e 100% controlli, rispettivamente, la Z'-fattori per questi tre parametri sono nella gamma fra 0-0,5, suggerendo che il saggio ha qualità moderata, sufficiente per imaging ad alto contenuto21. Anche se la Z ottimizzata '-fattori sono inferiori a 0,5 a causa della sua relativamente complesse procedure rispetto ad un dosaggio HTS, questo test è ancora robusto e affidabile per un'analisi basata sull'immagine. Un composto attivo che salva una rodopsina misfolded dovrebbe mostrare valori più elevati di Rhodopsin INT sulla superficie delle cellule e il rapporto di MEM-totale di DMSO, con un valore di P inferiore a 0,05. Tre mappe di calore 2-D sono state generate da questi tre parametri per confrontare l'importo medio rodopsina e localizzazione per cella (Figura 4). Ripetuto in triplici copie, WT e sei rodopsina mutanti sono elencati in senso orizzontale e verticale sono confrontati gli effetti dei trattamenti composti. In accordo con studi precedenti, la rodopsina INT sulla superficie delle cellule e il rapporto tra MEM-totale sono inferiori per i sei mutanti rispetto alla rodopsina WT trattata con DMSO (Figura 4)5,22,23. La rodopsina INT sulla superficie delle cellule e il suo rapporto di MEM totale sono aumentati di 9 -cis-retinico trattamento per il T4R, P23H, D190N e P267L, ma non i mutanti P53R o C110Y, suggerendo che 9 -cis-retinale Salva il trasporto di T4R, P23H, D190N e P267L mutanti di rodopsina. Tutti i CP ha mostrato diversi livelli di aumento in INT Rhodopsin sulla superficie delle cellule per T4R, P23H e D190N. CPS 3, 4, 5, 7, 8 e 11 aumentato la rodopsina-Venus INT ma non il rapporto di MEM totale di questi mutanti di rodopsina, suggerendo che questi composti solo aumentato la quantità di rodopsina. CPS 1, 2 6 e 9 ha aumentato significativamente il rapporto di MEM totale di mutanti di rodopsina T4R, P23H, D190N e P267L, suggerendo che questi composti salvare il trasporto di questi mutanti di rodopsina alla membrana plasmatica. I profili 2D forniscono una panoramica completa di rodopsina trasporto interessato da queste mutazioni adRP associati che sono mitigate dal diverso trattamento farmacologico.
Figura 1: flusso di lavoro del dosaggio trasporto rodopsina. Procedure per la marcatura di superficie delle cellule del rhodopsin senza permeabilizzazione della membrana per il dosaggio di trasporto rodopsina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: illustrazioni per la preparazione di soluzioni per il lavoro e il trasferimento di liquidi dalla piastra 96 pozzetti alla piastra 384 pozzetti: 5x. (A) il layout di piastra a 96 pozzetti del 5 x soluzioni di lavoro. Pozzetti A1 a G2 avere 300 µ l per pozzetto di fino a 15 5 x soluzioni funzionanti e medium di analisi (M), come illustrato nelle colonne 1 e 2. Composti, 14 e 15 sono 2% DMSO e 25 µM 9 -cis-retinico, rispettivamente, per il trattamento alle linee sette cellulari esprimendo WT e mutante rodopsina. Inoltre, colonne 11 e 12 hanno 100 µ l per pozzetto di 2% DMSO e 25 µM 9 -cis-retinale controlla, rispettivamente, trattati con le cellule che esprimono la rodopsina P23H per il calcolo di Z'-fattori. (B) il layout di piastra 384 pozzetti per condizioni di tipo e trattamento delle cellule. Le cellule di U2OS esprimendo il WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N e P267L rodopsina-Venus sono seminati come illustrato. Condizioni di trattamento sono contrassegnate in blu. Rosa e blu punte dimostrano il trasferimento di liquidi Pozzetto a altro dalla piastra 96 pozzetti alla piastra 384 usando una pipetta multicanale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: immagini rappresentative e quantificazioni per i controlli del dosaggio trasporto rodopsina. (A) Venus fluorescenza (verde) e immunostaining superficie cellulare (rosso) di U2OS cellule esprimenti WT o P23H rodopsina-Venus trattati con DMSO o 5 µM 9 -cis-retinale. Barra della scala = 200 µm. (B) A colonna trama di intensità media del Venus per cella che rappresenta quantità di rodopsina nella cella intera (INT Rhodopsin-Venus). p< 0,0001. Z'-factor è mostrato sotto la linea nera. Barra di errore e il valore di colonna sono nella media e deviazione standard (S.D.) di 16 replicati, rispettivamente. Trama di colonna (C) un di dire Cy3 intensità per ogni cella che rappresenta la rodopsina macchiata sulla superficie delle cellule (Rhodopsin INT sulla superficie delle cellule). (D) una trama di colonna del rapporto di intensità media cy3 per cella a significare intensità Venus per cella che rappresenta il rapporto tra livello di rodopsina sulla superficie delle cellule al suo livello di cellule intere (rapporto di MEM totale). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: un'analisi ad alto contenuto rappresentativa del dosaggio trasporto rodopsina indicato come 2-colore calore maps. (A) la mappa termica di dire intensità Venus per cella che rappresenta il livello di cellule intere rodopsina (INT Rhodopsin-Venus). Ogni blocco rappresenta un punto dati e ogni condizione è stato testato in triplicato. Legenda dei colori è mostrata a sinistra. CP, composti. (B) la mappa termica di dire Cy3 intensità per ogni cella che rappresenta la rodopsina macchiata sulla superficie delle cellule (Rhodopsin INT sulla superficie delle cellule). (C) la mappa di calore di media intensità di Cy3 per cella alla media intensità di Venus per cella che rappresenta il rapporto tra livello di rodopsina sulla superficie delle cellule al suo livello di cellule intere (rapporto di MEM totale). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, abbiamo mostrato un test di imaging ad alto contenuto utilizzato per la caratterizzazione di colpi identificati da un HTS L'automazione solo coinvolti in questi protocolli è il dispositivo di imaging ad alto contenuto. Il immunostaining e formazione immagine di fluorescenza del rhodopsin sono stati utilizzati comunemente per caratterizzare la localizzazione di rodopsina5,14,15,16. Tuttavia, la quantificazione delle immagini scattate dai tradizionali metodi di formazione immagine è limitata dalla mancanza di sufficienti immagini di cella per condizione, bassa capacità di immagini per esperimento e la mancanza di un parametro di controllo di qualità. Abbiamo adattato il protocollo tradizionale immunostaining nel formato 384 pozzetti e sostituito l'imaging tradizionale con imaging ad alto contenuto. Usando questo protocollo di imaging ad alto contenuto, correttamente selezionato e caratterizzato le attività di colpi identificati da un HTS11,13,17. Rispetto al tradizionale immunostaining e metodi di formazione immagine, questo protocollo ha aumentato significativamente la consistenza della condizioni di imaging, imaging capacità e potenza di analisi di immagine, che ci ha permesso di confrontare quantitativamente gli effetti farmacologici di 11 composti verso il trasporto di sei adRP associato mutanti di rodopsina.
Le principali modifiche del presente protocollo rispetto ai protocolli usati in precedenza per immunostaining rodopsina e imaging sono: (1) cellule in crescita e immunostaining in una piastra di 384 pozzetti clear-inferiore; (2) imaging celle utilizzando un imager ad alto contenuto; e (3) analisi dei dati con un software di analisi ad alto contenuto di immagine. A causa di questi cambiamenti, un'ottimizzazione iniziale è necessaria per trovare il miglior numero di semina delle cellule, concentrazioni anticorpali, condizioni di imaging e algoritmi di analisi di immagine.
I passaggi critici del protocollo includono: (1) semina di cellule che permettono la confluenza di 50-70% prima della fissazione; (2) aspirazioni attenzione per evitare il distacco delle cellule; (2) diversi pozzi di imaging attraverso tutta la piastra per assicurarsi che le immagini sono il fuoco e reagiscono in di tutti i canali non superi la metà della soglia di imager per i pozzetti di controllo positivo prima dell'imaging di tutta la piastra; e (3) mantenendo la Z'-fattore superiore a 0 per garantire l'affidabilità del test.
I problemi più comuni che potrebbero essere rilevati per questo protocollo sono distacco cellulare e basso Z'-fattori. Per evitare il problema primo, pretrattare la piastra 384 pozzetti con poli-L-lisina per facilitare il collegamento delle cellule ed evitare di utilizzare linee cellulari che si staccano facilmente come le cellule Hek293. Inoltre, limitare il puntale di aspirazione per toccare un solo lato di ciascun pozzetto durante l'aspirazione e selezionare l'altro lato di ciascun pozzetto per l'imaging. Per migliorare la Z'-fattore e la qualità di analisi, ottimizzare la semina parametri di analisi per numero e immagine per assicurarsi che la forma delle cellule o nuclei definita dal software si adatta bene con ogni oggetto in ogni canale di fluorescenza cellulare.
Rispetto ad altri metodi per quantificare trasporto rodopsina, ad esempio una ELISA di superficie delle cellule, o un'analisi di complementazione frammento di β-galattosidasi, che consente di calcolare il livello di proteina bersaglio sulla superficie delle cellule in tutte le cellule, questo metodo di imaging ad alto contenuto quantifica livello medio della proteina per cella; e, questa caratteristica unica evita un fattore di variazione critico, il numero di cellulare che colpisce le letture finali in altri metodi. Inoltre, a causa del grande numero di cellule imaged e quantificata con il metodo di imaging ad alto contenuto, i parametri media da tutte le cellule per bene ha mostrato bassa variazione tra repliche, aggiungendo così l'affidabilità del test.
Una limitazione di questo protocollo è che non sono i migliori saggi per HTS, a causa della sua procedura relativamente complicata e il 2h per piastra tempo di imaging. Così, possiamo consigliare dosaggi reporter alternativi per lo screening di librerie di piccole molecole grandi con più di 5.000 composti e utilizzare questo protocollo di imaging ad alto contenuto per le analisi di caratterizzazione mirato limitate a meno di 100 composti. La seconda limitazione del presente protocollo è la sua mancanza di standard per mostrare se la fluorescenza di Venus o le intensità di fluorescenza di immunostaining sono in una correlazione lineare con la quantità di quantità di proteina rhodopsin per cella. Per evitare saturazione immunostaining, si consiglia di test e tracciare le intensità di immunostaining delle cellule incubate con differenti concentrazioni di anticorpi primari e secondari. Selezionare le concentrazioni di anticorpi all'interno della gamma lineare del cambiamento di fioritura.
In espansione dall'applicazione corrente, quantifichiamo trasporto rodopsina dalle immagini delle cellule transfettate transitoriamente con 28 mutanti di rodopsina diverse nell'ambito del trattamento con fino a 10 composti per generare un database farmacologico di questi composti' attività per l'orientamento di potenziali trattamenti per adRP pazienti portatori di queste mutazioni di rodopsina. Questo protocollo può anche essere facilmente adattato per i saggi di traslocazione di qualsiasi proteina di membrana di interesse che sarà utili per scoperte di droga di altre protein misfolding malattie.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Si ringraziano il Dr. Mark E. Schurdak e Università di Pittsburgh Drug Discovery Institute per fornire il dispositivo di imaging ad alto contenuto e corsi di formazione iniziale. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) ha generosamente condiviso la 1D4 e anticorpi anti-rodopsina B630. Il plasmide contenente il cDNA di mouse rodopsina-Venus costrutto è stato condiviso da Dr. Nevin Lambert (Università di Augusta). Questo lavoro è stato supportato dall'Istituto nazionale di sovvenzione di salute EY024992 a YC e P30EY008098 da grant Università di Pittsburgh Vision Research Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
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