Summary
Målet med detta protokoll är att demonstrera hur man framkalla klustrade stomata i hjärtbladen Arabidopsis thaliana plantor genom nedsänkning behandling med en sockerhaltiga medium lösning och hur man observerar intracellulära strukturer såsom kloroplaster och mikrotubuli i klustrade guard cellerna använder confocal laser mikroskopi.
Abstract
Stomatala rörelse förmedlar växten Gasa utbytet, som är nödvändig för fotosyntesen och transpiration. Stomatala öppning och stängning är fulländad vid en betydande ökning och minskning i guard cellvolym, respektive. Eftersom shuttle transport av joner och vatten uppstår mellan guard och större neighboring epidermala celler under stomatala rörelse, fördelade fördelningen av växten stomata betraktas som en optimal fördelning för stomatala rörelse. Experimentella system för störande fördelade mönstret av stomata är användbara för att undersöka avståndet mönstrets betydelse. Flera viktiga gener associerade med fördelade stomatala fördelningen har identifierats och klustrade stomata kan induceras experimentellt genom att förändra dessa gener. Alternativt, klustrade stomata kan också framkallas av exogena behandlingar utan att genetisk modifiering. I den här artikeln beskriver vi en enkel induktion system för klustrade stomata i Arabidopsis thaliana plantor genom nedsänkning behandling med en sackaros-innehållande medium lösning. Vår metod är lätt och direkt tillämpliga på transgena eller muterade linjer. Större kloroplaster presenteras som en cell biologiska kännetecken för sackaros-inducerad klustrade guard celler. Dessutom visas en representativ confocal mikroskopisk bild av kortikala mikrotubuli som ett exempel på intracellulära observation av klustrade guard celler. Den radiella riktningen av kortikala mikrotubuli bibehålls i klustrade guard celler som fördelade guard celler i villkor kontroll.
Introduction
Anläggningen stomi är ett viktigt organ för gasutbyte för fotosyntesen och transpiration och stomatala rörelse åstadkoms genom betydande förändringar i guard cellerna till ion-driven upptag och utsläpp av vatten. I Mikroskop, kan vi observera en fördelade spridningsbild av stomata på ytbehandlar av blad och stjälkar. Denna fördelade distribution av stomata anses hjälpa stomatala rörelse, som regleras av ion och vatten utbyte mellan guard celler och angränsande epidermala celler1,2. Experimentell induktion system för klustrade stomata är användbara för att undersöka betydelsen av fördelade fördelningen av stomata.
Det har rapporterats att spatial klustring av stomata kan induceras av genetisk modifiering av viktiga gener för vakt cell differentiering3,4 eller behandling med en kemisk förening5. Vi rapporterade också att nedsänkning behandling med en medellång lösning kompletteras med sockerarter inklusive sackaros, glukos och fruktos orsakade stomatala klustring i hjärtbladen Arabidopsis thaliana plantor6. Minskad callose i nya cellväggar som skiljer meristemoids och epidermala celler observerades i sackaros-behandlade cotyledon epidermis, vilket tyder på att sackaros lösning nedsänkning behandling negativt påverkar cellväggen, vilket förhindrar läckage och ektopisk åtgärd av nyckel genprodukter för vakt celldifferentiering (e.g. transkriptionsfaktorer) mot intilliggande epidermala celler6. En liknande mekanism föreslogs från studier på gsl8/chor mutanter7,8. Våra experimentella system för reproducerbara induktion av klustrade stomata använder sackaros-innehållande medium lösning är ganska lätt och billigt. Det kan också användas för att undersöka intracellulära strukturer såsom organeller och cellskelettet i klustrade guard cellerna när de appliceras på transgena linjerna uttrycker fluorescerande markörer att etiketten intracellulära strukturer9, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av 3% sackaros-innehållande 1/2 Murashige-Skoog Medium lösning
- Lägga till 1,1 g Murashige-Skoog medium salter och 15 g sackaros i en bägare.
- Lägg till 490 mL destillerat vatten och blanda väl med en uppståndelse bar.
- Justera pH-värdet till 5,8 med KOH.
- Späd med destillerat vatten till 500 mL och överför lösningen till en medelstor flaska.
- Sterilisera lösningen i autoklav (121 ° C, 20 min). Inte används omedelbart, kan denna lösning förvaras vid 4 ° C efter sterilisering.
2. induktion av klustrade Stomata av sackaros-innehållande Medium lösning nedsänkning behandling
- Sterilisera frön.
- Bereda sterilisering lösning genom att lägga till 500 µL 5% aktivt klor NaClO lösning och 1 µL 10% Triton x-100 till 500 µL sterilt vatten.
- Placera ca. 50 transgena A. thaliana frön bär en fluorescerande markör såsom CT-GFP11 eller GFP-TUB612 i ett 1,5 mL rör.
- Tillsätt 1 mL 70% etanol lösningen och blanda väl genom att invertera fem gånger. Låt verka i 1 min.
- Fröna kommer att sjunka till botten av röret. På en ren bänk, försiktigt bort 70% etanol med hjälp av en mikropipett och tillsätt 1 mL av sterilisering lösning. Blanda väl genom att invertera fem gånger och låt verka i 5 min.
- Tvätta frön. Fortfarande arbetar under aseptiska förhållanden på en ren bänk, försiktigt bort lösningen med en mikropipett och tillsätt 1 mL sterilt vatten. Upprepa fem gånger.
- Tillsätt 1,5 mL steriliserat 3% sackaros-innehållande 1/2 Murashige-Skoog medium lösning till varje brunn 24-well platta på en ren bänk.
- Tillsätt två steriliserade frön i varje brunn. Tejpa locket på 24-väl plattan med två lager av parafilm.
- Överföra 24-väl plattan till en tillväxt kammare vid 23,5 ° C med en 12-h/12-h ljus-mörker cykel med 100 µmol m−2 s−1 vita ljus och inkubera i 14 dagar.
3. mikroskopisk Observation av klustrade Stomata
- Plats 30 µL 3% sackaros-innehållande 1/2 Murashige-Skoog medium lösning från en brunn av 24-väl plattan på mitten av en glasskiva (storlek: 76 x 26 mm, tjocklek: 1,0-1,2 mm).
- Ta bort en cotyledon från en 14-dag-gammal planta med dissekera sax. Flyta cotyledon med observation vänd på det lösning droppa.
- Förbereda cotyledon provexemplaret enligt vår tidigare metod13. I huvudsak, placera 30 µL av lösningen på mitten av en skyddsglaset (storlek: 18 x 18 mm, tjocklek: 0,12-0,17 mm). Vänd täckglaset upp och ned och placera den på cotyledon försiktigt. Torka bort överflödigt buffert med en luddfri vävnad.
- Ange ett exemplar på scenen av confocal laser Mikroskop och välj klustrade guard celler för observation med ljusa fält belysning.
- Förvärva confocal bilder av fluorescently märkta intracellulära strukturer enligt Mikroskop tillverkarens anvisningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här, har i protokollet för en enkel metod för att inducera stomatala klustring med sackaros-innehållande medium lösning i A. thaliana plantor presenterats. Klustrade guard cellerna odlas i sackaros-innehållande medium lösning (figur 1B) har större kloroplaster än vakt celler odlas i sackaros-fri kontroll villkor (figur 1A). Utvidgningen av kloroplaster bekräftades med CT-GFP11, kloroplast stroma markör och klorofyll autofluorescens (figur 1C-F), vilket tyder på att sackaros behandling resulterade i stärkelse korn ackumulering i den kloroplaster via sackaros lösning upptag. Dessutom avslöjade confocal observation av GFP-TUB612 att kortikala mikrotubuli orienterades radiellt även i sackaros-behandlade klustrade guard celler, som de i fördelade guard celler i sackaros-fri kontrollförhållanden (figur 2). Dessa observationer tyder på att sackaros-inducerad klustrade guard cellerna har en normal rörelseorientering för kortikala mikrotubuli och cellulosa microfibrils att aktivera stomatala öppning i svar till miljömässiga cues9.
Figur 1 : Kloroplaster i klustrade guard celler behandlas med sackaros-innehållande medium lösning. Ljusa fält (A, B), kloroplast stroma markör CT-GFP (C, D)och klorofyll autofluorescens (E, F) bilder av vakt celler odlas i villkor utan socker kontroll villkor (A, C, E) och 3% sackaros (B, D, F). Skala barer = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Kortikala mikrotubuli i klustrade guard celler behandlas med sackaroslösning. Kortikala mikrotubuli märkt med GFP-TUB6 av guard cells i sockerfritt kontroll (A) och klustrade guard celler i 3% sackaros villkor (B). Skala barer = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har lagt fram protokoll för induktion av klustrade stomata i A. thaliana plantor genom nedsänkning behandling med en sackaros-innehållande medium lösning. Såsom visas här, denna metod är mycket enkel och kräver inga specialiserade skicklighet men effektivt kan inducera klustrade stomata. Mer än 45% av vakt celler är grupperade med 3% sackaros-innehållande medium lösning (medelvärdena för mer än 20 oberoende observationer)6. Dessutom kan detta experimentella system tillämpas direkt på transgena eller muterade linjer som visas för transgena linjerna uttrycker CT-GFP (figur 1) eller GFP-TUB6 (figur 2). Även om endast stillbilder visas här, skulle det också vara möjligt att utföra tid-sekventiella observationer under stomatala utveckling.
Observera att denna metod är baserad på en konstgjord främmande behandling, så vi inte kan utesluta möjligheten att fenomen som inte är direkt relaterade till stomatala fördelningen orsakas av sackaros lösning nedsänkning behandling. I själva verket förstoras guard cell kloroplaster genom behandling (figur 1). Detta kan bero på stärkelse korn ackumulering i kloroplaster via sackaros lösning upptaget. Dessutom observerades en mindre stomatala bländare i sackaros-inducerad klustrade guard celler9, vilket tyder på att sackaros-medierad hyperosmotisk stress undertryckta stomatala öppning. Dock bibehölls den radiella riktningen av kortikala mikrotubuli (figur 2). Dessutom ökar stomatala bländaren på klustrade guard cellerna markant i svar på fusicoccin behandling, som i fallet med fördelade stomata9. Således, även om det blir nödvändigt att noggrant bedöma om detta experimentellt modellsystem är användbara beroende på din forskningsändamål, vårt system skulle ge insiktsfull information om förhållandet mellan stomatala fördelningen och svar.
Som nämnts i inledningen, kan socker lösning behandling minska cellväggen integritet, vilket resulterar i läckage av nyckel genprodukter för stomatala differentiering (e.g. transkriptionsfaktorer) till angränsande epidermala celler. Vi antar att sackaros-inducerad ektopisk localizationen av dessa genprodukter orsakar klustrade stomata. Denna arbetshypotes stöds dock inte tillräckligt av molekylär biologiska bevis. Screening för socker-okänsliga mutanter skulle vara ett lovande sätt att klarlägga de molekylära mekanismerna bakom socker lösning-inducerad stomatala klustring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Prof. Seiichiro Hasezawa för hans vänliga stöd av vårt arbete. Detta arbete stöds av bidrag från Japan Society för att främjande av vetenskap (JSPS) KAKENHgrant nummer 17K 19380 och 18 H 05492, från Sumitomo Foundation för ett bidrag för grundläggande forskningsprojekt bevilja nummer 160146 och Stiftelsen för Canon T.H. Detta experimentella system utvecklades under en ekonomiskt stöd från JSPS KAKENHgrant nummer 26891006 till K. A. Vi tackar Robbie Lewis, MSc, från Edanz-gruppen (www.edanzediting.com/ac) för att redigera ett utkast av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 - 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
- Bergmann, D. C., Sack, F. D.
- Pillitteri, L. J., Torii, K. U.
- Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
- Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).
- Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
- Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
- Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
- Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).
