Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא כדי להדגים כיצד לגרום הפיוניות באשכולות בפסיגי הזרע של שתילים תודרנית לבנה על ידי טיפול טבילה עם פתרון בינוני המכילים סוכר וכיצד להתבונן מבנים תאיים כגון מהכלורופלסט microtubules בתאי המשמר באשכולות באמצעות קונאפוקלית לייזר מיקרוסקופ.
Abstract
התנועה stomatal שמתווכת חילוף הגזים צמח, אשר חיוני פוטוסינתזה ועל דיות. פתיחה וסגירה stomatal מוכשרות על ידי עלייה משמעותית או להקטין את נפח התאים משמר, בהתאמה. בגלל הסעה של יונים, מים מתרחשת בין משמר תאים גדול יותר התאים באפידרמיס הסמוכים במהלך התנועה stomatal, התפלגות במרווחים של הפיוניות הצמח נחשב של התפלגות אופטימלית עבור התנועה stomatal. מערכות ניסיוני perturbing התבנית במרווחים של הפיוניות שימושיים לבחון את המשמעות של התבנית המרווח. זוהו מספר גנים מרכזיים המשויכת להתפלגות stomatal במרווחים, הפיוניות clustered יכולה להיגרם השפעול על ידי שינוי גנים אלה. לחלופין, הפיוניות clustered יכולה גם להיגרם על ידי טיפולים אקסוגני ללא שינוי גנטי. במאמר זה נתאר מערכת אינדוקציה פשוטה עבור הפיוניות באשכולות בשתילי תודרנית לבנה על ידי טיפול טבילה עם פתרון בינוני המכילים סוכרוז. השיטה שלנו היא קלה, ישירות החלים על קווים הטרנסגניים או מוטציה. מהכלורופלסט גדול מוצגים כמו סימן היכר התא הביולוגי של סוכרוז-induced תאי המשמר באשכולות. בנוסף, תמונת הנציגה מיקרוסקופיים קונאפוקלית של microtubules קורטיקלית מוצג בתור דוגמה של התבוננות תאיים תאי המשמר באשכולות. בכיוון רדיאלי microtubules קורטיקלית נשמרת בתאי המשמר באשכולות כמו תאי המשמר במרווחים בתנאי בקרה.
Introduction
סטומה רפואית הצמח הוא איבר חיוני עבור חילוף הגזים על פוטוסינתזה ועל דיות, תנועה stomatal מושגת על ידי שינויים משמעותיים בתאי המשמר דרך ספיגת מונחה יון ושחרור של מים. תחת מיקרוסקופ, ניתן להבחין דפוס הפצה במרווחים של הפיוניות של משטחי העלים והגבעולים. הפיזור במרווחים של הפיוניות נחשב כדי לעזור stomatal, תנועה מוסדר על ידי חילופי יון ומים בין תאי המשמר גובלות תאים אפידרמיס1,2. מערכות אינדוקציה ניסיוני הפיוניות באשכולות שימושיים חוקרים את החשיבות של ההתפלגות במרווחים של הפיוניות.
בעבר דווח כי קיבוץ באשכולות המרחבי של הפיוניות יכולה להיגרם על ידי שינוי גנטי של גנים מרכזיים משמר תא בידול3,4 או טיפול עם תרכובת כימית5. אנחנו גם דיווח כי טיפול טבילה עם פתרון בינוני בתוספת סוכרים כולל סוכרוז, גלוקוז, פרוקטוז גרם stomatal קיבוץ באשכולות בפסיגי הזרע של תודרנית לבנה שתילים6. Callose מופחת בקירות התא החדש הפרדת meristemoids תאים אפידרמיס נצפתה האפידרמיס cotyledon שטופלו סוכרוז, רומז כי סוכרוז פתרון טבילה טיפול משפיעה באופן שלילי על דופן התא, המונע את בריחת ו פעולה חוץ רחמי של ג'ין מפתח מוצרים עבור השומר תאית התמיינות (למשל גורמי שעתוק) לכיוון סמוכים עוריות תאים6. מנגנון דומה הוצע ממחקרים על gsl8/chor מוטציות7,8. מערכת הניסוי שלנו עבור אינדוקציה לשחזור של הפיוניות באשכולות באמצעות פתרון בינוני המכילים סוכרוז הוא די קל וזול. זה יכול לשמש גם כדי לחקור מבנים תאיים כגון organelles, את שלד התא בתאי המשמר באשכולות כאשר חל על קווים הטרנסגניים לבטא פלורסנט סמני את תווית מבנים תאיים9, 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת 3% סוכרוז המכילה 1/2 Murashige-Skoog בינוני פתרון
- להוסיף 1.1 גרם של מלחי בינוני Murashige-Skoog ו- 15 גר' סוכרוז גביע.
- מוסיפים 490 מ ל מים מזוקקים ומערבבים היטב בעזרת בר מערבבים.
- להתאים את ה-pH ל 5.8 באמצעות קו.
- לדלל עד 500 מ"ל מים מזוקקים ולהעביר את הפתרון לתוך בקבוק בינוני.
- לחטא את הפתרון על-ידי autoclaving (121 מעלות צלזיוס, 20 דקות). אם לא משתמשים מיד, פתרון זה נשמרות ב 4 ° C לאחר עיקור.
2. אינדוקציה של הפיוניות באשכולות מאת המכילים סוכרוז טיפול טבילה פתרון בינוני
- לחטא את הזרעים.
- להכין את הפתרון עיקור על-ידי הוספת µL 500 של 5% כלור פעיל פתרון NaClO µL 1 של 10% טריטון X-100 ל 500 µL במים סטריליים.
- מקום ca. 50 הטרנסגניים זרעים לבנה א נושא סמן פלורסנט כגון CT-GFP11 -GFP-TUB612 לתוך צינור 1.5-mL.
- להוסיף 1 מ"ל של 70% אתנול פתרון, לערבב היטב על ידי היפוך חמש פעמים. יוצאים 1 דקות.
- הזרעים ישקעו לתחתית הצינור. על ספסל נקי, בעדינות להסיר האתנול 70% שימוש של micropipette, וכן להוסיף 1 מ"ל של עיקור פתרון. מערבבים היטב בעזרת היפוך חמש פעמים ולהשאיר למשך 5 דקות.
- לשטוף את הזרעים. עדיין עובד בתנאים aseptic על ספסל נקי, בעדינות להסיר הפתרון באמצעות של micropipette, וכן להוסיף 1 מ"ל של מים סטריליים. חזור על שלב זה חמש פעמים.
- להוסיף 1.5 מ של סטיריליים 3% סוכרוז המכילה 1/2 Murashige-Skoog בינוני פתרון כל טוב של צלחת 24-טוב על ספסל נקי.
- להוסיף שני זרעים סטיריליים כל טוב. סרט הדבקה המכסה על צלחת 24-ובכן באמצעות שתי שכבות של מצלמות-מיקרוסקופים.
- להעביר את הצלחת. ובכן 24 סדרה קאמרית הצמיחה ב 23.5 ° C עם מחזור בהירה-כהה 12-h/12-ה באמצעות 100 µmol מ'−2 s− 1 לבן אור, תקופת דגירה של 14 ימים.
3. מיקרוסקופיים התבוננות הפיוניות באשכולות
- מקום 30 µL של 3% המכילים סוכרוז 1/2 Murashige-Skoog בינוני פתרון מהבאר של צלחת 24-ובכן במרכז זכוכית (גודל: 76 × 26 מ מ, עובי: 1.0-1.2 מ מ).
- להסיר cotyledon של שתיל בת 14 יום באמצעות מספריים ויבתר. לצוף על cotyledon עם הצד תצפית כלפי מעלה על המסירה פתרון.
- הכינו את הדגימה cotyledon על פי השיטה הקודמת שלנו13. בעיקרו של דבר, במקום 30 µL של הפתרון על המרכז של כיסוי זכוכית (גודל: 18 × 18 מ מ, עובי: 0.12-0.17 מ מ). הפוך את הזכוכית המכסה ומניחים אותו על cotyledon בעדינות. . תנגב את מאגר עודף באמצעות רקמה נטולת מוך.
- להגדיר טיפוס על הבמה של מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי ובחר באשכולות תאי המשמר להשגחה באמצעות תאורה שדה בהיר.
- לרכוש תמונות קונאפוקלית של מבנים תאיים fluorescently עם תוויות ברורות על פי הוראות היצרן מיקרוסקופ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. הנה, הוצגו הפרוטוקול עבור שיטה פשוטה של גרימת קיבוץ באשכולות stomatal המכילים סוכרוז פתרון בינוני ב לבנה א שתילים. תאי המשמר באשכולות גדלו ב פתרון בינוני המכילים סוכרוז (איור 1B) יש מהכלורופלסט גדול יותר מאשר תאי המשמר גדל בתנאי בקרה ללא סוכרוז (איור 1א'). ההגדלה של מהכלורופלסט אושר עם CT-GFP11, סמן משתית כלורופלסט, כלורופיל autofluorescence (איור 1C-F), טוען כי טיפול סוכרוז, גרמו עמילן חיטה ההצטברות מהכלורופלסט ויה סוכרוז פתרון ספיגת. בנוסף, התבוננות קונאפוקלית של GFP-TUB612 חשף כי microtubules קורטיקלית היו בכיוון רדיאלי אפילו שטופלו סוכרוז באשכולות משמר תאים, כמו אלה בתאי המשמר במרווחים בתנאי בקרה ללא סוכרוז (איור 2). מקרים אלה מצביעים על תאי המשמר באשכולות סוכרוז-induced שיש כיוון נורמלי microtubules קורטיקלית, תאית microfibrils כדי לאפשר פתיחה stomatal בתגובה רמזים סביבתיים9.
איור 1 : מהכלורופלסט בתאי המשמר באשכולות שטופלו המכילים סוכרוז פתרון בינונית. שדה בהיר (A, B), סמן משתית כלורופלסט CT-GFP (C, D)ותמונות כלורופיל autofluorescence (E, F) של תאי המשמר גדל בתנאי בקרה ללא סוכר תנאים (A, C, E) ו- 3% סוכרוז (B, D, F). גודל ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : Microtubules קורטיקלית בתאי המשמר באשכולות מטופלים עם סוכרוז פתרון. Microtubules קורטיקלית עם GFP-TUB6 של guard cells של שליטה ללא סוכר (א) ותאים שמירה באשכולות ב 3% סוכרוז תנאים (B). גודל ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הוצגו פרוטוקולים עבור אינדוקציה של הפיוניות באשכולות בשתילי לבנה א על ידי טיפול טבילה עם פתרון בינוני המכילים סוכרוז. כמוצג להלן, שיטה זו היא פשוטה מאוד ולא דורש שום מיומנות מיוחדת אבל יכול לגרום ביעילות הפיוניות באשכולות. יותר מ- 45% תאי המשמר מקובצים עם 3% סוכרוז המכילות בינוני פתרון (כלומר ערכים של יותר מ- 20 תצפיות עצמאיות)6. יתר על כן, מערכת ניסויית זו ניתן ישירות להחיל שורות הטרנסגניים או מוטציה כמוצג לקווים הטרנסגניים CT-GFP (איור 1) או GFP-TUB6 (איור 2). אמנם תמונות תמונה בלבד מוצגות כאן, זה יהיה גם ניתן לבצע תצפיות זמן רציפים במהלך הפיתוח stomatal.
שימו לב כי בשיטה זו מבוסס על טיפול exogeneous מלאכותיים, אז אנחנו לא יכולים להוציא את האפשרות כי תופעות שאינן קשורות ישירות להתפלגות stomatal נגרמות על ידי טיפול טבילה פתרון סוכרוז. למעשה, משמר הכלורופלסטים המורחב על ידי הטיפול (איור 1). ייתכן שהדבר נובע עמילן חיטה ההצטברות מהכלורופלסט דרך ספיגת סוכרוז-פתרון. בנוסף, צוהר קטן יותר stomatal נצפתה ב סוכרוז-induced תאי המשמר באשכולות9, רומז כי הלחץ בתיווך סוכרוז hyperosmotic דיכאו הפתיחה stomatal. למרות זאת, הכיוון רדיאלי של microtubules קורטיקלית נשמר (איור 2). בנוסף, הצמצם stomatal של תאי המשמר באשכולות מגביר באופן משמעותי בתגובה לטיפול fusicoccin, כמו במקרה של הפיוניות במרווחים9. לכן, למרות יהיה צורך לשפוט בזהירות אם מערכת דגם ניסיוני זו שימושית בהתאם למטרות מחקר שלך, המערכת שלנו יספק מידע חשובות בנוגע ליחסים בין התפלגות stomatal תגובה.
כאמור במבוא, סוכר פתרון טיפול עלול להקטין את שלמות התא, וכתוצאה מכך דליפה של ג'ין מפתח מוצרים עבור stomatal בידול (למשל גורמי שעתוק), התאים באפידרמיס. אנו מניחים כי סוכרוז-induced לוקליזציה חוץ רחמי של מוצרים אלה ג'ין גורמת הפיוניות באשכולות. עם זאת, השערה זו עבודה לא מספיק נתמך על ידי עדות ביולוגית מולקולרית. הקרנה של מוטציות סוכר-רגישות תהיה דרך מבטיח להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס סוכר פתרון-induced stomatal אשכולות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים על פרופסור Seiichiro Hasezawa בשל תמיכתו סוג העבודה שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן האגודה יפן KAKENHgrant של קידום המדע (JSPS) מספרים 17K 19380, 18 H. 05492, מקרן מענק לפרויקטים מחקר מדעי בסיסי Sumitomo להעניק מספר 160146, ואת קרן Canon תוצרת הארץ מערכת ניסויית זו פותחה תחת התמיכה הכספית של המספר JSPS KAKENHgrant 26891006 ק. א אנו מודים רובי לואיס, MSc, מקבוצת Edanz (www.edanzediting.com/ac) עבור עריכת טיוטה של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 - 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
- Bergmann, D. C., Sack, F. D.
- Pillitteri, L. J., Torii, K. U.
- Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
- Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).
- Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
- Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
- Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
- Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).
