Summary
Het doel van dit protocol is om aan te tonen hoe voor het opwekken van geclusterde stoma in zaadlobben van Arabidopsis thaliana zaailingen door onderdompeling behandeling met een suiker-bevattende middellange oplossing en hoe waarnemen van intracellulaire structuren zoals chloroplasten en microtubuli in de geclusterde guard cellen met behulp van confocale laser microscopie.
Abstract
Stomatal verkeer bemiddelt de gasuitwisseling plant, die essentieel is voor de fotosynthese en transpiratie. Stomatal te openen en te sluiten zijn bereikt door een aanzienlijke toename en afname guard cel volume, respectievelijk. Omdat shuttle vervoer van ionen en water tussen guard cellen en grotere naburige epidermale cellen tijdens stomatal beweging plaatsvindt, hebben de verdeelde verdeling van plant stoma wordt beschouwd als een optimale verdeling voor stomatal verkeer. Experimentele systemen voor storing veroorzaakt het verdeelde patroon van stoma zijn handig voor het onderzoeken van de spatiëring patroon van betekenis. Verschillende belangrijke genen die samenhangt met de verdeelde stomatal verdeling zijn geïdentificeerd en geclusterde stoma experimenteel kunnen worden opgewekt door een wijziging van deze genen. Als alternatief, geclusterde stoma kunnen ook worden veroorzaakt door exogene behandelingen zonder genetische modificatie. In dit artikel beschrijven we een eenvoudige induktie systeem voor geclusterde stoma in Arabidopsis thaliana zaailingen door onderdompeling worden behandeld als een sacharose-bevattende middellange oplossing. Onze methode is makkelijk en is rechtstreeks toepasselijk in transgene of mutant lijnen. Grotere chloroplasten worden gepresenteerd als een cel biologische keurmerk van sacharose-geïnduceerde geclusterde guard cellen. Bovendien, wordt een vertegenwoordiger van de confocal microscopische opname van corticale microtubuli weergegeven als een voorbeeld van intracellulaire observatie van geclusterde guard cellen. De radiale richting van corticale microtubuli is in geclusterde guard cellen zoals in verdeelde guard cellen in controlevoorwaarden gehandhaafd.
Introduction
De plant stoma is een essentieel orgaan voor gasuitwisseling voor fotosynthese en transpiratie en stomatal verkeer wordt bereikt door ingrijpende veranderingen in de guard cellen tot ion-gedreven opname- en release van water. Onder een Microscoop, kunnen we zien een patroon van de verdeelde distributie van stoma op de oppervlakken van bladeren en stengels. Deze verdeelde verdeling van stoma wordt beschouwd als om te helpen stomatal beweging, die wordt geregeld door ion en water uitwisseling tussen guard cellen en naburige epidermale cellen1,2. Experimentele inductie systemen voor geclusterde stoma zijn nuttig voor het onderzoek naar het belang van de verdeelde verdeling van stoma.
Er werd gemeld dat de ruimtelijke clustering van stoma kan worden opgewekt door genetische modificatie van essentiële genen voor guard cel differentiatie3,4 of behandeling met een chemisch samengestelde5. We ook gemeld dat onderdompeling behandeling met een middellange oplossing aangevuld met inbegrip van sacharose, glucose, suikers en fructose veroorzaakt stomatal clusters in de zaadlobben van Arabidopsis thaliana zaailingen6. Verminderde callose in nieuwe celwanden scheiden meristemoids en epidermale cellen in de epidermis van sacharose-behandelde zaadlob, suggereren dat sacharose oplossing onderdompeling behandeling negatief beïnvloedt de celwand, waardoor de lekkage werd waargenomen en ectopische actie van belangrijke genproducten voor guard celdifferentiatie (bijvoorbeeld transcriptiefactoren) naar aangrenzende epidermale cellen6. Een soortgelijk mechanisme werd voorgesteld van studies over gsl8/chor mutanten7,8. Onze experimenteel systeem voor reproduceerbare inductie van geclusterde stoma met behulp van sacharose-bevattende middellange oplossing is vrij eenvoudig en goedkoop. Het kan ook worden gebruikt om te onderzoeken van intracellulaire structuren zoals organellen en het cytoskelet in de geclusterde guard cellen wanneer toegepast op transgene lijnen uiten fluorescente markeringen dat etiket intracellulaire structuren9, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van 3% Sucrose-bevattende 1/2 Murashige-Skoog middellange-oplossing
- 1.1 g Murashige-Skoog middellange zouten en 15 g van sacharose toevoegen aan een bekerglas.
- Voeg 490 mL gedestilleerd water toe en meng goed met een roer-bar.
- Breng de pH op 5.8 met behulp van KOH.
- Verdun met gedestilleerd water tot 500 mL en breng de oplossing kwantitatief over in een middelgrote fles.
- De oplossing steriliseren in autoclaaf (121 ° C, 20 min). Indien niet onmiddellijk wordt gebruikt, kan deze oplossing na sterilisatie bij 4 ° C worden bewaard.
2. de inductie van geclusterde stoma door Sucrose-bevattende middellange oplossing onderdompeling behandeling
- Het steriliseren van de zaden.
- Bereid de sterilisatie-oplossing door het toevoegen van 500 µL van 5% actief chloor NaClO oplossing en 1 µL van 10% Triton X-100 tot 500 µL steriel water.
- Plaats ca. 50 transgene A. thaliana zaden uitvoering een fluorescerende marker zoals CT-GFP11 of GFP-TUB612 in een 1.5-mL-buis.
- Voeg 1 mL oplossing van 70% ethanol en meng goed door vijf keer omkeren. Verlof voor 1 min.
- De zaden zullen zinken naar de bodem van de buis. Op een schone bankje, zachtjes verwijderen van de 70%-ethanol met behulp van een micropipet, en voeg 1 mL van sterilisatie oplossing. Meng goed door het omkeren van de vijf keer en laat gedurende 5 min.
- Wassen van de zaden. Nog steeds werken onder aseptische condities op een schone bankje, zachtjes verwijderen de oplossing om met een micropipet en voeg 1 mL steriel water. Herhaal deze stap vijf keer.
- Voeg 1,5 mL van gesteriliseerde 3% sucrose-bevattende 1/2 Murashige-Skoog middellange-oplossing aan elk putje van de plaat van een 24-well op een schone bankje.
- Voeg twee gesteriliseerde zaden in elk putje. Tape de deksel op het bord van de 24-well met behulp van twee lagen van parafilm.
- De 24-well plaat overbrengen in een groei kamer set bij 23.5 ° C met een 12-h/12-h licht-donker cyclus met gebruikmaking van 100 µmol m−2 s−1 wit licht en incubeer gedurende 14 dagen.
3. de microscopische observatie van geclusterde stoma
- Plaats 30 µL van 3% sucrose-bevattende 1/2 Murashige-Skoog middellange-oplossing van een putje van de plaat 24-well in het midden van een glasplaatje (grootte: 76 × 26 mm, dikte: 1.0-1.2 mm).
- Verwijder een zaadlob uit een zaailing van de 14-dagen oude met behulp van ontleden schaar. De zaadlob drijven met de waarneming zijde naar boven op de daling van de oplossing.
- Bereiden de zaadlob specimen volgens onze vorige methode13. In wezen, het plaatsen van 30 µL van de oplossing in het midden van een glas cover (grootte: 18 × 18 mm, dikte: 0.12-0.17 mm). De glazen deksel ondersteboven en plaats deze op de zaadlob zachtjes. Veeg overtollige buffer met behulp van een pluisvrije weefsel.
- Stel een specimen op het podium van een Microscoop confocale laser en selecteer van geclusterde guard cellen voor observatie met behulp van lichte veld verlichting.
- Confocale beelden van fluorescently geëtiketteerde intracellulaire structuren volgens de instructies van de fabrikant van de Microscoop te verwerven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier, heeft het protocol voor een eenvoudige methode van inducerende stomatal clustering met sacharose-bevattende middellange oplossing in A. thaliana zaailingen voorgelegd. De geclusterde guard cellen gekweekt in sacharose-bevattende middellange oplossing (Figuur 1B) hebben grotere chloroplasten dan guard cellen gekweekt in sacharose-vrije controlevoorwaarden(Figuur 1). De uitbreiding van chloroplasten werd bevestigd met CT-GFP11, een chloroplast stroma marker en chlorofyl autofluorescence (Figuur 1C-F), wat suggereert dat sacharose behandeling resulteerde in zetmeel graan accumulatie in het Chloroplasten via sacharose oplossing opname. Confocal observatie van GFP-TUB612 bleek bovendien dat corticale microtubuli radiaal georiënteerde zelfs in sacharose behandeld geclusterde guard cellen, zoals die in verdeelde guard cellen in sacharose-vrije controlevoorwaarden (Figuur 2). Deze opmerkingen suggereren dat de sacharose-geïnduceerde geclusterde guard cellen een normale oriëntatie voor corticale microtubuli en cellulose microvezels hebben om stomatal opening in antwoord op het milieu signalen9.
Figuur 1 : Chloroplasten in geclusterde guard cellen behandeld met middellange oplossing saccharose-bevattende. Helder veld (A, B), chloroplast stroma marker CT-GFP (C, D)en chlorofyl autofluorescence (E, F) beelden van guard cellen gekweekt in suikervrij voorwaarden (A, C, E) en 3% sacharose controlevoorwaarden (B, D, F). Schaal bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Corticale microtubuli in geclusterde guard cellen behandeld met sacharoseoplossing. Corticale microtubuli geëtiketteerd met GFP-TUB6 van guard cells in de suiker-vrije controle (A) en geclusterde guard cellen in 3 gewichtspercenten sacharose voorwaarden (B). Schaal bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protocollen voor inductie van geclusterde stoma hebben in A. thaliana zaailingen wij gepresenteerd door onderdompeling worden behandeld als een sacharose-bevattende middellange oplossing. Zoals u hier ziet, deze methode is zeer eenvoudig en vereist geen speciale vaardigheid maar efficiënt geclusterde stoma kan veroorzaken. Meer dan 45 gewichtspercenten guard cellen zijn geclusterd met 3% sucrose-bevattende middellange oplossing (gemiddelde waarden van meer dan 20 onafhankelijke waarnemingen)6. Bovendien, dit experimenteel systeem rechtstreeks kan worden toegepast op transgene of mutant lijnen zoals voor transgene lijnen uiting van CT-GFP (Figuur 1) of GFP-TUB6 (Figuur 2). Hoewel alleen momentopname afbeeldingen hier weergegeven worden, zou het ook mogelijk om uit te voeren tijd-sequentiële waarnemingen tijdens de ontwikkeling van de stomatal.
Merk op dat deze methode is gebaseerd op een kunstmatige exogeneous behandeling, zodat we niet uitsluiten van de mogelijkheid die verschijnselen die niet rechtstreeks zijn gerelateerd aan de stomatal verdeling worden veroorzaakt door sacharose oplossing onderdompeling behandeling. In feite, worden guard cel chloroplasten vergroot door de behandeling (Figuur 1). Dit kan te wijten zijn aan zetmeel graan accumulatie in de chloroplasten via sacharose oplossing opname. Daarnaast werd een kleinere stomatal diafragma in de sacharose-geïnduceerde geclusterde guard cellen9, suggereren dat sacharose-gemedieerde hyperosmotic stress stomatal opening onderdrukt waargenomen. Toch bleef de radiale richting van corticale microtubuli (Figuur 2). Bovendien verhoogt het stomatal diafragma van de geclusterde guard cellen aanzienlijk in reactie op fusicoccin behandeling, zoals in het geval van verdeelde stoma9. Dus, hoewel het moeten zorgvuldig beoordelen men zal of deze experimentele modelsysteem handig afhankelijk van uw onderzoeksdoeleinden is, ons systeem zou inzichtelijke informatie verstrekken over relatie tussen stomatal distributie en respons.
Zoals vermeld in de inleiding, suiker oplossing behandeling mogelijk verkleinen de integriteit van de celwand, waardoor lekkage van belangrijke genproducten voor stomatal differentiatie (bijvoorbeeld transcriptiefactoren) naar aangrenzende epidermale cellen. Wij gaan ervan uit dat de sacharose-geïnduceerde ectopische lokalisatie van deze genproducten geclusterde stoma veroorzaakt. Deze werkhypothese is echter niet voldoende ondersteund door moleculaire biologische bewijs. Screening voor suiker-ongevoelig mutanten zou een veelbelovende manier om te verduidelijken van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan suiker oplossing-geïnduceerde stomatal clustering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar aan Prof. Seiichiro Hasezawa voor zijn vriendelijke ondersteuning van ons werk. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Society van Japan voor de promotie van wetenschap (JSPS) KAKENHgrant nummers 17K 19380 en 18 H 05492, van The Sumitomo Foundation een subsidie ontvangen voor elementaire wetenschap onderzoeksprojecten nummer 160146, en de Canon Stichting T.H. toekennen Dit experimenteel systeem werd ontwikkeld onder een financiële steun van de JSPS KAKENHgrant nummer 26891006 naar K. A. Wij danken Robbie Lewis, MSc, uit Edanz groep (www.edanzediting.com/ac) voor het bewerken van een ontwerp voor van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 - 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
- Bergmann, D. C., Sack, F. D.
- Pillitteri, L. J., Torii, K. U.
- Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
- Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).
- Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
- Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
- Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
- Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).
