Summary
このプロトコルの目的は葉緑体などの細胞内構造の観察の方法と糖含有培地溶液浸漬処理によるシロイヌナズナの幼植物の子葉におけるクラスター化された気孔を誘導する方法を示します、共焦点を使用してクラスター化されたガード細胞における微小管レーザー顕微鏡。
Abstract
気孔は光合成と蒸散のために不可欠である植物のガス交換を仲介します。気孔の開閉が大きく増加して行うし、それぞれガード細胞容積の減少します。イオンと水のシャトル輸送は気孔の中に細胞とより大きい隣接する表皮細胞の間発生するため気孔の間隔の分布は気孔の最適な配分と見なされます。気孔の間隔のパターンの摂動のための実験システムは間隔パターンの重要性を確認に便利です。間隔をあけられた気孔分布に関連付けられているいくつかの重要な遺伝子が同定されている、クラスター化された気孔を実験的これらの遺伝子を変えることによって誘起することができます。また、遺伝子組み換えなしの外因性の治療によってもクラスター化された気孔を誘起することができます。この記事でショ糖含有培地溶液浸漬処理によるシロイヌナズナの幼苗におけるクラスター化の気孔の単純な誘導システムについて述べる。本手法は簡単 transgenic または突然変異体の線には直接適用です。大きな葉緑体はショ糖によるクラスター化された細胞の細胞生物学的特徴として掲載されています。さらに、クラスター化された細胞の細胞内の観察の例として表層微小管の代表的な共焦点顕微鏡画像が表示されます。制御条件に間隔をあけられた細胞のようにクラスター化された細胞の表層微小管の半径方向の向きは維持されます。
Introduction
植物の気孔は光合成と蒸散、ガス交換のための不可欠な臓器とガード細胞イオン駆動型吸収と水のリリースで大幅に変更された気孔を達成しました。顕微鏡で葉や茎の表面に気孔の間隔分布を観察できます。この間隔をあけられた気孔分布細胞と隣接する表皮細胞1,2間イオンと水の交換によって調節される気孔のためと見なされます。クラスター化された気孔の実験的誘導システム、間隔をあけられた気孔分布の重要性を調査するため便利です。
それは、キー遺伝子細胞分化3,4や5化学化合物の治療のための遺伝子改変によって気孔の空間クラスター化を誘起することが報告されています。我々 はまた、ショ糖、ブドウ糖などの糖を添加した培地溶液で浸漬処理し、果糖は、シロイヌナズナ実生6の子葉における気孔クラスタ リングを引き起こしたことを報告しました。新しい細胞壁 meristemoids と表皮細胞の分離の減少カロースがショ糖溶浸漬処理が悪影響を及ぼす漏洩を防ぐ細胞壁に影響を与えることを示唆して、子葉のスクロース処理表皮で観察されたと異所性アクション ガード細胞分化 (転写因子など) に向かって隣接する主要遺伝子産物の表皮細胞の6。同様の機構は、 gsl8/チョー変異体7,8の研究から示唆されました。ショ糖含有培地溶液を使用してクラスター化された気孔の再現可能な誘導のための実験システムは非常に簡単で安いです。クラスター化されたガード細胞そのラベル細胞内構造を9,蛍光マーカーを表現するトランスジェニックは行に適用されるときの細胞骨格細胞小器官などの細胞内の構造を調査するも使用できます。10。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 3% ショ糖を含む 1/2 培地培中の溶液の調製
- 1.1 g 培地培培地塩とスクロースの 15 g をビーカーに追加します。
- 490 mL の蒸留水を加え、よく攪拌棒を使用して混ぜます。
- 島を使用して 5.8 に pH を調整します。
- 蒸留水 500 mL に希釈し、培地のボトルにソリューションを転送します。
- 滅菌オートクレーブ滅菌 (121 ° C、20 分) ソリューション。すぐに使用しない場合このソリューションは滅菌後 4 ° C で保存可能性があります。
2. 誘導によるショ糖を含むクラスター化された気孔の中規模ソリューション浸漬処理
- 種子を殺菌します。
- 5% 活性塩素 NaClO ソリューションを 500 μ l 添加し、10% の 1 μ L を追加することによって殺菌溶液を準備 500 μ L の滅菌水にトリトン X-100。
- 場所 50 形質転換シロイヌナズナ種子を 1.5 mL チューブに GFP TUB612 11 CT GFP などの蛍光マーカーを運ぶします。
- 5 回の反転でも 70% エタノール溶液 1 mL、ミックスを追加します。1 分のままにします。
- 種子は、管の底に沈みます。優しくクリーン ベンチ、マイクロ ピペットを使用して 70% エタノールを削除し、殺菌溶液の 1 mL を追加します。5 回の反転でよく混ぜるし、5 分おきます。
- 種を洗います。まだクリーン ベンチで無菌条件の下で働く、優しく、マイクロ ピペットを使用して、ソリューションを削除し、1 mL の滅菌水を追加します。5 回、この手順を繰り返します。
- クリーン ベンチに 24 ウェル プレートの各ウェルに滅菌 3% ショ糖を含む 1/2 培地培培地溶液 1.5 mL を追加します。
- 各ウェルに 2 つの滅菌の種子を追加します。パラフィルムの 2 つの層を使用して 24 ウェル プレートに蓋をテープします。
- 100 µmol m− 2の− 1白い光を使用して 12 時間、12 時間の明暗周期と 23.5 ° C で成長室セットに 24 ウェル プレートを転送し、14 日間インキュベートします。
3. クラスター化された気孔の観察
- 3% ショ糖を含む 1/2 培地培培地溶液スライド ガラスの中央に 24 ウェル プレートの井戸からの場所 30 μ L (サイズ: 76 × 26 mm、厚さ: 1.0 1.2 mm)。
- 解剖はさみを使って 14 日齢の幼苗の子葉を削除します。ソリューションのドロップで、観察の面にして、子葉をフロートします。
- 私たちの以前の方法13によると子葉片を準備します。基本的に、カバー ガラスの中心に 30 μ L のソリューションを配置 (サイズ: 18 × 18 mm, 厚さ: 0.12 0.17 mm)。カバーガラスを裏返し、軽く、子葉の上に置きます。糸くずのティッシュを使用して余分なバッファーをふき取りなさい。
- 共焦点レーザー顕微鏡のステージ上の標本、明視野照明を用いた観測のクラスター化された細胞が選択されます。
- 顕微鏡メーカーの指示に従って蛍光標識細胞内構造の共焦点画像を取得します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ここでは、シロイヌナズナの幼苗におけるショ糖を含む中規模ソリューションと気孔クラスタ リングを誘導する簡単な方法のためのプロトコルが提示されています。セル ガードをクラスター化ショ糖含有培地溶液 (図 1B) で栽培ショ糖無料制御条件 (図 1A) で育ったガード細胞よりも大きい葉緑体があります。葉緑体の肥大が確認された CT GFP11葉緑体のストロマ マーカー、クロロフィルの自家蛍光 (図 1C F)、スクロース処理がにおけるデンプン粒の蓄積で起因したことを示唆するいると、ショ糖ソリューション吸収を介して葉緑体。さらに、GFP TUB612の共焦点観察は、表層微小管がラジアルにもスクロース処理クラスター化ガード細胞、ショ糖無料制御条件 (図 2) で間隔をあけられた細胞のようなことを明らかにしました。クラスター化されたガードのスクロース誘導細胞が表層微小管とセルロースミクロフィブリル環境手がかり9への応答の気孔開口部を有効にするための通常の向きをあることが示唆されました。
図 1: ショ糖含有培地溶液とクラスター化細胞中の葉緑体が扱われます。明るいフィールド(A ・ B)、葉緑体ストロマ マーカー GFP CT (C, D)、シュガー フリー制御条件(A、C、E) 、3% ショ糖条件(B, D, F)で育ったガード細胞のクロロフィル蛍光(E, F)画像。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: クラスター化された細胞の表層微小管はショ糖溶液で処理します。シュガー フリー コントロール(A)で guard cells とショ糖 3% でクラスター化された細胞の GFP TUB6 付け表層微小管の条件(B)。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ショ糖含有培地溶液浸漬処理によるシロイヌナズナの幼苗におけるクラスター化された気孔の誘導のためのプロトコルを提案しました。下図のように、このメソッドは非常に簡単と専門的なスキルを必要としないが効率的にクラスター化された気孔を引き起こすことができます。3% スクロース含有細胞の 45% 以上が集まってメディア ソリューション (20 以上の独立した観測の平均値)6。また、CT GFP (図 1) または GFP TUB6 (図 2) を表現するトランスジェニックは行のようには、transgenic または突然変異体のラインに実験的なシステムを直接適用できます。スナップショット画像のみを示しますが、それはまた、気孔の発生中に時間の経時的観察を行うことが可能でしょう。
我々 はショ糖溶浸漬処理によって気孔分布に直接関連しない現象が引き起こされる可能性を排除できないので、このメソッドが人工外因治療に基づいていることに注意してください。実際には、細胞葉緑体は治療 (図 1) によって拡大されます。これはショ糖ソリューション吸収を介して葉緑体でデンプン粒の蓄積があります。さらより小さい気孔いたガード セルをクラスター化ショ糖負荷で9ショ糖を介した高浸透圧ストレスが気孔開口を抑制することを示唆している.それにもかかわらず、表層微小管の放射状の方向 (図 2) を維持しました。さらに、クラスター化されたガード細胞の気孔は大幅間隔気孔9の例のように、フシコクシン治療に応答して増加します。したがって、それはこの実験系が研究目的に応じて役に立つかどうかを慎重に判断する必要がありますが、体制は気孔分布と応答間の関係に関する洞察力に富んだ情報を提供します。
導入で述べたように、シュガー ソリューションの治療が隣接する表皮細胞への気孔分化 (転写因子など) の鍵遺伝子産物の漏出の結果、細胞壁の整合性を低下しました。我々 は、これらの遺伝子産物のショ糖誘起異所性局在がクラスター化された気孔を引き起こすことと仮定します。ただし、この作業仮説は分子生物学的証拠によって十分にサポートされていません。砂糖感受性変異株のスクリーニングには、砂糖ソリューションによる気孔クラスター分子メカニズムを明らかにする有望な方法となります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
教授誠一郎 Hasezawa を我々 の仕事の彼の親切なサポートに感謝しております。この作品は日本協会からの補助金によって支えられた科学振興 (JSPS) KAKENHgrant 番号 17 K 19380 と 18 H 05492、住友財団基礎科学研究助成「許可番号 160146、とキヤノン財団 t. h.日本学術振興会 KAKENHgrant 数 26891006 から k. a. の支援の下でこの実験システムを開発ロビー ・ ルイス、エダンズ ・ グループ (www.edanzediting.com/ac) の原稿の下書きを編集してから、MSc に感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Sumitomo Bakelite | MS-0824R | |
| 488 nm laser | Furukawa Denko | HPU-50101-PFS2 | |
| 488 nm laser | Olympus | Sapphire488-20/O | |
| 510 nm long-pass filter | Olympus | BA510IF | |
| 524 - 546 nm band-pass filter | Semrock | FF01-535/22-25 | |
| 530 nm short-pass filter | Olympus | BA530RIF | |
| 561 nm laser | CVI Melles Griot | 85-YCA-025-040 | |
| 604 - 644 nm band-pass filter | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Confocal laser scanning head | Yokogawa | CSU10 | |
| Confocal laser scanning head | Olympus | FV300 | |
| Cooled CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image acquisition software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.8.2.0 | |
| Image acquisition software | Olympus | FLUOVIEW v5.0 | |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Type-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-71 | |
| Murashige and Skoog Plant Salt Mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 392-00591 | Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497. |
| Objective lens | Olympus | UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35 | NA = 1.35 |
| Objective lens | Olympus | UPlanAPO 40x / 0.85 NA | NA = 0.85 |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
References
- Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
- Bergmann, D. C., Sack, F. D.
- Pillitteri, L. J., Torii, K. U.
- Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
- Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
- Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).
- Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
- Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
- Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
- Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).
